CN113005080B - 一种脂类化合物组合在t细胞培养中的应用 - Google Patents

一种脂类化合物组合在t细胞培养中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种脂类化合物组合在T细胞培养中的应用。所述脂类化合物组合包含α‑生育酚醋酸，肉豆蔻酸，花生四烯酸，胆固醇，亚油酸，油酸，棕榈酸，硬脂肪酸，亚麻酸和棕榈油酸中的任意两种或两种以上脂类化合物。将其以不同比例添加到T细胞培养基中，可以任意调节扩增终点的T细胞群体中CD4和CD8亚群比例，满足科研或临床应用的需求，而且该脂类化合物组合化学成份明确，为细胞培养过程中的常见营养物质，安全无害，无人源和动物源性成分，符合临床应用要求。本发明提供的方法具有很高的临床应用价值。

Description

一种脂类化合物组合在T细胞培养中的应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体地说，涉及一种脂类化合物组合在T细胞培养中的应用。
背景技术
T细胞是淋巴细胞的主要组分之一，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助其它淋巴细胞发挥功能，对特异性抗原或促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子，是身体抵御疾病感染、防止肿瘤形成的主要免疫细胞之一。在体外富集、活化、扩增这类免疫细胞，可用于回输治疗多种疾病，包括恶性肿瘤、感染、自身免疫病等。
T细胞根据表面分子标志物的不同，又可分为CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞。其中，CD4阳性T细胞约占T细胞总数的65％-70％，CD8阳性T细胞约占T细胞总数的30％-35％。CD4阳性T细胞又称为辅助性T细胞，它可以增殖并分泌细胞因子来激活其它类型的产生直接免疫反应的免疫细胞(如CD8阳性T细胞)；CD8阳性T细胞又称为细胞毒T细胞，其功能就像一个“杀手”或细胞毒素，可以对产生特殊抗原反应的目标细胞直接进行杀灭。
在T细胞过继免疫治疗中，已有证据表明CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞这两种细胞亚群在增殖、体内的持续性和在体外扩增后再过继回输的抗肿瘤效果方面均有所不同。临床前研究表明，通过固定CD4+/CD8+T细胞的比例配方形成的T细胞治疗细胞产品，比其中任一亚群或者不考虑亚群组成的T细胞产品效果更强。
现有技术的T细胞培养方法大多不考虑培养终点的T细胞群体中的CD4和CD8亚群的比例，或倾向于维持初始T细胞群体中的CD4和CD8亚群比例。
专利文献CN108441473A，公开日20180824，公开了一种体外培养T细胞的方法，该方法可以提高CD8+T细胞:CD4+T细胞比率并且/或者提高细胞含量。该方法包括获得外周血淋巴细胞(PBMC)细胞、对分离的PBMC进行分选以获得富含CD4+T细胞和CD8+T细胞的T细胞悬液、以及对分选后的T细胞悬液进行培养的步骤，其中在培养步骤中添加IL-2，优选还添加IL-7。
然而，探索更多的可调整培养的T细胞群体中CD4和CD8亚群比例的方法仍然是十分必要的。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种脂类化合物组合在T细胞培养中的应用，以调整培养的T细胞群体中CD4和CD8亚群的比例。
本发明再一的目的是，提供一种脂类化合物组合溶液。
本发明另一的目的是，提供一种T细胞培养中调节扩增终点的T细胞群体中CD4和CD8亚群比例的方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种脂类化合物组合在T细胞培养时调节扩增终点的T细胞群体中CD4和CD8亚群比例的用途，所述脂类化合物组合包含α-生育酚醋酸，肉豆蔻酸，花生四烯酸，胆固醇，亚油酸，油酸，棕榈酸，硬脂肪酸，亚麻酸和棕榈油酸中的任意两种或两种以上脂类化合物。
作为本发明的一种优选实施方案，所述脂类化合物组合包含α-生育酚醋酸，肉豆蔻酸，花生四烯酸，胆固醇，亚油酸，油酸，棕榈酸，硬脂肪酸，亚麻酸和棕榈油酸中的任意八种或八种以上化合物。
作为本发明的另一种优选实施方案，所述脂类化合物组合中，各脂类化合物的质量相等。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种脂类化合物组合溶液，所述脂类化合物组合溶液的溶质为如上任一所述的脂类化合物组合。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种T细胞培养中调节扩增终点的T细胞群体中CD4和CD8亚群比例的方法，在培养基中添加如上所述的脂类化合物组合溶液。
作为本发明的一种优选实施方案，所述脂类化合物组合溶液中各脂类化合物的浓度为0.0001-10g/L。
作为其中的一个优选例，所述脂类化合物组合溶液中各脂类化合物的浓度为0.001-1g/L。
作为本发明的另一种优选实施方案，所述方法包括以下步骤：
1)使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC用于T细胞的激活扩增；
2)将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，每孔培养基体积为2ml，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2，并放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养；上述培养体系中，使用的培养基为添加了脂类化合物组合溶液的T细胞无血清培养基，所述脂类化合物组合溶液中各脂类化合物浓度均为0.0001-10g/L；
3)将上述脂类化合物溶液按不同浓度添加至T细胞培养基中，使得培养终点的T细胞群体中具有不同比例的CD4和CD8亚群。
作为其中的一个优选例，培养体系中，所述脂类化合物组合溶液与T细胞无血清培养基的比例是1:(10-5000)。
更优选地，培养体系中，所述脂类化合物组合溶液与T细胞无血清培养基的比例是1:10，1:20，1:50，1:100，1:200，1:500，1:1000，1:2000或1:5000。
作为其中的另一个优选例，所述T细胞无血清培养基为X-Vivo-15或OpTmizer。
作为其中的另一个优选例，培养第6天，离心收集细胞，并进行对细胞表现标志物CD4和CD8进行流式细胞仪检测。本发明优点在于：
1、本发明提供了一种通过在T细胞培养过程中添加一种脂类化合物组合以任意调节CD4和CD8亚群比例的方法，可以任意调节扩增终点的T细胞群体中CD4和CD8亚群比例，获得的T细胞群体中CD4和CD8亚群比例与所添加的该脂类化合物的浓度相关，因而可根据需求任意改变，使这一比例满足科研或临床应用的需求；
2、该化合物组合化学成份明确，为细胞培养过程中的常见营养物质，安全无害，无动物源性成分，符合临床应用要求。
3、在T细胞过继免疫治疗中，最终回输给病人的T细胞群体中CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞的比例与其临床治疗效果密切相关，因而本发明提供的方法具有很高的临床应用价值。
附图说明
图1：对应实施例1，为本发明所述培养方法扩增T细胞后终末群体中CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞所占比例。数据为流式检测的结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
以下实施例中材料来源为：
X-Vivo-15(Lonza，货号BE02-060F)培养基、OpTmizer(ThermoFisher，货号A1048501)培养基。
CD3抗体(Biolegend，货号317325)、CD28抗体(Biolegend，货号302933)、IL2(Peprotech，货号200-02)。
肉豆蔻酸(Sigma，货号41788)，花生四烯酸(Sigma，货号10931)，胆固醇(Sigma，货号C3045)，亚油酸(Sigma，货号39269)，油酸(Sigma，O1383)，棕榈酸(Sigma，货号P0500)，硬脂肪酸(Sigma，货号1621008)，亚麻酸(Sigma，货号L2376)。
脂类化合物组合溶液的配制方法为：
1、将0.001-0.1g上述8种脂类化合物分别溶于1ml无水乙醇，配制为终浓度1-100g/L的溶液；
2、将1)中所述方法配制的8种脂类化合物的乙醇溶液用无菌水进行1000倍稀释，配制为终浓度0.001-0.1g/L的溶液；
3、将2)中所述方法配制的8种脂类化合物溶液按等比例混合，获得本发明所述的脂类化合物组合溶液。
实施例中其他所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例1 人外周血单核细胞(PBMC)中CD4阳性和CD8阳性T细胞不同比例的扩增(一)
本实施例中，使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC，用于T细胞的激活扩增。将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，接种密度1x106/ml，使用添加了脂类化合物组合溶液的X-Vivo-15(Lonza)培养基2mL/孔，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2，并放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养。
其中，脂类化合物组合溶液的溶质为以下8种脂类：肉豆蔻酸，花生四烯酸，胆固醇，亚油酸，油酸，棕榈酸，硬脂肪酸，亚麻酸；其浓度均为0.00125g/L。
实验共设4个条件，各个条件中脂类化合物组合溶液的添加比例(体积比)如下：1:100，1:200，1:500，1:1000。
培养第6天，离心收集细胞，并对细胞表现标志物CD4和CD8进行流式细胞仪检测。如图1，结果显示当脂类化合物组合溶液的添加比例分别为1:100，1:200，1:500，1:1000时，对应的CD4:CD8比例分别为20％:75％、45％:45％、65％:30％和75％:20％。证明可通过改变脂类化合物组合溶液的添加比例实现对CD4和CD8亚群占比的调节。
实施例2 人外周血单核细胞(PBMC)中CD4阳性和CD8阳性T细胞不同比例的扩增(二)
本实施例中，使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC，用于T细胞的激活扩增。将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，接种密度1x106/ml，使用添加了脂类化合物组合溶液的OpTmizer(ThermoFisher)培养基2mL/孔，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2，并放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养。
其中，脂类化合物组合溶液的溶质为以下2种脂类：肉豆蔻酸，花生四烯酸；其浓度均为0.00125g/L。
实验共设4个条件，各个条件中脂类化合物组合溶液的添加比例(体积比)如下：1:100，1:200，1:500，1:1000。
培养第6天，离心收集细胞，并对细胞表现标志物CD4和CD8进行流式细胞仪检测。
实施例3 人外周血单核细胞(PBMC)中CD4阳性和CD8阳性T细胞不同比例的扩增(三)
本实施例中，使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC，用于T细胞的激活扩增。将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，接种密度1x106/ml，使用添加了脂类化合物组合溶液的X-Vivo-15(Lonza)培养基2mL/孔，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2，并放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养。
其中，脂类化合物组合溶液的溶质为以下4种脂类：油酸，棕榈酸，硬脂肪酸，亚麻酸；其浓度均为0.0001g/L。
实验共设9个条件，各个条件中脂类化合物组合溶液的添加比例(体积比)如下：1:10，1:20，1:50，1:100，1:200，1:500，1:1000，1:2000，1:5000。
培养第6天，离心收集细胞，并对细胞表现标志物CD4和CD8进行流式细胞仪检测。
实施例4 人外周血单核细胞(PBMC)中CD4阳性和CD8阳性T细胞不同比例的扩增(四)
本实施例中，使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC，用于T细胞的激活扩增。将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，接种密度1x106/ml，使用添加了脂类化合物组合溶液的X-Vivo-15(Lonza)培养基2mL/孔，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2，并放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养。
其中，脂类化合物组合溶液的溶质为以下8种脂类：肉豆蔻酸，花生四烯酸，胆固醇，亚油酸，油酸，棕榈酸，硬脂肪酸，亚麻酸；其浓度均为10g/L。
实验共设9个条件，各个条件中脂类化合物组合溶液的添加比例(体积比)如下：1:10，1:20，1:50，1:100，1:200，1:500，1:1000，1:2000，1:5000。
培养第6天，离心收集细胞，并对细胞表现标志物CD4和CD8进行流式细胞仪检测。
实施例5 人外周血单核细胞(PBMC)中CD4阳性和CD8阳性T细胞不同比例的扩增(五)
本实施例中，使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC，用于T细胞的激活扩增。将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，接种密度1x106/ml，使用添加了脂类化合物组合溶液的X-Vivo-15(Lonza)培养基2mL/孔，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2，并放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养。
其中，脂类化合物组合溶液的溶质为以下10种脂类：α-生育酚醋酸，肉豆蔻酸，花生四烯酸，胆固醇，亚油酸，油酸，棕榈酸，硬脂肪酸，亚麻酸，棕榈油酸；其浓度均为0.001g/L。
实验共设9个条件，各个条件中脂类化合物组合溶液的添加比例(体积比)如下：1:10，1:20，1:50，1:100，1:200，1:500，1:1000，1:2000，1:5000。
培养第6天，离心收集细胞，并对细胞表现标志物CD4和CD8进行流式细胞仪检测。
实施例6 人外周血单核细胞(PBMC)中CD4阳性和CD8阳性T细胞不同比例的扩增(六)
本实施例中，使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC，用于T细胞的激活扩增。将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，接种密度1x106/ml，使用添加了脂类化合物组合溶液的X-Vivo-15(Lonza)培养基2mL/孔，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2，并放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养。
其中，脂类化合物组合溶液的溶质为以下6种脂类：肉豆蔻酸，花生四烯酸，胆固醇，亚油酸，油酸，棕榈酸；其浓度均为1g/L。
实验共设9个条件，各个条件中脂类化合物组合溶液的添加比例(体积比)如下：1:10，1:20，1:50，1:100，1:200，1:500，1:1000，1:2000，1:5000。
培养第6天，离心收集细胞，并对细胞表现标志物CD4和CD8进行流式细胞仪检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种脂类化合物组合在T细胞培养时调节扩增终点的T细胞群体中CD4和CD8亚群比例的用途，所述脂类化合物组合包含α-生育酚醋酸，肉豆蔻酸，花生四烯酸，胆固醇，亚油酸，油酸，棕榈酸，硬脂肪酸，亚麻酸和棕榈油酸中的任意八种或八种以上化合物，其特征在于，所述脂类化合物组合中，各脂类化合物的质量相等，其浓度均为浓度0.00125g/L；所述细胞培养时共设4个条件，各个条件中脂类化合物组合溶液的添加比例体积比如下：1:100，1:200，1:500，1:1000。
2.一种T细胞培养中调节扩增终点的T细胞群体中CD4和CD8亚群比例的方法，其特征在于，在培养基中添加权利要求1所述的脂类化合物组合溶液，其浓度均为浓度0.00125g/L；所述细胞培养时共设4个条件，各个条件中脂类化合物组合溶液的添加比例体积比如下：1:100，1:200，1:500，1:1000。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脂类化合物组合溶液中各脂类化合物的浓度为0.0001-10g/L。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC用于T细胞的激活扩增；
2）将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，每孔培养基体积为2ml，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度 100IU/mL的IL2，并放入37℃，5% 二氧化碳培养箱内继续培养；上述培养体系中，使用的培养基为添加了脂类化合物组合溶液的T细胞无血清培养基，所述脂类化合物组合溶液中各脂类化合物浓度均为0.0001-10g/L；
3）将上述脂类化合物溶液按不同浓度添加至T细胞培养基中，使得培养终点的T细胞群体中具有不同比例的CD4和CD8亚群。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，培养体系中，所述脂类化合物组合溶液与T细胞无血清培养基的比例是1:10，1:20，1:50，1:100，1:200，1:500，1:1000，1:2000或1:5000。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述T细胞无血清培养基为X-Vivo-15或OpTmizer。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，培养第6天，离心收集细胞，并进行对细胞表现标志物CD4和CD8进行流式细胞仪检测。
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