CN117736988B - 用于诱导Tscm细胞的培养基、培养方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于诱导Tscm细胞的培养基、培养方法及其应用，涉及细胞培养技术领域，该培养基包括：500～1500U/mL IL‑2、1～100ng/mL IL‑15、1～100μM TWS119、0.5～5μM汉黄芩素、0.5～5μM金丝桃苷、1～20μM阿魏酸和1～10％自体血浆。在此基础上，本发明还提供同时诱导Tscm细胞和iNKT细胞的培养基，能够提高Tscm的转化效率，实现同时诱导Tscm细胞和iNKT细胞的培养基，提高细胞的分化效率。此外，经本发明同时诱导Tscm细胞和iNKT细胞培养基及其培养方法得到的混合细胞能够在无激动剂和靶细胞刺激的情况下即可分泌高水平的细胞因子。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种用于诱导Tscm细胞的培养基、培养方法及其应用。
背景技术
干细胞样记忆T细胞(stem cell-like memory T cells，Tscm)是一群具有自我更新、在体内能长期生存以及分化为不同亚群的干细样T细胞。Tscm细胞具有高表达CD62L、CCR7、CD122、IL-7Rα、Sca-1、Bcl-2等分子，低表达CD44、CD25、CD69、CD127等分子的表型特征。Tscm细胞在抗原刺激后可以迅速扩增并分化为效应T细胞(TEFF)、中央记忆T细胞(TCM)和效应记忆T细胞(TEM)，从而产生强烈的免疫效应。Tscm细胞在抗原再次刺激时可以快速扩增并分化为不同效应亚群并形成记忆免疫。Tscm细胞因其具有高效的免疫应答和持久的免疫记忆的能力，被认为是细胞免疫治疗、疫苗接种和抗衰老的关键免疫效应细胞。
然而，由于正常人体内的Tscm细胞极为稀少，这成为其临床转化应用的绊脚石。目前已有多种方法用于诱导和扩增Tscm细胞，包括使用特定的细胞因子、小分子药物、基因编辑等。这些方法可以提高Tscm细胞的数量和质量，增强其抗肿瘤和抗感染的能力，为细胞免疫治疗提供更多的选择和可能。因此，需要一种能够有效扩增Tscm细胞的方式，提高其培养效率，保持其表型和功能的稳定，为细胞免疫的临床应用提供更多的选择和可能。
发明内容
本发明提供一种用于诱导Tscm细胞的培养基、培养方法及其应用，用以解决现有技术诱导Tscm细胞效率低、难度大等问题。
作为本发明的第一方面，本发明提供一种用于诱导Tscm细胞的培养基，包括：500～1500U/mL IL-2、1～100ng/mL IL-15、1～100μM TWS119、0.5～5μM汉黄芩素、0.5～5μM金丝桃苷、1～20μM阿魏酸和1～10％自体血浆。
根据本发明提供的一种用于诱导Tscm细胞的培养基，所述培养基包括：
700U/mL IL-2、5ng/mL IL-15、20μM TWS119、1μM汉黄芩素、1μM金丝桃苷、5μM阿魏酸，和10％自体血浆。
作为本发明的第二方面，本发明还提供一种用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞的培养基，所述培养基包括：
500～1500U/mL IL-2、1～100ng/mL IL-15、10～1000ng/mLα-GalCer、10～1000ng/mL 7DW8-5、1～100μM TWS119、10～1000ng/mL GM-CSF、1～100ng/mL IL-4、10～1000U/mL TNF-α、1～100ng/mL LPS、0.5～5μM汉黄芩素、0.5～5μM金丝桃苷、1～20μM阿魏酸、1～10％自体血浆。
作为本发明用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞的培养基的优选方案，所述培养基包括：700U/mL IL-2、5ng/mL IL-15、50ng/mLα-GalCer、50ng/mL 7DW8-5、20μM TWS119、50ng/mL GM-CSF、10ng/mL IL-4、100U/mL TNF-α、20ng/mL LPS、1μM汉黄芩素、1μM金丝桃苷、5μM阿魏酸、10％自体血浆。
本发明的用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞的培养基，能同时扩增Tscm细胞及iNKT细胞，经此培养基体系后，培养的到的C1型和C2型iNKT细胞在CD3+T细胞中的占比分别为12.0％和17.5％；得到的干细胞样记忆CD8+T细胞在CD8+T细胞中的占比为55.3％。此培养基能在有效扩增Tscm细胞，在此基础上还能同时诱导扩增iNKT细胞，且此培养基体系其能促进IFN-γ分泌，经此培养基体系培养在得到的混合细胞(iNKT细胞和Tscm细胞)在无激动剂和靶细胞刺激的情况下即可分泌高水平的IFN-γ，能够达到486.76pg/mL。
作为本发明的第三方面请求保护上述方案中用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞的培养基在同时培养诱导Tscm细胞及iNKT细胞的应用。
本发明的第四方面，本发明还提供一种用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞的培养方法，所述方法包括：
获取待处理细胞；
根据预设的培养时长，基于上述第二方面所指出任意一种用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞的培养基，培养所述待处理细胞；
收集培养后的所述待处理细胞备用。
根据本发明提供的一种用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞的培养方法，所述待处理细胞的接种密度为5×106个/mL。
根据本发明提供的一种用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞的培养方法，所述待处理细胞为PBMC，所述培养时长为14天。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括如上所述任意第一方面所指出的用于诱导Tscm细胞的培养基，所述试剂盒用于诱导Tscm细胞的培养或/和外泌体制备。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括如第二方面所指出的用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞中任意一项培养基，所述试剂盒用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞的培养或/和外泌体制备。
本发明提供的一种用于诱导Tscm细胞的培养基、培养方法及其应用，该培养基包括：500～1500U/mL IL-2、1～100ng/mL IL-15、1～100μM TWS119、0.5～5μM汉黄芩素、0.5～5μM金丝桃苷、1～20μM阿魏酸和1～10％自体血浆。
在此基础上还提供一种能够实现同时诱导Tscm细胞和iNKT细胞的培养基，经过本发明提供的培养基，可获得大量的Tscm细胞，若共同诱导，则可产生在CD3+T细胞中的占比近30％的iNKT细胞，在CD8+T细胞中的占比12％的Tscm细胞。此外，还能够促进以IFN-γ为代表的细胞因子的高水平分泌，为细胞诱导培养、外泌体制备等方面提供了有效手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的对实验组1培养14天过程中细胞图像；
图2是本发明提供的实验组1培养14天后流式分析图；
图3是本发明提供的实验组2培养14天后流式分析图。
图4是本发明提供的实验组1和实验组2细胞因子检测结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种用于诱导Tscm细胞的培养基，包括500～1500U/mL IL-2、1～100ng/mL IL-15、1～100μM TWS119、0.5～5μM汉黄芩素、0.5～5μM金丝桃苷、1～20μM阿魏酸和1～10％自体血浆。
IL-2可以激活和扩增T细胞，IL-15则能够增强Tscm的存活和增殖。TWS119能够诱导Tscm细胞分化；研究员前期研究发现汉黄芩素、金丝桃苷、阿魏酸可促进iNKT细胞的增值和IFN-γ的分泌，从而促进对Tscm细胞的诱导，自体血浆用于提供营养成分。
恒定型自然杀伤T细胞(invariant natural killer T cell，iNKT细胞)是一种固有样T淋巴细胞，具有快速响应感染和肿瘤的能力。iNKT细胞通过识别由CD1d分子递呈的脂类抗原而被激活，进而分泌多种细胞因子(如IFN-γ、IL-4、IL-17等)和趋化因子，介导固有免疫和获得性免疫应答。iNKT细胞不仅可以直接杀伤靶细胞，还可以调节其他免疫细胞的功能，如树突状细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞和T细胞等。iNKT细胞在感染、肿瘤、自身免疫性疾病、过敏反应等多种病理过程中发挥重要作用。
目前尚未存在iNKT细胞和Tscm细胞同时扩增培养的方法，获取iNKT细胞和Tscm细胞主要依赖于分别培养，效率较低，成本较高，且存在细胞表型和功能的变化和损失的风险。本发明还提供一种用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞的培养基，其在用于诱导Tscm细胞的培养基基础上增加其他因子，实现同时对iNKT细胞和Tscm细胞的共同诱导培养。
能同时对iNKT细胞和Tscm细胞的共同诱导培养的培养基包括500～1500U/mL IL-2、1～100ng/mL IL-15、10～1000ng/mLα-GalCer、10～1000ng/mL 7DW8-5、1～100μMTWS119、10～1000ng/mL GM-CSF、1～100ng/mL IL-4、10～1000U/mL TNF-α、1～100ng/mLLPS、0.5～5μM汉黄芩素、0.5～5μM金丝桃苷、1～20μM阿魏酸、1～10％自体血浆。
GM-CSF和IL-4可诱导DC细胞的增值；TNF-α和LPS可诱导DC细胞的成熟；α-GalCer和7DW8-5(α-GalCer的衍生物)为一种脂类抗原，可结合DC细胞表明表达的CD1d分子。α-GalCer和7DW8-5可激活iNKT细胞，即，将α-GalCer和7DW8-5荷载到DC细胞的CD1d分子上，再由DC细胞呈递给iNKT细胞，诱导iNKT细胞的增值和活化；IL-2、IL-15可促进iNKT细胞增值和活化。
除了上述因子外，基础培养基可选择用于免疫细胞增殖和/或控制的成分确定的无血清培养基，如AIM-V培养基。在基础培养基上添加上述因子，配置成可实现同时诱导扩增Tscm细胞及iNKT细胞的培养基。
设置不同的α-GalCer使用浓度，控制单一变量，验证不同浓度α-GalCer处理对培养14天获得的总细胞(包括iNKT细胞和Tscm细胞)存活的影响，结果如下表表1所示：
表1：α-GalCer浓度对总细胞存活率影响
| 浓度(ng/mL) | 培养14天获得的总细胞 |
| 0 | 84.75±1.42 |
| 10 | 89.38±0.82 |
| 50 | 97.36±1.17 |
| 100 | 92.32±1.01 |
| 1000 | 90.24±1.00 |
根据上表，在保证其他成分不变的前提下，不同浓度的α-GalCer对总细胞存活率产生不同影响，10～1000ng/mL范围内α-GalCer的加入能提高总细胞的存活率，其中α-GalCer的浓度为50ng/mL能有效提高总细胞的存活率，具有较优效果。
此外，还设置不同的7DW8-5使用浓度，控制单一变量，验证不同浓度7DW8-5处理对培养14天获得的总细胞(包括iNKT细胞和Tscm细胞)存活的影响结果如下表表2所示：
表2：7DW8-5浓度对总细胞存活率影响
| 浓度(ng/mL) | 培养14天获得的总细胞 |
| 0 | 86.07±1.27 |
| 10 | 93.28±0.72 |
| 50 | 96.25±1.00 |
| 100 | 94.53±0.70 |
| 1000 | 91.57±1.95 |
根据上表，在保证其他成分不变的前提下，在10～1000ng/mL浓度范围内，7DW8-5能够明显促进总细胞的存活情况，且浓度在50g/mL具有较优效果。
设置不同的TWS119使用浓度，控制单一变量，验证不同浓度TWS119处理对培养14天获得的总细胞(包括iNKT细胞和Tscm细胞)存活的影响(培养步骤及其他条件同实施例1)，结果如下表表3所示：
表3：TWS119浓度对总细胞存活率影响
| 浓度(μM) | 培养14天获得的总细胞 |
| 0 | 84.70±0.91 |
| 20 | 97.25±1.00 |
| 40 | 94.11±1.00 |
| 80 | 93.18±1.93 |
| 100 | 90.50±1.46 |
根据上表，在保证其他成分不变的前提下，1～100μM范围内的TWS119都能提高培养14天后总细胞存活率，且在20μM时培养14天获得的总细胞存活率在97％左右，具有较优效果。
进一步地，为提高诱导效果，本实施例中，可单独诱导Tscm细胞的培养基采用的成分浓度为700U/mL IL-2、5ng/mL IL-15、20μM TWS119、1μM汉黄芩素、1μM金丝桃苷、5μM阿魏酸，和10％自体血浆。在可同时诱导iNKT细胞和Tscm细胞的培养基中，成分为700U/mL IL-2、5ng/mL IL-15、50ng/mLα-GalCer、50ng/mL 7DW8-5、20μM TWS119、50ng/mL GM-CSF、10ng/mL IL-4、100U/mL TNF-α、20ng/mL LPS、1μM汉黄芩素、1μM金丝桃苷、5μM阿魏酸、10％自体血浆。
为提高上述的培养基的效率，使培养基对iNKT细胞和Tscm细胞的诱导增殖效果发挥最大，本发明还提供一种用于诱导Tscm细胞的培养方法。该方法包括：
S10、获取待处理细胞。
首先获取待处理细胞，待处理细胞是指具有分化为Tscm细胞能力的细胞或细胞群，例如PBMC(peripheral blood mononuclear cell，外周血单个核细胞)。以PBMC为例，可使用Ficoll法(密度梯度离心法)从外周血中提取PBMC。PBMC也具有分化iNKT细胞的能力。
S20、根据预设的培养时长，基于上述培养基，培养所述待处理细胞。
具体的，培养时长是指对待处理细胞培养的时间，在培养过程中，待处理细胞会被诱导分化Tscm细胞，本实施例优选的培养时长为14天。
细胞密度影响培养基对细胞生长的支持和后续分化增殖的效率。本实施例选用的细胞密度为5×106个/mL。
以PBMC为待处理细胞为例,为使用经37℃预热的上述培养基重悬PBMC细胞，并接种于6孔板中，接种细胞浓度为5×106个/mL，2mL/孔。后置于二氧化碳培养箱内继续培养14天，每2～3天更换一次新鲜培养基。
S30、收集培养后的所述待处理细胞备用。
具体的，培养结束后，收集培养后的细胞备用，可通过流式分选、磁珠分选等方式从细胞群中分选出自己所需要的细胞。
进一步地，本实施例分别采用两组培养基进行细胞培养。
实验组1采用上述可单独诱导Tscm细胞的培养基，即，实验组1组分为：700U/mLIL-2、5ng/mL IL-15、20μM TWS119、1μM汉黄芩素、1μM金丝桃苷、5μM阿魏酸，和10％自体血浆。
实验组2采用上述可同时诱导iNKT细胞和Tscm细胞的培养基。即，实验组2组分为：700U/mL IL-2、5ng/mL IL-15、50ng/mLα-GalCer、50ng/mL 7DW8-5、20μM TWS119、50ng/mLGM-CSF、10ng/mL IL-4、100U/mL TNF-α、20ng/mL LPS、1μM汉黄芩素、1μM金丝桃苷、5μM阿魏酸、10％自体血浆。
其中，实验组2培养结果如图1所示，结果表明，实验组2中细胞生长旺盛且状态良好。
实验1
对两组培养基培养收集后的细胞进行PBMC和总细胞存活率检测，AO/PI染色，采用细胞计数仪进行细胞计数，计算出细胞存活率，结果如下表表4所示：
表4：实验组总细胞存活率
| 组别 | PBMC | 培养14天获得的总细胞 |
| 实验组1 | 98.88±0.32 | 94.16±1.10 |
| 实验组2 | 98.88±0.32 | 96.58±1.16 |
实验2
实验2为流式细胞检测，对收集到的总细胞进行C1型和C2型iNKT细胞及Tscm细胞占比检测。其中，C1型采用的标签为CD3+CXCR6+CD244-，C2型采用的标签为CD3+CXCR6+CD244+，Tscm细胞采用的标签为CD3+CD8+CD45RO-CD62L+。所用抗体包括PerCP-Cy5.5-CD3抗体、FITC-CD244抗体、APC-CXCR6抗体、Brilliant Violet 421-CD45RO抗体、Alexa 700-CD62L抗体。
如图2所示，图2是本发明提供的实验组1培养14天后流式分析图，实验组1单独诱导Tscm细胞(CD8+)，在CD8+T细胞中的占比达到12.2％。
进一步地，如图3所示，图3是本发明提供的实验组2培养14天后流式分析图，对实验组2进行流式细胞分析，CD3+细胞(CD3-PerCP-5.5标签)中12％为C1型iNKT细胞，17.5％为C2型iNKT细胞。而在CD8+细胞(CD244-FITC标签和CD3-PerCP-5.5标签)中，55.3％的细胞为Tscm细胞。
故本实施例无论是单独诱导Tscm细胞，还是共同诱导iNKT细胞和Tscm细胞，都取得较佳效果，且共同诱导的效果远高于单独诱导。
实验3
在实验3中，检测实验组1和实验组2分泌细胞因子的状况。如图4所示，在实验组1中，其IFN-γ分泌水平也高达91.46pg/mL。而在实验组2中，经共同诱导得到的iNKT细胞和Tscm细胞在无靶细胞刺激的情况下即可分泌高达486.76pg/mL的IFN-γ，远高于现有技术的水平。故实验组2不仅能够实现iNKT细胞和Tscm细胞的共同诱导培养，还能够实现以IFN-γ为代表的细胞因子高水平释放，为后续应用带来无限潜力。
本发明还请求保护上述实验组2相应组分在同时诱导Tscm细胞、iNKT细胞的培养液应用，该培养基能够高效扩增Tscm细胞的数量同时诱导扩增iNKT细胞，其应用可以为对应的试剂盒、外泌体等。
本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括如上所述的培养基，该试剂盒能够应用Tscm细胞细胞培养、外泌体制备等方面，通过培养基，能够高效扩增Tscm细胞的数量，甚至能够同时诱导扩增iNKT细胞，基于此外泌体中富含以IFN-γ因子为代表的细胞因子，提高细胞因子的产量。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种用于诱导Tscm细胞的培养基，其特征在于，由500～1500 U/mL IL-2、1～100ng/mL IL-15、1～100 μM TWS119、0.5～5 μM汉黄芩素、0.5～5 μM金丝桃苷、1～20 μM阿魏酸以及1～10%自体血浆组成。
2.根据权利要求1所述的用于诱导Tscm细胞的培养基，其特征在于，所述培养基由700U/mL IL-2、5 ng/mL IL-15、20μM TWS119、1μM汉黄芩素、1 μM金丝桃苷、5 μM阿魏酸以及10%自体血浆组成。
3.一种用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞的培养基，其特征在于，所述培养基由
500～1500 U/mL IL-2、1～100 ng/mL IL-15、10～1000 ng/mL α-GalCer、10～1000ng/mL 7DW8-5、1～100 μM TWS119、10～1000 ng/mL GM-CSF、1～100 ng/mL IL-4、10～1000 U/mL TNF-α、1～100 ng/mL LPS、0.5～5 μM汉黄芩素、0.5～5 μM金丝桃苷、1～20 μM阿魏酸、1～10%自体血浆组成。
4.根据权利要求3所述的用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞的培养基，其特征在于，所述培养基由700 U/mL IL-2、5 ng/mL IL-15、50 ng/mL α-GalCer、50 ng/mL 7DW8-5、20μMTWS119、50 ng/mL GM-CSF、10 ng/mL IL-4、100 U/mL TNF-α、20 ng/mL LPS、1 μM汉黄芩素、1 μM金丝桃苷、5 μM阿魏酸、10%自体血浆组成。
5.一种如权利要求3或4所述的用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞的培养基在同时培养诱导Tscm细胞及iNKT细胞的应用。
6.一种用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞的培养方法，其特征在于，所述方法包括：
获取待处理细胞；
根据预设的培养时长，基于所述权利要求3~4中任意一项所述培养基，培养所述待处理细胞；
收集培养后的所述待处理细胞备用；
所述待处理细胞为PBMC，所述培养时长为14天。。
7.根据权利要求6所述的用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞的培养方法，其特征在于，所述待处理细胞的接种密度为5×106个/mL。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1~2中任意一项培养基，所述试剂盒用于诱导Tscm细胞的培养或/和外泌体制备。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求3~4中任意一项培养基，所述试剂盒用于同时诱导Tscm细胞及iNKT细胞的培养或/和外泌体制备。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN115927199A (zh) * | 2015-11-04 | 2023-04-07 | 菲特治疗公司 | 用于诱导造血细胞分化的方法和组合物 |
| CN116716246A (zh) * | 2023-06-26 | 2023-09-08 | 广州正源生物技术有限公司 | 一种脐血iNKT细胞体外扩增和诱导活化的方法及应用 |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103031274A (zh) * | 2011-09-30 | 2013-04-10 | 北京清美联创干细胞科技有限公司 | 小分子化合物tws119作为神经干细胞分化诱导剂的新应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 廖铭能 ; 于立坚 ; 张永平 ; 马润娣 ; 张霄瑜 ; 于廷曦 ; .阿魏酸钠诱导分化的PC12细胞裂解液的无细胞滤液的抗抑郁样效果.中国细胞生物学学报.2011,(06),608-621. * |
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