CN113005081A - 一种扩增干细胞样记忆性t细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种扩增干细胞样记忆性T细胞的培养方法，包括以下步骤：第一步为静置培养阶段，将PBMC中的T细胞使用抗体激活后在六孔板内静置培养3天；第二步为低转速的振荡培养阶段，将第一步培养的T细胞转移接种到125ml摇瓶中，在低速振荡的条件下培养3天；第三步为高转速的振荡培养阶段，将第二步培养的T细胞转移接种到500ml摇瓶中，在高速振荡的条件下培养3天。本发明提供了一种阶段性的三步式培养方法，可实现选择性的扩增TSCM亚群，使扩增终点的T细胞群体中富集TSCM，比例>80％，且操作简单，规模可扩大，适合用于大规模生产TSCM进行临床转化，具有很高的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体地说，涉及一种扩增干细胞样记忆性T细胞的培养方法。
背景技术
T细胞是淋巴细胞的主要组分之一，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助其它淋巴细胞发挥功能，对特异性抗原或促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子，是身体抵御疾病感染、防止肿瘤形成的主要免疫细胞之一。在体外富集、活化、扩增这类免疫细胞，可用于回输治疗多种疾病，包括恶性肿瘤、感染、自身免疫病等。
T细胞根据其分化程度可分为初始T细胞，记忆T细胞，效应T细胞。初始T细胞在胸腺中发育成熟迁移至外周淋巴组织中(如脾脏、淋巴结)。肿瘤患者体内初始T细胞接触肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原(TAA)，在APC细胞的识别和呈递下，经历一系列的信号通路，增殖分化为效应T细胞和记忆T细胞。效应T细胞和记忆T细胞有着不同的功能，前者分泌穿孔素、颗粒素酶和颗粒溶素等物质，并通过Fas配体直接杀伤肿瘤细胞，但在体内存活时间较短(3～4个月)，且无法继续增殖。高度分化的细胞毒性T细胞(Cytotoxic Lymphocyte，CTL)是效应T细胞，在体内的半衰期大约只有15天。记忆T细胞能够在血液系统中长期存在(10～20年)，遇到TAA后还能再次被激活，并分裂增殖为具有杀伤功能的效应性T细胞CTL。
干细胞样记忆性T细胞(TSCM)是一个罕见的T细胞亚群，其表面分子标志物组合可定义为CD45RA+CD62L+。TSCM其既具有初始T细胞的特征，又具有记忆T细胞的特征，被认为具有自我更新并分化为其它效应和记忆T细胞亚群的能力。因而在T细胞过继免疫治疗中，扩增后回输的T细胞群体中干细胞样记忆性T细胞的比例是与疗效相关的重要指标。
现有技术的T细胞培养方法多采用静置培养，并不能选择性的维持或扩增TSCM亚群以达到在终末回输的T细胞群体中富集TSCM的目的。
专利文献CN106399243A，公开日2017.02.15，公开了一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂及方法，发现在T细胞诱导培养基中额外添加组胺H1受体拮抗，可以在体外快速将CD8初始T细胞诱导分化扩增为TSCM细胞，且TSCM细胞占CD8细胞比例上有明显抬高，TSCM细胞的绝对数有显著抬高，诱导分化扩增的TSCM细胞保持了TSCM细胞的特性和功能。
专利文献CN107586758A，公开日2018.01.16，公开了一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂及诱导方法，所述的诱导剂包括红桂木凝集素，还包括细胞因子IL-2；所述的干细胞样记忆性T细胞为CD3+细胞的亚群。该研究发现ALL联合细胞因子IL-2可以在体外诱导TSCM细胞产生并促使增殖和集落形成，快速诱导CD3+T细胞扩增为TSCM，有效提高CD3+TSCM的绝对数和形成比例。
以上文献公开的方法都是使用诱导剂来促进TSCM细胞的增殖，使用的都是静置培养的方法。目前还未见通过改变培养方式选择性扩增TSCM亚群的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种通过改变培养方式，选择性扩增干细胞样记忆性T细胞的培养方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种扩增干细胞样记忆性T细胞的培养方法，包括以下步骤：
第一步为静置培养阶段：PBMC中的T细胞静置培养3天，培养基中加入抗体以激活T细胞；
第二步为低转速的振荡培养阶段：取相对于摇瓶2/125体积的第一步的培养物，直接转移接种到摇瓶中，添加培养基至摇瓶中培养物体积与摇瓶的体积比为(15-40):125，在低速振荡的条件下培养3天；
第三步为高转速的振荡培养阶段：离心收获经第二步培养的细胞，转移接种到摇瓶中，添加培养基至摇瓶中培养物体积与摇瓶的体积比为(15-40):125，在高速振荡的条件下培养3天。
作为本发明的一种优选实施方案，第二步中低速振荡的速度为40-70rpm，第三步中高速振荡的速度为70-120rpm。
作为其中的一个优选例，第三步中高速振荡的速度为80-100rpm。
作为本发明的另一种优选实施方案，第二步中，添加培养基至摇瓶中培养物体积与摇瓶的体积比为(30-40):125。
作为本发明的另一种优选实施方案，第三步中，添加培养基至摇瓶中培养物体积与摇瓶的体积比为(30-40):125。
作为本发明的另一种优选实施方案，所述抗体为CD3抗体和CD28抗体。
作为本发明的另一种优选实施方案，第一步使用T细胞无血清培养基，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2；第二步和第三步均使用含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基。
作为其中的一个优选例，所述的T细胞无血清培养基培养为X-Vivo-15或OpTmizer。
作为本发明的另一种优选实施方案，第一步、第二步和第三步均是在37℃，5％二氧化碳的环境下培养。
作为本发明的另一种优选实施方案，所述PBMC是使用密度离心法从人全血中新鲜分离得到的。
本发明优点在于：
1、本发明提供了一种阶段性的三步式培养方法，该方法中设置了合理的培养步骤及参数，可实现选择性的扩增TSCM亚群，使扩增终点的T细胞群体中富集TSCM，比例>80％；
2、本发明的方法操作简单，规模可扩大，适合用于大规模生产TSCM进行临床转化；
3、由于干细胞样记忆性T细胞被认为在T细胞过继免疫治疗中具有更好的扩增性能和治疗效果，因而本发明提供的方法具有很高的临床应用价值。
附图说明
图1：对应实施例1，为本发明所述培养方法扩增T细胞后终末群体中TSCM比例，及其与传统培养方法的对比。数据为流式检测的结果。
图2：对应实施例2，为本发明所述培养方法扩增T细胞后终末群体中TSCM比例，及其与传统培养方法的对比。数据为流式检测的结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
以下实施例中材料来源为：
X-Vivo-15(Lonza，货号BE02-060F)培养基、OpTmizer(ThermoFisher，货号A1048501)培养基。
CD3抗体(Biolegend，货号317325)、CD28抗体(Biolegend，货号302933)、IL2(Peprotech，200-02)。
实施例中其他所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例1 人外周血单核细胞(PBMC)中干细胞样记忆性T细胞(TSCM)的扩增(一)
本实施例中，使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC用于T细胞的激活扩增。将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，接种密度为1x106/ml，使用2mL/孔X-Vivo-15(Lonza)培养基，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2，并放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养。
培养第3天，将上述培养物转移至125ml摇瓶中，使用含有终浓度100IU/mL的IL2的X-Vivo-15(Lonza)培养基将体积补足至15mL，设置振荡培养箱的转速为40rpm。
培养第6天，离心收集细胞，将细胞转移接种至新的125mL摇瓶中，使用含有终浓度100IU/mL的IL2的X-Vivo-15(Lonza)培养基将体积补足至40mL，设置振荡培养箱的转速为100rpm。
培养第9天，离心收集细胞，并对细胞表现标志物CD45RA和CD62L进行流式细胞仪检测。
同时用传统静置培养方法作为对照：将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，接种密度为1x106/ml，使用2mL/孔X-Vivo-15(Lonza)培养基，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2，并放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养。培养第3天，收集培养孔所有细胞，300g/min离心5min，去上清，将细胞重悬于2ml X-Vivo-15(Lonza)培养基中，添加终浓度100IU/mL的IL2，并放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养。以后每隔1天，重复上述操作并继续培养观察。培养第9天，离心收集细胞，并对细胞表现标志物CD45RA和CD62L进行流式细胞仪检测。
如图1，结果显示CD45RA和CD62L双阳性(CD45RA+CD62L+)TSCM的比例达85.9％，远高于传统静置培养方法的51.9％。
实施例2 人外周血单核细胞(PBMC)中干细胞样记忆性T细胞(TSCM)的扩增(二)
本实施例中，使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC用于T细胞的激活扩增。将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，接种密度为1x106/ml，使用2mL/孔OpTmizer(ThermoFisher)培养基，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2，并放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养。
培养第3天，将上述培养物转移至125mL摇瓶中，使用含有终浓度100IU/mL的IL2的OpTmizer(ThermoFisher)培养基将体积补足至40mL，设置振荡培养箱的转速为60rpm。
培养第6天，离心收集细胞，将细胞转移接种至新的500mL摇瓶中，使用含有终浓度100IU/mL的IL2的OpTmizer(ThermoFisher)培养基将体积补足至150mL，设置振荡培养箱的转速为120rpm。
培养第9天，离心收集细胞，并对细胞表现标志物CD45RA和CD62L进行流式细胞仪检测。如图2，结果显示CD45RA和CD62L双阳性(CD45RA+CD62L+)TSCM的比例达88.3％，远高于传统静置培养方法(方法同实施例1)的29.3％。
实施例3 人外周血单核细胞(PBMC)中干细胞样记忆性T细胞(TSCM)的扩增(三)
本实施例中，使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC用于T细胞的激活扩增。将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，接种密度为1x106/ml，使用2mL/孔X-Vivo-15(Lonza)培养基，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2，并放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养。
培养第3天，将上述培养物转移至125ml摇瓶中，使用含有终浓度100IU/mL的IL2的X-Vivo-15(Lonza)培养基将体积补足至30mL，设置振荡培养箱的转速为70rpm。
培养第6天，离心收集细胞，将细胞转移接种至新的125mL摇瓶中，使用含有终浓度100IU/mL的IL2的X-Vivo-15(Lonza)培养基将体积补足至15mL，设置振荡培养箱的转速为80rpm。
培养第9天，离心收集细胞，并对细胞表现标志物CD45RA和CD62L进行流式细胞仪检测。
实施例4 人外周血单核细胞(PBMC)中干细胞样记忆性T细胞(TSCM)的扩增(四)
本实施例中，使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC用于T细胞的激活扩增。将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，接种密度为1x106/ml，使用2mL/孔X-Vivo-15(Lonza)培养基，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2，并放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养。
培养第3天，将上述培养物转移至125ml摇瓶中，使用含有终浓度100IU/mL的IL2的X-Vivo-15(Lonza)培养基将体积补足至20mL，设置振荡培养箱的转速为60rpm。
培养第6天，离心收集细胞，将细胞转移接种至新的125mL摇瓶中，使用含有终浓度100IU/mL的IL2的X-Vivo-15(Lonza)培养基将体积补足至30mL，设置振荡培养箱的转速为70rpm。
培养第9天，离心收集细胞，并对细胞表现标志物CD45RA和CD62L进行流式细胞仪检测。
实施例5 人外周血单核细胞(PBMC)中干细胞样记忆性T细胞(TSCM)的扩增(五)
本实施例中，使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC用于T细胞的激活扩增。将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，接种密度为1x106/ml，使用2mL/孔X-Vivo-15(Lonza)培养基，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2，并放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养。
培养第3天，将上述培养物转移至125ml摇瓶中，使用含有终浓度100IU/mL的IL2的X-Vivo-15(Lonza)培养基将体积补足至20mL，设置振荡培养箱的转速为60rpm。
培养第6天，离心收集细胞，将细胞转移接种至新的500mL摇瓶中，使用含有终浓度100IU/mL的IL2的X-Vivo-15(Lonza)培养基将体积补足至120mL，设置振荡培养箱的转速为100rpm。
培养第9天，离心收集细胞，并对细胞表现标志物CD45RA和CD62L进行流式细胞仪检测。
实施例6 人外周血单核细胞(PBMC)中干细胞样记忆性T细胞(TSCM)的扩增(六)
本实施例中，使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC用于T细胞的激活扩增。将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，接种密度为1x106/ml，使用2mL/孔X-Vivo-15(Lonza)培养基，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2，并放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养。
培养第3天，将上述培养物转移至125ml摇瓶中，使用含有终浓度100IU/mL的IL2的X-Vivo-15(Lonza)培养基将体积补足至30mL，设置振荡培养箱的转速为40rpm。
培养第6天，离心收集细胞，将细胞转移接种至新的1000mL摇瓶中，使用含有终浓度100IU/mL的IL2的X-Vivo-15(Lonza)培养基将体积补足至250mL，设置振荡培养箱的转速为80rpm。
培养第9天，离心收集细胞，并对细胞表现标志物CD45RA和CD62L进行流式细胞仪检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种扩增干细胞样记忆性T细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步为静置培养阶段：PBMC中的T细胞静置培养3天，培养基中加入抗体以激活T细胞；
第二步为低转速的振荡培养阶段：取相对于摇瓶2/125体积的第一步的培养物，直接转移接种到摇瓶中，添加培养基至摇瓶中培养物体积与摇瓶的体积比为(15-40):125，在低速振荡的条件下培养3天；
第三步为高转速的振荡培养阶段：离心收获经第二步培养的细胞，转移接种到摇瓶中，添加培养基至摇瓶中培养物体积与摇瓶的体积比为(15-40):125，在高速振荡的条件下培养3天。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，第二步中低速振荡的速度为40-70rpm，第三步中高速振荡的速度为70-120rpm。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，第三步中高速振荡的速度为80-100rpm。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，第二步中，添加培养基至摇瓶中培养物体积与摇瓶的体积比为(30-40):125。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，第三步中，添加培养基至摇瓶中培养物体积与摇瓶的体积比为(30-40):125。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述抗体为CD3抗体和CD28抗体。
7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，第一步使用T细胞无血清培养基，并添加终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2；第二步和第三步均使用含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基。
8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述的T细胞无血清培养基培养为X-Vivo-15或OpTmizer。
9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，第一步、第二步和第三步均是在37℃，5％二氧化碳的环境下培养。
10.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述PBMC是使用密度离心法从人全血中新鲜分离得到的。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104204195A (zh) * | 2012-04-10 | 2014-12-10 | 株式会社淋巴技术 | 以记忆t细胞为主要成分的淋巴细胞群的制造方法 |
| CN105543169A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-05-04 | 深圳市合一康生物科技股份有限公司 | 一种人tscm细胞的制备方法及应用 |
| CN106062185A (zh) * | 2014-04-24 | 2016-10-26 | 美天旎生物技术有限公司 | 用于自动生成遗传修饰的t细胞的方法 |
-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104204195A (zh) * | 2012-04-10 | 2014-12-10 | 株式会社淋巴技术 | 以记忆t细胞为主要成分的淋巴细胞群的制造方法 |
| CN106062185A (zh) * | 2014-04-24 | 2016-10-26 | 美天旎生物技术有限公司 | 用于自动生成遗传修饰的t细胞的方法 |
| US20170037370A1 (en) * | 2014-04-24 | 2017-02-09 | Miltenyi Biotec Gmbh | Method for automated generation of genetically modified t cells |
| CN105543169A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-05-04 | 深圳市合一康生物科技股份有限公司 | 一种人tscm细胞的制备方法及应用 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113637636A (zh) * | 2021-09-10 | 2021-11-12 | 依科赛生物科技（太仓）有限公司 | 一种提高体外培养初始t细胞比例的方法 |
| CN113637636B (zh) * | 2021-09-10 | 2023-09-05 | 苏州依科赛生物科技股份有限公司 | 一种提高体外培养初始t细胞比例的方法 |
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