DE69033083T2

DE69033083T2 - Verfahren zur Fixierung und Rückgewinnung von Zellen

Info

Publication number: DE69033083T2
Application number: DE69033083T
Authority: DE
Inventors: Thomas B. Okarma
Original assignee: Rorer Pharmaceutical Products Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1990-06-28
Publication date: 1999-08-26
Anticipated expiration: 2010-06-29
Also published as: DE69033083D1; DE69033963T2; ES2132063T3; CA1340565C; EP0701130A3; DK0405972T3; GR3030533T3; ES2173142T3; DK0701130T3; EP0701130A2; JP2656988B2; US6432653B1; ATE179751T1; ATE217974T1; JPH0339088A; DE69033963D1; EP0405972A1; EP0405972B1; EP0701130B1; CA1337644C

Description

Der Fachbereich betrifft Zelltrennungen unter Verwendung von Vorrichtungen mit einer Spezifität für Zelloberflächenproteine. Im besonderen handelt es sich bei den zellulären Quellen um Blut, Spinalflüssigkeit, Rückenmark, Tumor-Homogenisate, lymphatisches Gewebe und ähnliches.
Es gibt zahlreiche Situationen, in denen die Isolierung einer spezifischen Zellklasse oder die Entfernung eines bestimmten Zellsets aus einem Zellgemisch von Interesse ist. Zu den bisher angewandten Methoden zählen die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung, magnetische Mikrokügelchen, die Komplement-vermittelte Lyse, die Affinitätschromatographie, die zentrifugale Ausschlämmung und das Polystyrol- Panning der Zellen. Zellen mit wesentlichen Dichteunterschieden, wie z. B. bei Blutplättchen und roten Blutkörperchen, können mittels der Gradientenzentrifugations-Methodik grob fraktioniert werden. Allerdings erfordern Säugerzellen mit ihren äquivalenten Dichten, wie etwa Tumorzellen, Lymphozyten-Subsets, Granulozyten oder Stammzellen, eine Form der Abtrennung unter Ausnutzung der Molekülerkennung von Oberflächenmarkern, die mit ihrem Phänotyp korrelieren. Ähnlich sind auch zur Trennung von Viren und Bakterien in komplexen Gemischen voneinander derartige molekuläre Mechanismen erforderlich. Jedes der zuvorgenannten Verfahren zeigt für etliche Anwendungen ernstliche Nachteile, bei denen ein Interesse in der Isolierung oder Entfernung bestimmter Subsets von Zellen besteht.
Die Nachteile bei der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung zur Rückgewinnung lebensfähiger sortierter Zellen bestehen in der Langsamkeit des Verfahrens, der Tatsache, daß die isolierten Zellen mit Antikörper beschichtet sind und der beschränkten Zellmengen, die mittels des Verfahrens erhalten werden können.
Bei Mikrokügelchen ist die Rückgewinnung der Zellen von den Kügelchen nach der Abtrennung schwierig; die Zellen sind häufig mit Antikörper und magnetischen Kügelchen überzogen, wodurch klare Abtrennungen nur schwer erzielbar sind. Die Komplement-vermittelte Lyse ist aus zwei Gründen problematisch: erstens erfolgt keine vollständige Abreicherung der Zielzellen, und zweitens können die nicht- Zielzellen dadurch nachteilig beeinflußt werden, daß sie dem Komplement und den giftigen Nebenprodukten der Zielzellyse ausgesetzt sind. Die Affinitätschromatographie der Zellen unter Verwendung von z. B. an Antikörper gekoppeltem Sephadex G-10 leidet unter einer schlechten Rückgewinnungsrate und einer unzureichenden Abreicherung der Zielzellen. Die zentrifugale Ausschlämmung ist nicht zur Trennung verschiedener phänotypischer Subpopulationen von Zellen einer ähnlichen Größe in der Lage.
Die letzte Methode, das von Wysocki und Sato, PNAS, 75: 2844 (1978) entwickelte Panning unter Verwendung passiv an Polystyrol adsorbierter Antikörper ist besonders ungeeignet. Die Rückgewinnungsraten sind lediglich gering und das Verfahren leidet an fehlender Spezifität und einer Kontamination der abgetrennten Zellen mit Antikörper.
Je mehr Erkenntnisse über den Abwehrmechanismus des Immunsystems vorliegen, umso deutlicher wird, daß die Subsets der Zellen relativ enge Aktivitätsbereiche besitzen können. So können Subsets auf die Reaktion auf eine bestimmte Erkrankung, wie z. B. Neoplasie, Infektion, viral oder zellulär, etc., Reaktion auf Transplantate und ähnliches spezialisiert sein. Daher besteht großes Interesse darin, diese Zell-Subsets identifizieren und ausreinigen zu können, um nicht nur ihre Wirkung, sondern auch die Nutzung dieser Zellen für prophylaktische und therapeutische Zwecke zu verstehen. Um die gewünschten Resultate zu erzielen, ist der Erhalt im wesentlichen reiner Populationen des oder der gewünschten Zell- Subsets erforderlich. Außerdem sollten die Zellen sein: (1) Frei von Antikörpern auf ihrer Oberfläche, (2) lebensfähig, (3) zur Erfüllung ihrer normalen Funktionen in der Lage und (4) ansprechfähig auf eine Aktivierung durch biologische Stoffe in derselben Weise wie normale Zellen in deren normaler Umgebung.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum Ändern der zellulären Zusammensetzung eines Zellgemischs, welches Verfahren das Durchleiten der Flüssigkeit durch eine Zelleinfangvorrichtung in derartiger Weise umfaßt, daß die Zellen mindestens eine interne flache Polystyrol-Oberfläche der Vorrichtung, bei der es sich um eine Platte, Faser, Behälterwand oder Zwischenwand handelt, kontaktieren, wobei die Oberfläche mindestens einen Rezeptor kovalent gebunden hat, der für mindestens einen Liganden spezifisch ist, der auf zumindest einem Teil der Zellen in der Flüssigkeit vorhanden ist, über einen ausreichend fangen Zeitraum hinweg, daß Zellen, die diesen Liganden enthalten, spezifisch an die Oberfläche binden; und
Entfernen der Zellen, die nicht spezifisch gebunden sind, ohne im wesentlichen spezifisch gebundene Zellen zu zerstören. Die Zellen können aus den Rezeptoren, je nach Eignung, entweder durch biologische Aktivierung freigesetzt werden, was in einer Liganden-Ausschüttung und Freisetzung resultiert, oder durch physikalische Methoden, wie z. B. Pipettierung, mechanische Vibration oder Ultraschall. Die Zellen können zahlenmäßig erweitert, biologischen Stoffen oder anderen Faktoren zur Differenzierung und/oder Aktivierung oder ähnliches unterzogen werden, und können zu Forschungs-, Diagnose-, Prophylaxe- und/oder Therapie-Zwecken verwendet werden.
In den begleitenden Zeichnungen zeigt:
Abb. 1 eine Schemazeichnung eines Verfahrens zur Präparierung von Zellen aus peripherem Blut oder Knochenmark für die Einfangvorrichtung gemäß dieser Erfindung;
Abb. 2 eine diagrammatische Ansicht der Innenseite der Zelleinfangvorrichtung.
Es werden Verfahren zur Isolierung einer bestimmten Population biologisch replizierbarer Partikel, besonders Zellen, aus einem Gemisch von Partikeln durch Binden der Population an ein festes Substrat durch die Vermittlung von einem oder mehreren spezifischen Rezeptoren bereitgestellt. Wahlweise können die Partikel dann in vielfältiger Weise behandelt werden, um die Populationgröße und/oder Eigenschaften der eingefangenen Partikel zu beeinflussen. Die Zellen können dann vom Träger in im wesentlichen Rezeptor-freier Form freigesetzt werden.
Das Verfahren umfaßt das Zusammenbringen einer Quelle von Partikeln mit an einen Träger gebundenen Rezeptor in einer Einfangvorrichtung, wobei die Rezeptor- Population auf der Oberfläche für eine hohe Bindungsdichte des/der Liganden von Interesse sorgt. Die Bedingungen des Zusammenbringens sind derartige, daß eine ausreichend lange Zeitspanne und ein niedriger Grad an Turbulenz ermöglicht wird, um den Partikeln die spezifische Bindung an den Rezeptor zu gestatten. Nach ausreichend langer Zeit, damit die Bindung erfolgen kann, kann das Medium entfernt und die Oberfläche gewaschen werden, um jene Partikel zu entfernen, bei denen es sich um nicht spezifisch gebundene Partikel handelt. Da die Partikel normalerweise an einer Vielzahl von Stellen an die Oberfläche gebunden werden, wodurch eine hohe Bindungsavidität entsteht, kann das Waschen relativ kräftig erfolgen, um eine im wesentlichen vollständige Entfernung all jener Partikel zu gewährleisten, die nicht spezifisch gebunden sind. Die Partikel können dann einer breiten Vielfalt von Bedingungen und Behandlungen unterzogen werden, die gewöhnlich den Kontakt mit ein oder mehreren Reagenzien einbeziehen. Wahlweise kann das Medium, das die Reagenzien enthält, dann entfernt und die Partikel von den Rezeptoren freigesetzt werden. Die Freisetzung kann entweder durch Behandeln mit einer Kombination aus einem Mitogen und einem Lymphokin oder durch physikalische Methoden wie Pipettierung, Vibration oder Beschallung erfolgen. Die Partikel können dann isoliert und für ihren angestrebten Zweck verwendet werden.
Die Vorrichtung findet in einer Anzahl verschiedener Situationen Anwendung. Bei der ersten handelt es sich um eine Situation, bei der unerwünschte Zellen aus physiologischen Flüssigkeiten eingefangen und entfernt werden sollen und dabei die unerwünschten Zellen in der Flüssigkeit zum therapeutischen Nutzen oder für Anwendungen bei Diagnostik oder Forschung abgereichert werden sollen. Dies läßt sich durch Abreicherung bestimmter T-Lymphozyten aus dem Knochenmark veranschaulichen, um die Transplantat-Wirt-Reaktion abzuschwächen. Das Knochenmark, in dem die unerwünschten Zellen abgereichert wurden, wird sofort zur Transplantation in den Mark-Empfänger vorbereitet.
Eine zweite Situation besteht im Einfangen und Rückgewinnen bestimmter Zellen aus physiologischen Flüssigkeiten für Forschung und Diagnostik. Diagnostische Anwendungen können das Einfangen und anschließende Zählen und das Beschreiben eingefangener (1) maligner Zellen aus Blut oder anderen Geweben, (2) viral und bakteriell infizierter Säugerzellen, (3) Viren oder Bakterien oder der Parasiten selbst aus physiologischen Flüssigkeiten, (4) humaner Fötuszellen zur karyotypischen Analyse aus Blut, (5) transplantierter Zellen aus Blut als einem Hinweis auf die Rückgewinnung aus der Knochenmarktransplantation und (6) immunkompetenter Zellen mit einem bestimmten Oberflächenmarker, wie z. B. das Vorhandensein des IL-2-Rezeptors, als Anzeige eines aktivierten Zustandes umfassen. Für die Forschung kann das Interesse in (1) der genetischen Analyse oder Modifikation eingefangener Zellen, (2) der Analyse und Modifikation der Physiologie bestimmter Zellklassen, die durch einen bestimmten krankhaften Prozeß aktiviert oder unterdrückt sein können und (3) auf dem molekulären Niveau, der Analyse der Zusammensetzung der Oberflächenmembran und die Modifikation der in die Pathogenese einer bestimmten Erkrankung involvierten Zellen bestehen.
Die dritte Situation besteht im Einfangen und Rückgewinnen von Zellen aus physiologischen Flüssigkeiten zur Modifizierung (Aktivierung) und Rückgabe an den Patienten ihres Ursprungs für eine gewünschte therapeutische Wirkung. Das Verfahren umfaßt das Einfangen und Rückgewinnen der Zellen, das Aufarbeiten der eingefangenen Zellen oder abgereicherten Zellpopulation, was zu einer zahlenmäßigen Erweiterung und/oder biologischen Aktivierung führen kann, und der anschließenden Rückgewinnung und Verwendung dieser Zellen.
Die dritte Situation kann weiter in drei Anwendungsschritte unterteilt werden. Der Schritt besteht in der biologischen Aktivierung der eingefangenen/rückgewonnenen Zellen selbst. Die Aktivierung wird ohne weitere Fraktionierung der Zellen vorgenommen. Im Falle eines AIDS-Patienten beispielsweise können im peripheren Blut eingefangene CD8-positive Zellen erweitert und zur anschließenden Rückgabe an den Patienten ihres Ursprungs aktiviert werden. Der zweite Schritt besteht in einer selektiven Aktivierung. Eingefangene und rückgewonnene Zellen werden weiteraufgearbeitet oder fraktioniert, um ein Subset der eingefangenen Zeilen zu erhalten, wie z. B. durch Antigen-Spezifität identifiziert, die dann aktiviert und/oder erweitert werden. So können z. B. bestimmte, auf das Antigen beschränkte Subsets der eingefangenen CD8-positiven Zellen mittels bestimmter Kokulturbedingungen und Konzentrationen an Lymphokinen ausgewählt werden, die eine Erweiterung und Aktivierung lediglich des gewünschten Subsets erlauben. Ein dritter Schritt besteht in der in vitro-Generierung Antigen-spezifischer Patienten-unikaler Zellen zur Aktivierung oder Unterdrückung der Immunfunktion. Ein Beispiel für diese Situation ist das Einfangen von Monozyten oder B-Zellen und das Aussetzen der eingefangenen Monozyten oder B-Zellen einem Patienten-spezifischen Immunkomplex oder anderen Antigenen unter Bedingungen, die die Monozyt- oder B-Zell-Antigen- Aufnahme, Aufarbeitung und Präsentation, nebst einer erhöhten Oberflächen-MHC- Expression, verstärken. Dem würde dann ein Subset von vom gleichen Patienten eingefangenen Effektor- oder Regulatorzellen zugegeben werden, um mit dem Antigen-geprimten Monozyt oder B-Zelle in Wechselwirkung zu treten. Das Verfahren der Antigen-spezifischen T-Zell-Aktivierung würde weitgehend in derselben Weise wie im Lymphknoten eines gesunden Tieres oder Menschen erfolgen. Ein weiteres Beispiel der durch das vorliegende Verfahren ermöglichten Zellmodifikation besteht in der Einführung exogener Gene über virale oder andere Vektoren oder weitere Mittel in die eingefangenen Zellen und dem anschließenden Einfangen in einer zweiten Vorrichtung der Subpopulation der Zellen, die das exogene Gen exprimieren.
Die zelluläre Quelle kann in einem beliebigen Zellgemisch bestehen. Es ist jedoch erwünscht, eine zuvor bestimmte Population zu haben, die durch einzelne oder multiple Marker oder eine Vielzahl von Markern oder Liganden definiert sein kann. Zu interessierenden zellulären Quellen von tierischen Wirten können Organe zählen, wie z. B. Blut, Hirn, Niere, Milz, Herz, Darm, Knochenmark, Hirn- und Rückenmarksflüssigkeit, lymphatisches Gewebe oder ähnliches, oder neoplastische Zellen aus einem der obigen Organe. Weitere Quellen können mit tierischen Zellen vermischte Parasiten, Viren oder Bakterien sein. Die Zellen werden in fließfähiger Form, bequemerweise als Dispersion, verwendet. Liegen die Zellen nicht zusammenhängend vor, so werden, z. B. bei Blut, gewöhnlich die roten Blutkörperchen, Blutplättchen und das Plasma aus dem Blut entfernt, um ein Gemisch aus weißen Blutkörperchen zu erhalten. Werden die Zellen durch ein membranartiges oder anderes Bindematerial zusammengehalten, so können die Zellen entweder mechanisch oder enzymatisch gemäß herkömmlicher Methoden dispergiert werden. Die einzelnen Zellen können dann in einem für sie geeigneten Nährmedium zur Abtrennung mittels des vorliegenden Verfahrens dispergiert werden.
Bei Blut können die roten Blutkörperchen durch Agglutination entfernt werden, durch Ammoniumchlorid lysiert werden und mit Lektinen oder durch Zentrifugation gemäß bekannter Methoden entfernt werden. Die Blutplättchen und roten Blutkörperchen können auch durch Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Ficoll oder Leukoprep und unter Isolierung des Leukozytenfilms im zentrifugierten Blut, durch Zentrifugation oder ähnliches entfernt werden.
Die verschiedenen Zellquellen können über die oben beschriebenen hinaus einer Vielzahl von Behandlungen unterzogen werden. In einigen Situationen kann es erwünscht sein, die Zellen mit geeigneten Methoden zu konzentrieren, gefolgt durch eine Dispersion in einem geeigneten Nährmedium. In einigen Situationen kann es erwünscht sein, eine bestimmte Population zu vergrößern, wobei eine Gruppe von Zellen selektiv gegenüber einer anderen Gruppe von Zellen erweitert werden kann. Für die Erweiterung können verschiedene Mitogene oder interleukine, Wachstumsfaktoren oder ähnliches verwendet werden. Diese Zellen werden dann gewöhnlich mittels einer geeigneten Methode konzentriert, um das Medium, in dem sie isoliert wurden oder in dem sie enthalten waren, im wesentlichen zu entfernen. Üblicherweise enthalten diese Zeilen mindestens etwa 10 Vol.-% der weiterzuverwendenden Dispersion und nicht mehr als etwa 90 Vol.-%, um die Dispersion fließfähig zu erhalten. Die Konzentration der in die Vorrichtung eingeführten Zeilen geht bequemerweise vom Oberflächenbereich der derivatisierten Polystyrol-Oberfläche aus und variiert breit, was von der Einsatzmenge an Zielzellen in der Zellsuspension abhängt. Gewöhnlich enthält die Konzentration mindestens 1 · 10³ Zellen/cm² und nicht mehr als 1 · 10 Zellen/cm², gewöhnlich etwa 1 · 10&sup5; Zellen/cm² bis 1 · 10&sup7; Zellen/cm².
Die Separationsvorrichtung kann vielfältige Formen annehmen. Zum größten Teil besteht die Vorrichtung aus Polystyrol-Oberflächen, wobei das Polystyrol normalerweise praktisch frei von Vernetzung, nämlich zu weniger als etwa 0,5%, gewöhnlich weniger als etwa 0,1%, und vorzugsweise geformt oder extrudiert ist, um eine sehr glatte Oberfläche zu erhalten. Polystyrol-Oberflächen dieser Art ermöglichen eine beträchtliche Gleichmäßigkeit der Derivatisierung, wobei die Ausrichtung des Rezeptors einen hohen Grad der Zugänglichkeit der Bindungsstellen ermöglicht. (Es sollte bezüglich des Rezeptors verstanden sein, daß der Ausdruck ein gänzlich willkührlicher ist. Mit Rezeptor ist ein Molekül gemeint, das zur spezifischen Bindung an ein komplementäres Molekül in der Lage ist. Daher kann für die Zwecke dieser Erfindung der Rezeptor ein Ligand sein, was sowohl Haptene als auch Antigene umschließt, oder ein Oberflächenmembran-Protein, welches spezifisch an ein anderes Molekül bindet, wie etwa ein Immunglobulin, T-Zellrezeptor, Insulinrezeptor etc., oder ein Molekül, das intrazellulär vorliegt, wie etwa ein Steroid-Bindungsprotein, oder Moleküle, die in Körperflüssigkeiten vorkommen, wie etwa Thyroxin- Bindungsglobulin, Lipoproteine etc. Daher wird das Membranprotein, das spezifisch an den Oberflächen-gebundenen "Rezeptor" bindet, willkührlich als der "Ligand" bezeichnet. Der Bequemlichkeit halber werden sie gemeinsam als komplementäre Partner eines spezifischen Bindungspaars bezeichnet.)
Die funktionalisierte Polystyrol-Oberfläche kann die Oberfläche einer Wand, Zwischenwand, Platte, Hohlfaser oder ähnliches sein. Zumindest eine Oberfläche besteht in einer flachen Oberfläche. Die Vorrichtung kann die Form einer Flasche, eines standardmäßigen T-Kolbens, von Platten, z. B. einem Beutel oder einer Schachtel mit multiplen getrennten Platten, zylindrischen oder serpentinförmigen Platten in einem Behälter, einer rechteckigen Schachtel oder ähnliches sein. Die Wahl der Vorrichtung hängt von ihrer Bequemlichkeit, dem Zweck der Separation, der Wechselwirkung mit anderen Vorrichtungen, der Zellpopulation von Interesse, der angestrebten Behandlung, davon, ob die Population von Interesse das Ergebnis einer positiven oder negativen Auswahl ist, oder ähnlichem ab.
Die Oberfläche wird durch Substitution des Benzolrings vom Polystyrol mit einem elektrophilen Reagenz, besonders durch eine Friedel-Crafts-Reaktion in einem Lösungsmittel, das das Polystyrol nicht erweicht oder auflöst, derivatisiert. Zu diesem Zweck findet besonders Sulfolan Anwendung. Es können relativ milde Bedingungen angelegt und das Benzol mit einer Vielzahl von Agentien derivatisiert werden, wie z. B. Nitro, das zu Amino reduziert werden kann, Halomethyl, das zum Erhalt einer Amino-, Hydroxyl- oder Thiolgruppe verwendet werden kann, oder ein substituiertes N-Hydroxymethylacetamid, bei dem der Substituent ein aktives Halogen oder Pseudohalogen ist. Eine Beschreibung der Reaktion ist in EP-A-88-304516.3 zu finden.
Die derivatisierte Polystyrol-Oberfläche kann dann mit dem Rezeptor umgesetzt werden. Unter den Bedingungen der Derivatisierung wird festgestellt, daß ein hoher Prozentsatz der Benzole an der Oberfläche derivatisiert wird, so daß eine hohe Rezeptordichte an der Oberfläche erzielt werden kann.
In Abhängigkeit von der Natur des Rezeptors können verschiedene Reaktionen zum Binden des Rezeptors an die Oberfläche vorgenommen werden. Von besonderem Interesse ist die Bindung von Proteinen an die Oberfläche. Proteine können durch Zusammenbringen der Proteine in einem wässrigen Medium mit der funktionalisierten Oberfläche mit aktivem Halogen, aktivierten Carboxy-Gruppen, z. B. Estern, oder ähnlichem, unter milden Bedingungen über ausreichend lange Zeiträume zum vollständigen Umsetzen gebunden werden. Jegliche verbleibenden, nicht- umgesetzten, funktionellen Gruppen können unter Verwendung eines geeigneten kleinmoleküligen Blockiermittels blockiert werden. So kann zum Beispiel aktives Haogen mit aliphatischen Aminen, Thiole mit Maleimid oder ähnliches blockiert werden. In einigen Situationen mag das Blockieren überschüssiger reaktiver Gruppen überflüssig sein, da sie nicht die nachfolgenden Verfahrensschritte beeinträchtigen. Die Oberfläche kann dann zur Entfernung nicht-spezifisch gebundenen Rezeptors gewaschen und ausgewertet werden, um sicherzustellen, daß eine zweckmäßige Rezeptorbindung stattgefunden hat.
In Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Einfangvorrichtung variiert der Kontakt mit dem Zell-haltigen Medium. Bei einer Rollflasche beispielsweise kann das Medium in die Rollflasche eingebracht und dann die Flasche über ausreichende Zeiträume zum Binden der Zellen langsam gedreht werden. Bei einem T-Kolben oder einer Anordnung von Platten in einem Beutel/Schachtel kann die Vorrichtung auf eine erhöhte Oberfläche gestellt oder auf einer Rüttelplattform leicht gerüttelt werden, gefolgt durch Umstürzen der Vorrichtung und Wiederholen des Vorgangs auf der anderen Seite. Ähnliche Methoden können bei weiteren Behältertypen angewandt werden. Außerdem kann die Vorrichtung zentrifugiert werden, um die Zielzellen an die Kontaktoberfläche zu pressen.
Von besonderem Interesse ist eine Vorrichtung, die als Einfangbeutel/-schachtel bezeichnet werden soll. Bei diesem Beutel/Schachtel handelt es sich um einen Behälter mit starren oder flexiblen Wänden, der übereinandergelagerte oder getrennt voneinander aufeinandergestapelte Polystyrol-Platten enthält, damit ein Durchfluß zwischen den Platten möglich ist. Zusammengeklumpten Zellen als Ergebnis der Konzentrierung, z. B. der Dichtegradientenzentrifugation oder einer Zentrifugierung, wird das Einströmen in den Beutel/Schachtel ermöglicht, der in horizontaler Position gehalten wird. Die Zelldispersion verteilt sich im Beutel/Schachtel, wodurch sie mit praktisch der gesamten Rezeptor-beschichteten Polystyrol-Oberfläche im Beutel/Schachtel in Kontakt kommt. Nach einer ausreichend langen Zeitspanne zum Binden der Zellen kann der Beutel/Schachtel umgedreht werden, um solche Zellen, die nach wie vor dispergiert oder ungebunden sind, das Absetzen auf den Filmoberflächen, die nun unter ihnen liegen, und damit eine effiziente Ausnutzung der Oberfläche zu ermöglichen. Alternativ dazu kann der Beutel/Schachtel einmal auf jeder Seite zentrifugiert werden, um die Zellen an die Kontaktoberflächen zu pressen.
Die Kontaktzeit variiert breit in Abhängigkeit von der Konzentration des Liganden auf der Zelloberfläche, der Bindungsaffinität des Rezeptors, der Zellkonzentration im Medium, der Beschaffenheit der Einfangvorrichtung und ähnlichem. Gewöhnlich betragen die Kontaktzeiten etwa 5 Min, maximal aber etwa 120 Min., gewöhnlich etwa 15 bis 60 Min.
Die Zelldispersion kann durch die Einfangvorrichtung mittels eines beliebigen geeigneten Mittels bewegt werden. Durch die Einfangvorrichtung kann ein Druckgefälle durch Pumpen erzielt werden. Alternativ dazu kann ein Schwerkraftstrom für eine geeignete Fließgeschwindigkeit sorgen. Jede bequeme Methode, die eine Fließgeschwindigkeit der Zellen ermöglicht, die ihr Binden an die Oberfläche ohne wesentliche Beeinträchtigung ihrer Lebensfähigkeit zuläßt, kann angewandt werden.
Die vorliegenden Vorrichtungen können unter Anwendung von Elektronenstrahl- oder Gamma-Bestrahlungen sterilisiert werden, ohne die Eigenschaften der Einfangvorrichtung nachteilig zu beeinflussen. Das heißt, die Aktivität des Rezeptors wird beibehalten und zugleich die kovalente Beschaffenheit seiner Bindung an die Oberfläche. Bei Anwendung der Einfangvorrichtung geht daher von dem an die Oberfläche gebundenen Rezeptor praktisch nichts verloren.
Sind die Zellen einmal an die Oberfläche gebunden, so kann die Einfangvorrichtung einer breiten Vielfalt von Behandlungen unterzogen werden. Zur Entfernung nicht- anhaftender Zellen kann kräftiges Waschen angewandt werden, da die anhaftenden Zellen fest an die Oberfläche an einer Vielzahl von Kontaktstellen gebunden sind. Das Waschmedium kann ein- und ausgepumpt, Liganden durch die Vorrichtung geströmt oder andere Methoden schonender, doch relativ kräftiger Bewegung angewandt werden. Die Waschlösung kann in entionisiertem Wasser, Kochsalz, Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, Nährmedium oder ähnlichem bestehen. Die speziell zu verwendende Waschlösung hängt gewöhnlich von der Art des Gebrauchs der Zellen ab.
Dort, wo die Zellisolierung eine Entfernung von Zellen aus der Zellpopulation betrifft (Zell-Abreicherung), können die eingefangenen Zellen beseitigt und die abgereicherte Zellpopulation geerntet, weiteren Behandlungen unterzogen und dann ihrem angestrebten Zweck zugeführt werden.
In den meisten Fällen findet die vorliegende Erfindung besonders Anwendung bei Zellen, die für eine Weiterverwendung isoliert werden. In Abhängigkeit von der angestrebten Verwendung als auch von der Beschaffenheit der Zellen können diese einer breiten Vielfalt von Behandlungen unterzogen werden. Besonders dort, wo lymphatische oder myeloide Zellinien betroffen sind, können diese Zellen zur Erweiterung oder Modifizierung der Aktivität eines bestimmten Sets oder Subsets von Zellen behandelt werden. Daher können verschiedene Faktoren hinzugefügt werden, die zur Vermehrung der Zellen, Aktivierung der Zellen, Anreicherung oder Abreicherung eines oder mehrerer Oberflächen-Membranproteine und ähnlichem führen. In Abhängigkeit davon, ob die Bindung aller Zellen während der Behandlung erwünscht ist oder die Bildung freier Zellen ermöglicht werden soll, kann ein geeignetes Verhältnis von Rezeptor zu gebundenen Zellen im Behälter bereitgestellt werden. Wird eine große Zahl von Rezeptoren im Vergleich zu den ursprünglich gebundenen Zellen gewählt, so werden auch jegliche Nachkommen gebunden und an der Oberfläche festgehalten. Dies kann zur weiteren Auftrennung dienen, da andere Zellen, die vorhanden gewesen sein können und erweitert wurden, nicht gebunden werden und aus dem Einfanggefäß entfernt werden können.
Meistens werden die Zellen von Interesse aus Blut, Knochenmark, soliden Tumoren und lymphatishem Gewebe erhalten. Diese Zellen lassen sich in lymphoide und myeloide Zellinien unterteilen. Die erste zu betrachtende Zellinie ist die lymphoide Zellinie. Diese Zellinie läßt sich weiter in die Kategorien der B-Zellen und der T- Zellen aufsplittern. Die B-Zellen werden dadurch identifiziert, daß sie slg als einen Oberflächenmarker und umgruppierte Keimzellen-DNA am Immunglobulin-Locus aufweisen. Die T-Zellen weisen meistens CD2 und/oder CD5 als Oberflächenmarker und umgruppierte Keimzellen-DNA am T-Zell-Rezeptor-Locus auf. Die B- und T- Zellen umfassen auch spezifische Vorläuferzellen, wobei pluripotente Stammzellen separat erörtert werden, während im Falle von B-Zellen die Plasmazellen miteinbezogen sind.
Zu weiteren spezialisierten lymphatischen Zellen, die durch Marker isoliert werden können, zählen: Lymphokin-aktivierte Killer-(LAK)-Zellen, natürliche Killer-(NK)- Zellen, Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TIL), Antikörper-abhängige zytotoxische Zellen (ADCC), zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) etc.
Bei der myeloiden Zellinie kann das Interesse in der Isolierung von Monozyten, Makrophagen, Eosinophilen, Basophilen, polymorphkernige Leukozyten, dendritischen Zellen etc. bestehen.
Die B-Zellen können durch Behandlung mit verschiedenen der Interleukinen, also 1-7 oder anderen, sofern entdeckt, besonders IL-1, -2, -3, oder ähnlichem, erweitert werden. Die B-Zellen können durch Oberflächen-gebundenes Antigen, Oberflächenmarker (z. B. CD20) oder durch spezifische Bindung an ein lösliches Antigen ausgewählt, wobei solches Antigen den Zellen so beigefügt werden kann, daß jene Zellen mit einem Oberflächen-Immunglobulin, das das Antigen erkennt, das Antigen bindet und dabei einen Komplex bindet, der endozytotisch ist, und weiteraufgearbeitet werden. Dabei wird ein Fragment des Antigens mit dem MHC-Antigen der Zelle präsentiert. Durch Zugabe von T-Zellen zum Medium, die durch die B-Zellen beschränkt sind, sekretieren die T-Zellen, die das Antigen-Fragment erkennen, Lymphokine, was zur Vermehrung der B-Zellen führt. Indem ein Überschuß an Rezeptor auf der festen Oberfläche oder nach Freisetzung der B-Zellen durch Separation der Zellpopulation in einer zweiten Einfangvorrichtung bereitgestellt wird, kann die Zahl der B-Zellen und Plasmazellen, die das Antigen von Interesse erkennen, wesentlich erhöht werden.
Alternativ dazu können B-Zell-Fusionspartner (Hybridomazellen) oder andere B-Zellen aus einer beliebigen Quelle durch Binden an eine Polystyrol-Oberfläche, die kovalent gebundenes Antigen trägt, ausgewählt werden. Erwünschte Hybridoma- oder andere B-Zellen, die das slg tragen, das mit an Polystyrol gebundenem Antigen reaktiv ist, werden an der Polystyrol-Oberfläche eingefangen, wodurch eine Antigenspezifische Auswahl spezifischer Hybridoma- oder anderer B-Zellen ermöglicht wird. Die eingefangenen Zellen können dann rückgewonnen und gemäß der im vorliegenden Verfahren beschriebenen Vorgehensweisen erweitert werden. Alternativ dazu können T-Zellen oder jegliche Zellen, die einen spezifischen Oberflächen-Rezeptor umfassen, durch die Polystyrol-Oberfläche eingefangen werden, wenn diese Polystyrol-Oberfläche dieses Antigen in kovalent gebundener Form enthält.
Soll ein spezifisches Subset von B-Zellen abgereichert werden, so kann das Antigen in Konjugation an ein Toxin zugegeben werden, wobei für das Oberflächen-Immunglobulin spezifische Antikörper und Komplement oder ein anderes selektives zytotoxisches Potential verwendet wird. Auf diese Weise können die für ein bestimmtes Antigen ansprechbaren Zellen selektiv vermindert werden. Alternativ dazu kann Antigen oder ein B-Zell-Marker (z. B. CD20) am Polystyrol immobilisiert und die angezielte B-Zellpopulation auf der Oberfläche eingefangen werden.
Besonders dort, wo Gedächtniszellen vorliegen, kann die humorale Reaktion durch beträchtliche Abreicherung der Gedächtniszellpopulation für ein bestimmtes Antigen reduziert werden.
Die T-Zeilpopulation ist bezüglich der Funktion breitgefächerter als die T-Zellpopulation. Die reife T-Zellpopulation läßt sich in CD4-MHC-Klasse-II-beschränkte zytotoxische, Helfer- oder Suppressorzellen und CD8-MHC-Klasse-I-beschränkte zytotoxische und Suppressorzellen unterteilen, wobei die Zellen verschiedene Funktionen aufweisen und ihre Erweiterung und Abreicherung von Interesse sein kann.
Bei beiden T-Zellpopulationen (CD4 oder CD8) kann es erwünscht sein, die T-Zellen zu aktivieren, die ein spezifisches Antigen erkennen. Zu diesem Zweck können viele Strategien angewandt werden. Für ein bestimmtes Antigen spezifische B-Zellen können diesem Antigen ausgesetzt und dann als Antigen-präsentierende Zellen zur Aktivierung des auf das bestimmte Antigen beschränkten T-Zell-Subsets verwendet werden. Alternativ dazu können Monozyten oder Makrophagen als die Antigenpräsentierenden Zellen eingesetzt werden. Makrophagen mögen bevorzugt sein, da sie nicht die Spezifität der B-Zellen für ein bestimmtes Antigen aufweisen. Daher würde man Monozyten und/oder Makrophagen, die vorbehandelt oder zugleich mit dem Antigen behandelt wurden, zu den gebundenen T-Zellen zur Erweiterung jener T-Zellen geben, die das Antigen-Fragment bei Präsentation durch Monozyt/Makrophage im Zusammenhang mit dem MHC erkennen.
Die biologische Aktivierung von Zellen kann als Folge eines bestimmten löslichen oder immobilisierten Lymphokins, z. B. IL-2, oder durch Verwendung einer spezifisch bindenden Verbindung, wie etwa eines Antikörpers, erzielt werden. So können zum Beispiel T-Zellen unter Verwendung einer Anti-T-Zell-(z. B. CD5)-Oberfläche ausgewählt werden. Die mit CD-5&spplus; eingefangenen Zellen können dann freigesetzt und auf eine aktivierende Anti-CD3-Oberfläche oder eine Oberfläche, an die ein Lymphokin kovalent gebunden wurde, überführt werden. Die Zellen binden daraufhin und werden aktiviert. Nach der Aktivierung können die Zellen durch Beschallung, mechanische Anregung oder andere geeignete Methoden freigesetzt und geerntet werden.
Von besonderem Interesse sind Stammzellen, die aus Knochenmark oder peripherem Blut erhalten werden können. Diese Stammzellen können als die Vorläufer einer oder mehrerer der Blutzellinien dienen. Die Isolierung der Stammzellen kann als Folge sowohl der Abreicherung (negative Auswahl) und/oder einer positiven Auswahl erfolgen. Daher kann eine Serie von Vorrichtungen oder von Untersektionen einer Vorrichtung bereitgestellt werden, wobei die Rezeptoren anfänglich an unerwünschte Zellen zur Entfernung der Zellen (negative Auswahl) aus dem Medium binden. Die ungebundenen Zellen können dann isoliert, von den eingefangenen Zellen befreit und weiter auf Zellen mit unterschiedlichen, mit Stammzellen assoziierten Markern selektiert werden (positive Auswahl), wodurch eine gebundene Zellpopulation verbleibt, die dann freigesetzt werden kann, gefolgt durch eine weitere positive Auswahl auf einen für eine Population spezifischen Marker, die die Stammzellen umfaßt. Auf diese Weise können andere Zellen mit dem gleichen End-Marker durch die vorangegangenen Verfahrensschritte entfernt werden.
Dort, wo andere Zellen als Blutzellen beteiligt sind, können die für die Isolierung interessierenden Zellen die Langerhans'-Inseln, Gliazellen, Astrozyten, Neuronen, Endothelzellen, epitheloide Zellen, Stromazellen, Stammzellen, Plattenepithelzellen oder ähnliches umfassen.
Im wesentlichen, d. h. zu größer etwa 95%, gewöhnlich 98%, homogene Zellpopulationen können dann erzielt werden, wenn sich die Zellen im Ruhe- oder Aktivierungszustand befinden. Die zellulären Zusammensetzungen können jegliche Zellpopulationen umfassen, die einen durch den immobilisierten Rezeptor erkannten Oberflächenmarker (Ligand) exprimieren. Solche Zusammensetzungen umfassen Zellen, die einen der erkannten Leukozyt-Antigene des CD (Cluster-Bestimmungsreihe) oder andere, durch monoklonale Antikörper erkannte Antigene zu spezifischen Zelloberflächen-Liganden tragen. Zu solchen Zusammensetzungen zählen andere Blutzellen, Tumorzellen, Bakterien, Viren oder Parasiten, die in ähnlicher Weise einen gemeinsamen Oberflächenmarker teilen. Nahezu jede Zellpopulation, deren Mitglieder einen durch den immobilisierten Rezeptor erkannten Oberflächenliganden teilen, können solch eine zelluläre Zusammensetzung darstellen.
Eine große Vielfalt autoimmuner, neoplastischer, infektiöser, metabolischer, hämatologischer und immunologischer Erkrankungen und krankhafter Zustände (das Krankheitsgebiet) können gemäß dieser Erfindung behandelt werden. Zu den Autoimmunerkrankungen zählen Diabetes, Lupus erythematosus und rheumatoide Arthritis. Zu den infektiösen Erkrankungen zählen lokale und systemische Infektionen aufgrund Gram-positiver Kokken, Gram-negativer Kokken, Gram-negativer Bazillen, anaerober Bakterien, Mycobakterien, Fungi, Viren, Protozoen etc. Zu den neoplastischen Erkrankungen zählen alle soliden und hämatologischen Malignitäten. Zu den metabolischen Erkrankungen zählen Arteriosklerose und septischer Schock. Zu den hämatologischen Erkrankungen zählen Sichelzellanämie und primäre Hypercholesterinämie. Zu den immunologischen Erkrankungen und Zuständen zählen Organtransplantationen und Immundefekt-Zustände.
Das vorliegende Verfahren kann sich auf diese und weitere Erkrankungen und Zustände wie folgt richten. Mittels eines alternativen Verfahrens können Immunkomplexe isoliert werden, die mit der infektiösen oder neoplastischen Form der Autoimmunerkrankung assoziiert sind (siehe gleichzeitig anhängige Anmeldung der laufenden Nr. 243.786, eingereicht am 13. September 1988). Dabei kann das aus den Komplexen erhaltene Antigen zur Auswahl sowohl der B- als auch T-Zellen, die durch das bestimmte Antigen aktiviert werden, wie oben beschrieben verwendet werden. Auf diese Weise kann dem an der Autoimmun- oder neoplastischen Erkrankung leidenden Wirt Blut entnommen und entweder mit der Erkrankung assoziierte B- und/oder T-Zellen selektiv angereichert oder T- oder B-Zellen zur Unterdrückung der Autoimmunerkrankung aktiviert oder die neoplastischen Zellen nachgewiesen und eliminiert werden. In dieser Weise kann eine Remission bewirkt, das Fortschreiten der Erkrankung aufgehalten oder ähnliches erzielt werden.
Alternativ dazu kann in Fällen von Infektionen, Autoimmun- oder neoplastischen Erkrankungen die Auswahl von mit dem bestimmten Pathogen oder Krankheits- Antigen reaktiven B- und T-Zellen erfolgen. In diesem Fall wäre eine Erhöhung der Konzentration der mit der Immunabwehr assoziierten B- und T-Zellen erwünscht. Es können also Komplexe der mit dem Pathogen, der Autoimmun- oder neoplastischen Erkrankung assoziierten Antigene oder das Pathogen, die autoreaktive oder neoplastische Zelle selbst zur Vergrößerung der mit der Abwehr gegen die Erkrankung assoziierten lymphoiden Zellpopulation verwendet werden. Das Pathogen, die autoreaktive oder neoplastische Zelle kann unter Verwendung der vorliegenden Vorrichtung isoliert werden und das isolierte Pathogen oder die Zelle als Immunogen oder Rezeptor, wie oben definiert, zum Einfangen der geeigneten, bei der Abwehr gegen die Erkrankung aktiven T- oder B-Zellen verwendet werden. Auf diese Weise ausgewählt, könnten die Zellen rückgewonnen, erweitert, aktiviert werden, wie oben beschrieben, um anschließend dem Patienten des Ursprungs rückgegeben zu werden. Diese Methode kann auf eine breite Vielfalt von mit Viren, z. B. AIDS, HTLV-I oder -II, Bakterien, Protozoen, Fungi, Helminthen und ähnlichem assoziierten Erkrankungen angewandt werden.
Außerdem kann das vorliegende Verfahren zu prophylaktischen und diagnostischen Zwecken im Gebiet der Erkrankung angewandt werden. Das vorliegende Verfahren findet auch Anwendung im Bereich der Forschung zum Nachweisen von B- und T- Zell-Reaktionen, Untersuchen von Immunantworten, Identifizieren von mit Autoimmunerkrankungen assoziierten Epitopen, und wird schließlich in der Gentherapie eingesetzt.
Die Vorrichtung kann auch zur Herstellung monoklonaler Antikörper durch Aktivierung von B-Zellen, gefolgt durch Immortalisierung der B-Zellen, wie gewöhnlich durch Fusion mit einem geeigneten Fusionspartner vorgenommen, Verwendung finden. Auf diese Weise können humane Lymphozyten gegen Antigene immunisiert werden, die normalerweise einem menschlichen Wirt nicht verabreicht werden könnten, und eine doppelte Auswahl getroffen werden, nämlich zunächst ganz allgemein auf B-Zellen, und dann auf spezifische B-Zeilen, die zum Binden an das Antigen in der Lage sind. So können für das Antigen spezifische B-Zellen stark konzentriert werden, um die Wahrscheinlichkeit eines Erhalts für das Antigen spezifischer monoklonaler Antikörper stark zu erhöhen.
Die Zellen können aus der Einfangvorrichtung auf verschiedene Weise isoliert werden. Von besonderem Interesse ist die Verwendung eines Mitogens, wie z. B. Phytohämagglutinin (PHA), zusammen mit einer Verbindung mit Wachstumsfaktorartiger Aktivität, wie z. B. ein Interleukin oder Wachstumsfaktor, z. B. Interleukin-2 (IL-2), GM-CSF etc., was zur Freisetzung der Zellen durch Ausschüttung der Liganden auf der an den Rezeptor gebundenen Zelloberfläche führt. Das Medium kann in standardmäßigem Gewebekulturmedium bestehen, enthaltend etwa 20 bis 1000 Einheiten/ml IL-2 und etwa 0,1 bis 5,0 ug/ml Phytohämagglutinin. Alternativ dazu können die Zellen mittels physikalischer Methoden freigesetzt werden, wie zum Beispiel mechanischer Zerstörung, besonders einer Scherung, wie z. B. durch Vibration, kräftiges Pipettieren oder durch Beschallung unter Verwendung eines Ultraschallgerätes und Einbringen der Einfangvorrichtung in ein Wasserbad. Bequemerweise kann ein Crest-Ultraschall-Modell verwendet werden. Siehe Menssen, et al., J. Immunol. Methods (1987) 104: 1-6.
Zum weiteren Verständnis der Erfindung sollen nun die Abbildungen erörtert werden. Abb. 1 zeigt ein diagrammatisches Fließbild eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Blut als der Quelle der Zielzellen. Die Zeichnung zeigt ein erstes Stadium, umfassend ein Abtrenngefäß 10, worin die roten Blutkörperchen und Blutplättchen zum Erhalt eines Überstands abgesetzt werden. Der Überstand 12 wird dann in eine mit den Röhren 16 versehene Zentrifuge 14 weitergeleitet, wobei der Überstand 12 zur Konzentrierung der Zielzellen 20 in den Röhren 16 zentrifugiert wird. Die Zielzellen 20 werden dann in das Einspeisegefäß 22 weitergeleitet, das die Zielzellen durch das Ventil 24 in die Zelleinfangvorrichtung 26 speist, die auch in Abb. 2 gezeigt ist. Dieses Verfahren ist nicht auf das angeführte Beispiel beschränkt. Jegliches herkömmlicherweise angewandte Verfahren zur Entfernung der roten Blutkörperchen, Blutplättchen und des Plasmas kann zum Erhalt der Zielzellpopulation 20 aus peripherem Blut oder Knochenmark eingesetzt werden. Alternativ dazu kann festes Gewebe durch enzymatische oder physikalische Maßnahmen zum Erhalt der Zielzellpopulation 20 aufgeschlossen werden.
Die Zelleinfangvorrichtung 26 weist eine Vielzahl von Polystyrol-Filmen oder -Platten 30 auf, die durch die Träger 32 getrennt sind. Auf den oberen Filmen oder Platten 30 ist das Vorhandensein der durch R bezeichneten Rezeptoren 34 angedeutet. Die Rezeptoren 34 sind lediglich auf einigen wenigen der Filme oder Platten zum Hinweis darauf angedeutet, daß die Rezeptoren auf beiden Seiten des Films oder der Platte liegen, doch sollte verstanden sein, daß sämtliche Filme oder Platten auf beiden Seiten mit Rezeptoren überzogen sind. Alternativ dazu kann die Zelleinfangvorrichtung in einem T-Kolben, einer Mikrotiterplatte, einer Muttiwell-Platte, einer Rollflasche, einer Zellfarm oder einem anderen Polystyrol-Gefäß bestehen, wobei an einem Teil oder der gesamten internen Polystyrol-Oberfläche Rezeptor immobilisiert ist.
Die Zellen treten in die Zelleinfangvorrichtung 26 durch die Leitung 36 ein. Ist die Zelleinfangvorrichtung 26 im wesentlichen voll, so wird sie ausreichend lange stehengelassen, damit sich die Zellen absetzen und sie die Rezeptoren auf dem Film oder der Platte unterhalb der Flüssigkeitsschicht kontaktieren können. Nach ausreichend langer Zeit zum Absetzen und Anheften der Zellen kann dann die Zelleinfangvorrichtung 26 so umgedreht werden, daß die Zellen, die nicht spezifisch gebunden wurden, sich auf der umgekehrten Seite der Filme oder Platten 30 absetzen und an die Rezeptoren jener Seite binden können. Die Zelleinfangvorrichtung kann dann durch Einführen einer Waschlösung durch die Leitung 36 gewaschen werden, wobei deren Ablauf durch Leitung 40 erfolgt und dabei nicht- spezifisch gebundene Zellen entfernt werden.
Eine oder mehrere Behandlungslösungen oder Zellsuspensionen können dann zur zahlenmäßigen Erweiterung der eingefangenen Zellen, Aktivierung der eingefangenen Zellen, Abreicherung eines Subsets der eingefangenen Zellen, Einführung exogener Gene in die eingefangenen Zellen oder ähnliches eingeführt werden. Nach Beendigung der Behandlung kann dann das Gefäß zur Entfernung der Behandlungslösung, von Zelltrümmern oder ähnlichem nochmals gewaschen und ein geeignetes Medium zur Erhaltung der Lebensfähigkeit der gebundenen Zellen eingeführt werden. Die Zellen können dann durch Zugabe eines Mediums, enthaltend Interleukin-2 und ein Mitogen, oder durch Aufnehmen der Zelleinfangvorrichtung 26 und Einbringen in ein Ultraschallbad oder durch Unterziehen der Vorrichtung einer mechanischen Vibration oder kräftiger Pipettierung, freigesetzt werden. Nach kurzer Zeit einer derartigen physikalischen Behandlung oder unter relativ milden Schallvibrationen werden die eingefangenen Zellen freigesetzt und können dann abgeerntet werden.
Die folgenden Beispiele sollen zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung dienen.

EXPERIMENTELLER TEIL

I. Vorrichtung und Verfahrens-Validierung

A. Synthese von N-(Hydroxymethyl)-2-bromacetamid (HMBA) und Erzeugung der Bromacetamid-Polystyrol-Oberfläche (BA-PS)

HMBA wird mittels herkömmlicher Methoden (Leonard et al. J. Org. Chem. 50: 2480 (1985)) aus 2-Bromacetamid, wie aus handelsüblichen Quellen erhältlich, in Gegenwart von Formalin bei pH 10 synthetisiert, was eine Ausbeute am Ausgangs- Reaktionspartner N-(Hydroxymethyl)-2-bomacetamid (HMBA) von 93% ergibt.
Der zweite Schritt umfaßt die Erzeugung der Bromacetamid-Polystyrol-Oberfläche (BA-PS). Bei diesem Schritt werden 2 M Trifluormethansulfonsäure und 0,2 M HMBA, beide in Tetramethylensulfon (Sulfolan) im Verhältnis 1 : 1 in ausreichendem Volumen gemischt, um die innere Oberfläche eines zu aktivierenden Polystyrol- Gefäßes zu bedecken. Die Reaktion kann dann bei 27ºC 3 Stunden lang ablaufen. Die Reaktionslösung wird abgelassen, die Vorrichtung mit Wasser, gefolgt von Ethanol, gewaschen und die aktivierten Polystyrol-Kammern luftgetrocknet. Die resultierende Bromacetamid-Polystyrol-Oberfläche ist bei Raumluft sechs (6) Monate lang haltbar.

B. Herstellung, Stabilisierung und Sterilisierung der Zelleinfangvorrichtung

Der nächste Schritt besteht im Einfangen des Rezeptors (des monoklonalen Antikörpers, der kovalent an die Bromacetamid-Polystyrol-Oberfläche gebunden werden soll). Der monoklonale Antikörper von Interesse wird zu etwa 0,01-0,05 mg/ml in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, verdünnt. Das geeignete Volumen an verdünntem monoklonalen Antikörper wird in die Polystyrol-Kammer eingebracht und die Reaktion etwa 2 bis 20, bevorzugt etwa 2 bis 4 Stunden, bei 27ºC unter Rotation ablaufen gelassen. Der nach der Reaktion verbleibende Antikörper wird abgeschöpft und kann bis zu 10mal bei späteren Überzugsreaktionen wiederverwendet werden.
Die Vorrichtung mit gebundenem Antikörper wird daraufhin 10mal mit Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, gewaschen und die Oberfläche dann durch Zugabe von 2% Sucrose/0,2% humanem Serumalbumin (HSA) in medizinischer Güteklasse zu jeder Vorrichtung stabilisiert. Die Sucrose/Albuminlösung kann die Oberfläche bedecken, woraufhin die überschüssige Sucrose/HSA- Lösung abgeschöpft und die stabilisierten Polystyrol-Kammern 24-96 Stunden in einem Vakuum (< 0,10 Torr) bei 25ºC getrocknet wird. Nach dem Trocknen wird das Vakuum mit Trockenstickstoff gebrochen und die Vorrichtung mit inertem trockenen Gas gespült und dicht verdeckelt. Die Vorrichtung wird dann versiegelt und sterilisiert. Die Sterilisation erfolgt durch Bestrahlung mit 2,7 ± 0,2 Mega-Rad einer Elektronenstrahl- oder Gamma-Bestrahlung. Sterilitätstests ergaben, daß die Kolben nach einer 14tägigen in situ Medien-Inkubation steril waren.

C. Rezeptordichte an der Oberfläche der Zelleinfangvorrichtung

Eine Vielzahl von Oberflächen-funktionalisierenden Gruppen wurde verwendet und auf die Stabilität der Bindung der Antikörper an die Oberfläche getestet. Das Polystyrol wurde unter Verwendung von N-(Hydroxymethyl)-2-haloacetamid, wobei die Halogruppe in Chlor, Brom oder Iod bestand, Diazonium und Sulfonium funktionalisiert. Nach Anheftung der monoklonalen Antikörper unter Verwendung dieser Oberflächen wurden die Kolben jeweils 10mal mit PBS und einmal mit 1% SDS bei 55ºC über 14 Stunden hinweg gewaschen. Die Kunststoffoberfläche wurde dann auf die Radioaktivität der markierten monoklonalen Antikörper hin untersucht und die Ergebnisse als Oberflächendichte von monoklonalem Antikörper in ng/cm² ausgedrückt. Das Bromacetat weist eine Oberflächendichte von etwa 250 ng/cm² an Antikörper auf, also das 2,5fache dessen, was durch Adsorption an eine Immulon- 2TM-(Dynatek)-Oberfläche erzielt wird. Während das Bromacetamid die höchste Oberflächendichte erzielte, fielen die Oberflächendichten für die anderen Funktionalitäten auf zwischen 200 und etwa 240 ng/cm².

D. Stabilität des Rezeptors an der Einfangoberfläche

Die Stabilität der Antikörper-Bindung wurde durch Beschichten der Oberfläche mit 0,02 mg/ml an (³&sup5;S) humanem IgG bestimmt. Die Kolben wurden 5mal mit Borat- Carbonat-Puffer, dabei einmal mit Borat-Carbonat-Puffer über 8 Stunden hinweg und zweimal mit Borat-Carbonat-Waschgängen über Nacht gewaschen. Teilmengen jeder Waschflüssigkeit wurden sichergestellt und auf ihre Radioaktivität untersucht. Nach dem zweiten Waschgang lag keinerlei Befund eines Herauslösens des Antikörpers vor. Bei einer zweiten Untersuchung unter Verwendung eines ELISA- Assays für den an die Oberfläche gebundenen Antikörper ergaben die beobachteten Ergebnisse, daß die Menge an extrahierbarem Antikörper unter der Nachweisgrenze des Assays lag (7,7 ng/ml).

E. Dichte des Zelleinfangs durch die derivatisierte Polystyrol-Oberfläche

Da die Rezeptor-derivatisierte Polystyrol-Oberfläche ihre optische Klarheit beibehält, kann die Dichte der eingefangenen Zellen pro Einheit Fläche des derivatisierten Polystyrols durch direkte mikroskopische Sichtbarmachung berechnet werden. Bei den meisten Zelleinfang-Anwendungen nähert sich die Dichte der gebundenen Zellen der dichtestmöglichen Besetzung von Kugeln auf einer Monoschicht an. Bei Lymphozyten von Mäusen oder Menschen beträgt die Bindungsdichte 0,5 · 10&sup6; Zellen/cm² bis 1 · 10&sup6; Zellen/cm². In Abhängigkeit von Häufigkeit und Größe der Zielzelle in der zugeführten Zellsuspension kann die Dichte der gebundenen Zellen breit variieren, nämlich von 1 · 10³ Zellen/cm² bei großen, seltenen Zielzellen bis zu größer 10¹&sup0; Zellen/cm² bei kleinen, reichlich vorhandenen Zellen oder Partikeln wie Bakterien oder Viren.

F. Spezifität des Zelleinfangs durch die derivatisierte Polystyrol-Oberfläche

Die Zellbindung an die funktionalisierte Polystyrol-Oberfläche wird durch den an das Polystyrol gebundenen Rezeptor spezifisch bestimmt. Das folgende Experiment veranschaulicht die Spezifität der Zellbindung. Mononukleare Zellen wurden aus peripherem Blut mittels standardmäßiger histopaquer Zentrifugation präpariert und auf 3 · 10&sup6; Zellen/ml PBS verdünnt. Eine Teilmenge der Einsatzmenge wurde für die phänotypische Analyse mittels Durchflußzytometrie reserviert. Die Zellsuspension wurde T-25-Kolben zugegeben, die auf ihrer internen Bodenoberfläche gereinigte, monoklonale, durch das vorliegende Verfahren kovalent gebundene Antikörper mit einer Spezifität entweder für (1) Thy 1,2 (ein muriner T-Zell-Marker), (2) CD5, (3) CD8 oder (4) ein äquimolares Gemisch von CD8- und CD5-Antikörpern (humane T-Zell-Marker) enthielten. Die Zellen wurden 30 Min. lang inkubiert, dann leicht gerüttelt und weitere 30 Min. lang sich absetzen gelassen. Nicht-anhaftende Zellen (jene, die nicht an die Kolben-Oberfläche gebunden haben) wurden durch Abschöpfen rückgewonnen und Teilmengen für die Analyse der phänotypischen Zusammensetzung mittels Durchflußzytometrie reserviert. In allen Fällen, mit Ausnahme des Thy-1,2-Kolbens, in dem keine an den Kolben gebundenen Zellen beobachtbar waren, ergab die mikroskopische Untersuchung der Kolben eine konfluierende Zellbindung bei einer Dichte von 0,5 · 10&sup6; Zellen/cm². Die durchflußzytometrische Analyse wurde bei allen zugeführten und ablaufenden (nicht- anhaftenden) Zellpopulationen für die Marker CD5, CD8 (humane T-Zellen), CD14 (humane Monozyten), CD16 (humane NK-Zellen) und CD20 (humane B-Zellen) vorgenommen und die relativen Häufigkeiten dieser Marker im Zufuhr- und im Ablaufstrom für jeden Kolben verglichen. Die Ergebnisse zeigen keine Unterschiede zwischen Zufuhr- und Ablaufstrom des Thy-1,2-Kolbens. Die CD5- und CD8-Kolben zeigten jeweils eine Abreicherung an CD5- und CD8-Zellen von größer 98% im Ablauf, und der CD5/8-Kolben zeigte den gleichen Grad der Abreicherung an CD5- und CD8-Zellen wie sowohl der monospezifische CD5- als auch CD8-Kolben. Die Marker für Monozyten und NK-Zellen und B-Zellen zeigten eine relative Anreicherung im Ablauf, da sie nicht durch den Kolben eingefangen wurden. Diese Daten zeigen, daß (1) Zellen quantitativ und spezifisch durch die Zelleinfangvorrichtung eingefangen werden, (2) die funktionalisierte Oberfläche keine nicht- spezifische Zellbindung zeigt und (3) mehr als ein Zell-Phänotyp durch eine biderivatisierte Polystyrol-Oberfläche zur gleichen Zeit eingefangen werden kann.

G. Verfahren zur Zellrückgewinnung aus der Einfangvorrichtung

Zwei Methoden wurden zur Rückgewinnung der Zellen aus der Einfangvorrichtung angewandt. Beide ergeben eine quantitative Zellrückgewinnung, eine gute Lebensfähigkeit, die Abwesenheit monoklonaler Antikörper auf der Oberfläche der rückgewonnenen Zellen und die volle biologische Aktivität sowohl für die Replikation als auch die Funktion. Die erste Methode, genannt Lymphokin-Freisetzung, wurde mit CD8&spplus;-zytotoxischen T-Zellen, eingefangen aus normalem humanem peripherem Blut gemäß des oben beschriebenen vorliegenden Verfahrens, getestet. Nach Abschöpfen der nicht-anhaftenden Zellen und Verifizieren der konfluierenden Bindung mittels mikroskopischer Untersuchung wurden standardmäßige Gewebekulturmedien, ergänzt mit rekombinantem IL-2 (300 Einheiten/ml) (gewöhnlich zwischen 20 und 1000 Einheiten/ml) und Phytohämagglutinin (PHA:Gibco 0,1 mg/ml) (gewöhnlich zwischen 0,1 und 5,0 mg/ml) zugegeben. Nach 48 bis 72 Stunden in Kultur lösen sich die eingefangenen CD8&spplus;-Zellen spontan vom Kolben, wobei alle monoklonalen Antikörper in kovalenter Bindung an die Polystyrol-Oberfläche zurückbleiben.
Mittels durchflußzytometrischer Analyse unter Verwendung fluoresceinierter Anti- Maus-Antikörper wurde gezeigt, daß die eingefangenen CD8&spplus;-Zellen frei von Oberflächen-gebundenem monoklonalem Antikörper waren. Keine der freigesetzten CD8&spplus;-Zellen war für Oberflächen-Maus-IgG positiv. Weiterhin kann der Kolben zum Einfangen von Zellen wiederverwendet werden, indem er in PBS, das 4 M MgCl enthält, gewaschen wird, was die Einfang-Oberfläche regeneriert. Solche wiederverwendeten Kolben sind für 4-6 Durchgänge durchwegs funktionstüchtig, wonach das wiederholte Waschen die Aktivität des gebundenen Antikörpers vermindert. Ein weiterer Nachweis der Rückbehaltung der Antikörper durch die Polystyrol-Oberfläche wird durch in situ Polystyrol-Blotting-Untersuchungen geliefert, bei denen radiomarkierter Anti-Maus-Antikörper mit dem derivatisierten Polystyrol umgesetzt, kräftig gewaschen und die Oberfläche entweder durch Autoradiographie oder durch direkte Szintillationszählung analysiert wird. In beiden Experimentserien ist die Polystyrol-Oberfläche vollständig mit gebundenem monoklonalen Antikörper gesättigt, was auf die Rückhaltung des Antikörpers in der Vorrichtung hinweist.
Die abgelösten Zellen, wie durch Abschöpfen rückgewonnen, können in standardmäßigen Gewebekultur-Kammern, ergänzt mit IL-2 und Phytohämagglutinin, zahlenmäßig erweitert werden. Die Lebensfähigkeit wurde mittels Trypanblau- Ausschluß als größer 98% nachgewiesen, und die rückgewonnene, homogene Zellpopulation konnte innerhalb eines Zeitraums von etwa 10 Tagen um zwei Größenordnungen erweitert werden.
Das zweite Verfahren der Zellrückgewinnung, Ultraschall-Freisetzung genannt, verwendet ein Ultraschallbad (Crest Ultrasonics Model #H-4HT-1014-6) mit einem Output von 40 bis 90 kHz Schallabgabe (Hauptfrequenz bei 40 kHz), der gleichmäßig in einem Wasserbad mittels des Crest Vibra-bar verteilt ist. Das Netzgerät liefert 500 Watt bei 40 bis 90 kHz. Das Ultraschallbad weist einen Eintauchtank von 10 · 14 inches auf und faßt ein Volumen von 6 Gallonen Flüssigkeit, wobei für die Beschallung in den vorliegenden Untersuchungen ein Liter (0,5" vom Tankboden) eingefüllt wurde. Die Eintauchtanks sind in verschiedenen Größen im Handel erhältlich. Die die gebundenen Zeilen enthaltende Einfangvorrichtung wird in dem einen Liter Flüssigkeit im Ultraschallbad eingetaucht und die Stromzufuhr und Stromzufuhrdauer experimentell bestimmt. In Abhängigkeit vom Zell-Phänotyp variieren Zeiten und Leistungen: zum Beispiel CD4&spplus;-T-Zellen: 78% max. Leistung, 17 Sek.; CD8&spplus;-T-Zellen; 30% max. Leistung, 20 Sek.; Leu 19 Zellen: 75% max. Leistung, 10 Sek. etc.
Um zu zeigen, daß die durch Ultraschall rückgewonnenen Zellen nach wie vor lebensfähig waren und ihre physiologische Aktivität beibehielten, wurden CD16&spplus;-NK- Zellen durch Beschallung bei maximaler Leistung über 15 bis 20 Sekunden hinweg rückgewonnen. Die durch Beschallung rückgewonnenen Zellen (1) waren gemäß des Trypanblau-Ausschlusses zu mehr als 85% lebenfähig und (2) bei einem routinemäßig zur Quantifizierung der NK-Zellaktivität verwendeten lytischen Assay extrem aktiv. Unter Anwendung der durchflußzytometrischen Analyse wurden die durch Beschallung rückgewonnenen Zellen als frei von monoklonalem Antikörper nachgewiesen, ebenso wie die durch die oben beschriebene Mitogen/Lymphokinangetriebene Methode rückgewonnenen Zellen. Bei den mittels beider Methoden rückgewonnenen Zellen bleibt aber der Antikörper zurück, wenn die Zellen rückgewonnen werden, wodurch lebenfähige, homogene, voll funktionelle Zellen zur Verfügung stehen, die frei von monoklonalem Antikörper sind.

H. Phänotypische Homogenität der freigesetzten Zellen

Die zuvorige (Abschnitt F) Analyse der Zufuhr- und Ablauf-(nicht-eingefangenen)- Zell-Phänotypen zeigt, daß die Zellbindung mittels der Zelleinfangvorrichtung durch die kovalent an die Einfangvorrichtung gebundenen monoklonalen Antikörper spezifiziert ist. In diesem Abschnitt werden Daten zur Bestätigung und Erweiterung dieser Befunde durch Analysieren mittels Durchflußzytometrie der aus der Vorrichtung durch Lymphokin-Freisetzung rückgewonnenen Zellen präsentiert. Die mononuklearen Zellen aus dem peripheren Blut gesunder Freiwilliger wurden mittels standardmäßiger histopaquer Zentrifugation wie beschrieben präpariert und bei einer Konzentration von 3 · 10&sup6; Zellen/ml PBS in Zelleinfangvorrichtungen eingeführt, die entweder CD8- oder CD4-monoklonale Antikörper enthielten, die kovalent an die innere Oberfläche gebunden waren. Nach standardmäßiger Inkubation und Abschöpfung der nicht-anhaftenden Zellen wurden die eingefangenen Zellen durch 48stündige Inkubation mit IL-2 und PHA, wie in Abschnitt G beschrieben, rückgewonnen. Die rückgewonnenen Zellen wurden dann mittels Durchflußzytometrie phänotypisiert und in standardmäßigen Kulturmedien, ergänzt mit IL-2 und PHA, gezüchtet. Teilmengen der Zellen wurden periodisch über 6 bis 25 Tage in Kultur für durchflußzytometrische Analysen als Proben genommen. Die Daten ergaben eine Homogenität von größer 95% für CD4&spplus;- und CD8&spplus;-Oberflächenmarker auf rückgewonnenen Zellen aus den CD4- bzw. CD8-Vorrichtungen zum Zeitpunkt Null (sofort nach Rückgewinnung aus der Vorrichtung). Noch wichtiger ist, daß mit logarithmischem Wachstum der rückgewonnenen Zellen in Kultur ihre phänotypische Homogenität erhalten bleibt, wobei die Kulturen eine Reinheit von größer 95% bei CD4- bzw. CD8-Markern über den Kulturzeitraum von 6 bis 25 Tagen hinweg beibehalten. Die freigesetzten Zellen sind daher hinsichtlich ihres Phänotyps homogen, wobei die Homogenität in vitro während des logarithmischen Wachstums erhalten bleibt.

1. Zahlenmäßige Erweiterung der freigesetzten Zellen

Durch Lymphokin-Antrieb aus einer CD8-Einfangvorrichtung unter Verwendung mononuklearer Zellen aus humanem peripherem Blut von sechs (6) verschiedenen Personen rückgewonnene CD8&spplus;-Zellen wurden in standardmäßigen Kulturmedien, ergänzt mit IL-2 und PHA (300 Einheiten/ml bzw. 0,1 ug/ml) in standardmäßigen Kulturgefäßen in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC gezüchtet. Die Zellen wurden auf ihre Lebensfähigkeit mittels Trypanblau-Ausschluß geprüft und die Zellzahl durch periodische Hämozytometer-Zählung über 25 Kulturtage hinweg gezählt. Die Zellen jeder Person wurden von den anderen separat gehalten. Die Daten zeigen eine Lebensfähigkeit der Zellen von größer 95% und einen 2-Log- Anstieg der Zellzahl über 20 Tage hinweg. Diese Daten belegen die Fähigkeit der aus der Einfangvorrichtung rückgewonnenen Zellen zum zahlenmäßigen exponentiellen Wachstum in standardmäßiger Gewebekultur.

J. Induktion der Vermehrung rückgewonnener Zellen durch immobilisierte CD3-monoklonale Antikörper

Bei dieser Untersuchung wurden aus peripherem Blut von Freiwilligen geerntete CD8&spplus;-Zellen in der vorliegenden Vorrichtung, enthaltend CD8-Antikörper, eingefangen und durch Lymphokin-Antrieb rückgewonnen. Die rückgewonnenen Zellen wurden dann entweder in standardmäßigen Gewebekultur-Kolben unter Verwendung eines standardmäßigen Gewebekulturmediums, ergänzt mit rekombinantem IL-2 und PHA, kultiviert oder in der vorliegenden Vorrichtung mit kovalent gebundenem Anti- CD3-monoklonalem Antikörper unter Verwendung eines standardmäßigen Mediums ohne Ergänzung mit rekombinantem IL-2 oder PHA gezüchtet. Es wurden Duplikat- Kolben mit dem Anti-CD3-monoklonalen Antikörper verwendet. Zum Zeitpunkt Null wurden gleiche Anzahlen von Zellen jeweils in Kolben A, B und C eingebracht (A = standardmäßiger Gewebekulturkolben mit IL-2/PHA-ergänzten Medien; B und C = CD3 in vorliegender Vorrichtung ohne IL-2 oder PHA). Nach fünf Tagen in Kultur wurde jede Kultur in zwei Teilmengen aufgeteilt und nochmals in identischen Kolben unter identischen Kulturbedingungen aufplattiert. Die Zellen wurden dann am Tag 9 nochmals gezählt, was Erweiterungen um das folgende Vielfache zwischen den Tagen 5 und 9 ergab: A: 2,7; B: 2,55; C: 6,75. Kontrollkulturen, bei denen CD8&spplus;-Zellen in standardmäßigen Gewebekulturgefäßen ohne IL-2 oder PHA-Ergänzung kultiviert wurden, vermehrten sich überhaupt nicht. Folglich wurde eine Zellerweiterung beim gleichen oder größeren Vielfachen unter Verwendung immobilisierter Anti-CD3- Antikörper und der vorliegenden Vorrichtung im Vergleich zu IL-2/PHA-ergänzten Medien in einem standardmäßigen Gewebekultur-Kolben erzielt. Diese Daten zeigen, daß durch Immobilisieren eines T-Zell-aktivierenden monoklonalen Antikörpers (CD3) an der Polystyrol-Oberfläche gemäß des vorliegenden Verfahrens eine T-Zell-Aktivierung/Vermehrung durch den immobilisierten monoklonalen Antikörper in Abwesenheit löslicher Aktivierungsfaktoren (IL-2/PHA) im Kulturmedium erzielt werden kann.

II. SPEZIFISCHE BEISPIELE

A. Knochenmarktransplantation

Bei diesem ersten Beispiel wird die T-Zell-Abreicherung für die Knochenmarktransplantation veranschaulicht. Die Daten belegen, daß die im Knochenmarkmaterial vorhandenen CD5&spplus;- und CD8&spplus;-T-Zellen eine Transplantat-Wirt-Reaktion hervorrufen. Eine wie oben beschriebene Vorrichtung wurde unter Verwendung monoklonaler Antikörper zu CD5- und CD8-positiven humanen T-Zellen präpariert. Teilmengen des aus normalen Freiwilligen erhaltenen Knochenmarks wurde in eine vorliegende Vorrichtung eingebracht und die Zellen wie beschrieben inkubiert. Die nicht- anhaftenden Zellen wurden rückgewonnen, phänotypisiert und in vitro-Kulturen zur Quantifizierung der Anreicherung von Vorläuferzellen im Vergleich zu zugeführtem nicht-fraktioniertem Mark unterzogen. Die folgenden Tabellen zeigen typische Ergebnisse. TABELLE 1 Abreicherung von T-Zellen (% Abreicherung der Zufuhr) TABELLE 2 Anreicherung der Vorläufer (% Anreicherung gegenüber Zufuhr)
CFU-EU = Kolonie-bildende Einheiten, erythroide Einheiten
BFU-E = Spaltungs-erzeugende Einheiten, erythroid
CFU-GM = Kolonie-bildende Einheiten, Granulozyt-Monozyt
CFU-M = Kolonie-bildende Einheiten, Monozyt
CFU-G = Kolonie-bildende Einheiten, Granulozyt
Die Daten in den Tabellen zeigen die spezifische Abreicherung von CD5&spplus;- und CD8&spplus;- Zellen (CD14&spplus;, CD16&spplus;-Zellen sind angereichert, CD19&spplus;-Zellen sind unverändert) und eine 2-6fache Anreicherung der Vorläuferzellen. Diese Daten veranschaulichen die Verwendung des vorliegenden Verfahrens zur spezifischen Abreicherung von Zellen, die eine Transplantat-Wirt-Reaktion verursachen, bei gleichzeitiger Anreicherung der erwünschten Vorläuferzellen.
Beim zweiten Beispiel der Anwendungen für Knochenmarktransplantationen wird die Fähigkeit der vorliegenden Vorrichtung zum Auskonzentrieren einer bestimmten seltenen Zellpopulation in einem Zellgemisch aus Knochenmark oder peripherem Blut gezeigt. Die zu konzentrierenden Zellen sind Vorläufer-Stammzellen aus humanem Knochenmark. In diesem Beispiel enthält die vorliegende Vorrichtung einen kovalent an die Polystyrol-Oberfläche gebundenen monoklonalen CD34- Antikörper. Im ersten Falle dieses Beispiels wurden Proben von humanem Knochenmark in die CD34-Vorrichtung eingebracht, die Zellen wie beschrieben inkubiert, die nicht-anhaftenden Zellen durch Abschöpfen rückgewonnen und die eingefangenen Zellen durch Beschallung rückgewonnen. Die drei Fraktionen zugeführte, anhaftende und nicht-anhaftende Zellen wurden gemäß des standardmäßigen Assays für Vorläuferzellen auf CFU-C untersucht. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse.

TABELLE 3

CFU-C/25.000 Zellen

Zugeführte Zellen 3
Nicht-anhaftende Zellen 0
Anhaftende Zellen 44
Die Daten ergeben einen 15fachen Anstieg bei den Vorläuferzellen, wie durch die vorliegende Vorrichtung und das vorliegende Verfahren der Zellrückgewinnung durch Beschallung erzielt.
Im zweiten Falle dieses Beispiels wurden mononukleare Zellen aus peripherem Blut in eine andere CD34-Vorrichtung eingebracht. Die nicht-anhaftenden Zellen wurden durch Abschöpfen rückgewonnen, die anhaftenden Zellen wurden nochmals durch Beschallen rückgewonnen. Teilmengen der zugeführten und der anhaftenden Zellen wurden auf den CD34&spplus;-Phänotyp analysiert. Die zugeführten Zellen waren zu weniger als 0,1% positiv für CD34&spplus;-Zellen. Die durch Beschallung rückgewonnenen anhaftenden Zellen waren zu 15% CD34&spplus;-positiv, was die Nützlichkeit der vorliegenden Vorrichtung und Methode zur Rückgewinnung lebensfähiger Vorläuferzellen aus peripherem Blut aufzeigt.

B. Antivirale zelluläre Therapie, z. B. bei AIDS

Im nächsten Beispiel wird ein Verfahren zur Behandlung einer Virusinfektion, z. B. AIDS, veranschaulicht. Die Methode besteht darin, CD8&spplus;-Zellen durch Einfangen CD8&spplus;-zytotoxischer T-Zellen aus den mononuklearen Zellen des peripheren Bluts zu erweitern. Die eingefangenen CD8&spplus;-Zellen werden dann durch eine kurze Kultivierung in Medium, enthaltend ein Lektin und rekombinantes IL-2 (Lymphokin- Antrieb), gefolgt von Erweitern der abgelösten Zellen in standardmäßigen Gewebekulturgefäßen über 14 bis 28 Tage hinweg, vor dem endgültigen Waschen und Einsammeln zur Reinfusion in den Patienten des Ursprungs rückgewonnen.
Spezifisch gesagt wurden humane mononukleare Zellen aus peripherem Blut (PBMC), konzentriert mit Ficoll-Hypaque, in einen T-150-Polystyrol-Kolben mit einem kovalent daran gebundenen Anti-CD8-monoklonalen Antikörper eingeführt. Nach einer Stunde der Inkubation wurde das Blut abgeschöpft und das Gewebekulturmedium mit IL-2 (300 Einheiten/ml) und PHA (0,1 ug/ml) ergänzt. Nach 48 bis 72 Stunden der Kultur lösen sich die CD8&spplus;-Zellen spontan vom Kolben, wobei sie die Antikörper in kovalenter Bindung an die Polystyrol-Oberfläche zurücklassen, wie durch durchflußzytometrische Analyse nachgewiesen, die die Abwesenheit monoklonaler Antikörper an der Oberfläche der abgelösten Zellen zeigt. Die abgelösten Zellen werden dann in standardmäßigen Gewebekultur-Kammern, ergänzt mit IL-2 und PHA, wie oben erweitert.
Die Analyse durch Durchflußzytometrie ergab, daß die Population zu 100% positiv für CD3- und zu 98% positiv für CD8-Zelloberflächenmarker war. Der Phänotyp der eingefangenen Zellen stimmt mit der für zytotoxische Lymphozyten, die den CD8&spplus;- Oberflächenmarker tragen, berichteten Beschreibung überein.
Bei eingefangenen CD8&spplus;-Zellen sechs gesunder Spender wurde das logarithmische Wachstum bei bis zu 15 bis 36 Tagen in Kultur mit den II-2 und PHA enthaltenden Medien gezeigt. Die Analyse der Zellen während des Wachstums an den Tagen 7, 10, 15 und 25 zeigt, daß der CD3&spplus;, CD8&spplus;-Phänotyp während der gesamten 25tägigen Erweiterung persistierend (zu mehr als 98% positiv) war. In einem Lektinabhängigen zellulären Zytotoxizitäts-Assay unter Verwendung von Concanavalin A- beschichteten CEM-Zellen wurde die gesammelte lytische Aktivität der Zellen von fünf verschiedenen normalen Spendern bestimmt. Eine beträchtliche Lyse wurde bei Effektor-zu-Ziel-Verhältnissen im Bereich von 2,5 bis 10 beobachtet. Eben diese CD8&spplus;-Zellen zeigen nach der Erweiterung keine Lyse des normalen autologen PBMC von gesunden Spendern. Daher weisen diese Zellen eine normale zytotoxische Aktivität für geeignete Zielzellen bei gleichzeitigem Fehlen einer autoimmunzytotoxischen Aktivität auf.
Diese Zellen wurden zur Bestimmung von möglicherweise vollzogenen Veränderungen, was sie für einen Immunangriff durch autologe PBMCs anfällig machen könnte, untersucht. Die Ergebnisse zweier Experimente mit verschiedenen Spendern, bei denen die Spender-PBMC-Antwort auf Chrom-markierte selbst- und nicht-selbst-CD8-Zellen untersucht wurde, ergaben, daß eine Lyse nur bei nicht- selbst-CD8&spplus;-Zellen nach in vitro-Priming mit nicht-markierten, nicht-selbst-CD8&spplus;- Zellen auftrat. Folglich vollziehen die CD8&spplus;-Zellen keine Veränderungen beim Oberflächen-Phänotyp, die sie nach Reinfusion in den Patient des Ursprungs zu Zielen für einen Autoimmun-Prozeß machen würde.
Es wurde gezeigt, daß diese Zellen eine Antigen spezifische, auf MHC-beschränkte zytolytische Aktivität nach der Isolierung und Erweiterung beibehalten. Die CD8&spplus;- Zellen wurden von EBV-(Epstein-Barr-Virus)-positiven gesunden Spendern geerntet und auf ihre spezifische Zytotoxizität gegen Chrom-markierte, EBV-infizierte, Mitomycin-C-behandelte, autologe B-Zellen getestet. Während der Kokultivierung wurden reduzierte Dosen des IL-2 dem Medium zugegeben, um eine selektive Erweiterung der CD8&spplus;-Zellen mit spezifischer Reaktivität gegen EBV-infizierte, MHC- beschränkte, autologe B-Zellen zu ermöglichen. Das Protokoll für diesen Assay umfaßte eine Kontrolle, bei der CD8&spplus;-Zellen gezüchtet, doch nicht geprimt und dann dem Chrom-Freisetzungs-Assay am Tag 9 und folgenden unterzogen wurde. Das Experiment umfaßte: (1) Eine Teilmenge der dem Chrom-Freisetzungs-Assay am Tag 0 vor dem Priming unterzogenen Zellen, (2) eine andere, am Tag 0 geprimte, nochmals am Tag 7 geprimte Teilmenge, die dann dem Chrom-Freisetzungs-Assay am Tag 9 und folgenden unterzogen wird. Die Ergebnisse waren die folgenden: (1) CD8&spplus;-Zellen, die nicht den EBV-transformierten autologen B-Zellen ausgesetzt wurden, zeigten keine lytische Aktivität, (2) Kontrollkulturen unter Verwendung von CD8&spplus;-Zellen aus EBV-seronegativen gesunden Spendern zeigten, ob geprimt oder nicht geprimt, ebenfalls keine lytische Aktivität, (3) bei geprimten CD8&spplus;-Zellen aus EBV-seropositiven Spendern lag, bei Effektor:Ziel-Verhältnissen im Bereich von 3 bis 12,5, der prozentuale Anteil der spezifischen Lyse bei 25 bis etwa 45. Diese Ergebnisse zeigen, daß die geernteten und nach 14tägiger kalten Kultivierung erweiterten CD8&spplus;-Zellen eine Antigen spezifische, MHC-beschränkte, zelluläre Zytotoxizität zeigen, die für das antigene Milieu des Wirts geeignet ist.
Bei der nächsten Untersuchung wurden CD8&spplus;-Zellen von HIV-positiven Freiwilligen erhalten. Die Zellen wurden von Ficoll-Hypaque-PBMC wie oben beschrieben abgeerntet, mit einer CD8-Vorrichtung eingefangen und mittels Lymphokin- Freisetzung wie beschrieben rückgewonnen. Das logarithmische Wachstum über 18 Tage hinweg in Kultur bei einer Lebensfähigkeit von nahezu 100% wurde mit CD8&spplus;- Zellen von HIV-positiven Spendern erzielt. Der CD8&spplus;-Phänotyp blieb während der in vitro-Erweiterung im wesentlichen erhalten (zu mehr als 95% CD8-positiv). Diese Zellen zeigten eine geeignete Zytotoxizität gegenüber Lektin-beschichteten CEM- Zellen und zeigten keine NK-artige lytische Aktivität gegenüber K562-Zielen. Außerdem zeigten die CD8&spplus;-Zellen bei einem B-Zell-Immunglobulin-Syntheseassay keine Suppressor-Aktivität. Die Zellen werden nicht transformiert, weshalb sie konstant IL-2 benötigen, um in der Wachstumsphase zu bleiben. Die Zellen produzieren keinen HIV-Virus und sind nach dem Waschen frei von Lymphokin, PHA und monoklonalem Antikörper.
Die erweiterten CD8&spplus;-Zellen zeigten einen stabilen Phänotyp, eine normale lytische Aktivität, blieben Marker-frei für andere Zelltypen und waren zur zytolytischen Aktivität gegenüber entsprechenden Zielzellen in der Lage. Am wichtigsten war, daß diese CD8&spplus;-Zellen eine Hemmung der autologen HIV-Virus-Replikation in vitro zeigten. Dies wurde durch Kombinieren von mit HIV infizierten CD4&spplus;-Zellen mit autologen erweiterten CD8&spplus;-Zellen festgestellt. Eine vollständige Repression der HIV-Replikation wurde bei einem CD4 : CD-Verhältnis von nur 1 : 0,25 nach 7 Tagen erzielt. Es wurden verschiedene Zeiträume und verschiedene CD4 : CD8-Verhältnisse bei unterschiedlichen Spendern angewandt, doch war die HIV-Repression in allen Fällen im autologen Setting vollständig, das bis zu 35 Tage in Kultur dauerte (dem längsten getesteten Zeitraum).
Zusammenfassend zeigen diese Daten, daß CD8&spplus;-Zellen, wie aus PBMCs durch das vorliegende Verfahren eingefangen und durch Lymphokin-Antrieb rückgewonnen: (1) phänotypisch rein sind, (2) zum exponentiellen Wachstum in vitro in der Lage sind, (3) während des exponentiellen Wachstums phänotypisch stabil sind, (4) zur wirksamen, geeigneten zytotoxischen Aktivität in der Lage sind, (5) zur Repression der HIV-Replikation bei autologen CD4&spplus;-Zellen in der Lage sind, wenn die CD8&spplus;- Zellen aus HIV-seropositiven Spendern eingefangen werden, (6) im allgemeinen eine MHC- und Antigen beschränkte Zytotoxizität zeigen, (7) keine Autoreaktivität zeigen, (8) keine Auto-Erkennung zeigen, (9) keine Suppressor-Zellaktivität zeigen, (10) nicht transformiert werden, (11) kein HIV-Virus produzieren und (12) nach dem Waschen keine aus dem Kulturprozeß stammenden biologischen Reststoffe zurückbehalten. Diese Zellen eignen sich für eine Vielfalt therapeutischer Anwendungen, einschließlich bei AIDS, Zytomegalievirusinfektionen, EBV- Infektionen, Toxoplasmainfektionen etc. Außerdem zeigen die CD8&spplus;-Zellen, wenn mittels des vorliegenden Verfahrens aus Tumoren oder lymphoiden Homogenisaten von Krebspatienten isoliert, eine beträchtliche antikarzinogene Aktivität, wie im nächsten Beispiel gezeigt.

C. Tumor-infiltrierender Lymphozyt

Die durch enzymatische Verdauung von Tumoren oder lymphoiden Geweben aus Krebspatienten erhaltenen Zellsuspensionen wurden in Vorrichtungen eingebracht, die an die Oberfläche gebundene CD4- oder CD8-monoklonale Antikörper enthielten. Nach Einfangen der CD4&spplus;- oder CD8&spplus;-Zellen und deren Rückgewinnung entweder durch Beschallung oder durch Lymphokin-Antrieb wurde eine Lebens fähigkeit der rückgewonnenen Zellen von größer 98% und eine phänotypische Reinheit der CD4&spplus;- bzw. CD8&spplus;-Zellen von größer 95% nachgewiesen. In allen untersuchten Fällen wiesen entweder die gereinigten CD4&spplus;- oder die gereinigten CD8&spplus;-Zellen zumindest soviel autologe Tumor-Zytotoxizität auf wie die unseparierte Ausgangsgewebe-Suspension. Die gereinigte Population zeigte keine nicht- spezifische Abtötung allogenen Tumors. Die gereinigte Population war zum logarithmischen Wachstum, zur Beibehaltung der Lebensfähigkeit, der phänotypischen Homogenität und autologen Tumor-Zytotoxizität in der Lage. Der Phänotyp der zytotoxischen Zellen variierte innerhalb der Tumorarten, wobei CD8&spplus; bei Melanom und Plattenepithelkarzinom dominierte und CD4&spplus; bei hypernephroidem Nierenkarzinom dominierte.

D. Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK)

Im nächsten Beispiel wurden Anti-CD5-, Anti-CD14- und Anti-CD20-monoklonale Antikörper in den vorliegenden Vorrichtungen zur Abreicherung der PBMCs verwendet, um durch negative Selektion die NK-Zellen anzureichern. Es wurde gezeigt, daß die Antikörper zur Abreicherung des CD5&spplus;-Phänotyps um mehr als 98%, des CD14&spplus;-Phänotyps um mehr als 50% und des CD20&spplus;-Phänotyps um mehr als 90% in der Lage waren. Zum Erhalt von LAK-Zellen wurden 1,5 · 10&sup8; mononukleare Zellen in die Einfangvorrichtung, die CD5-monoklonale Antikörper enthielt, eingebracht. Nach 30minütiger Inkubation wurden die nicht-anhaftenden Zellen durch Abschöpfen rückgewonnen und in eine Vorrichtung umgefüllt, die kovalent gebundenen Anti-CD14-Antikörper enthielt. Nach Inkubation wurden die nicht- anhaftenden Zellen nochmals durch Abschöpfen rückgewonnen und in eine dritte Vorrichtung umgefüllt, die kovalent an die Oberfläche gebundene CD20-monoklonale Antikörper enthielt. Die Inkubation erfolgte nochmals über 30 Minuten hinweg bei Raumtemperatur. Die dritte Population nicht-anhaftender Zellen wurde dann in IL-2 über 48 bis 72 Stunden hinweg kultiviert und ihre lytische Aktivität in standardmäßigen 4stündigen Chrom-Freisetzungs-Assays unter Verwendung von K562 für die NK-Aktivität und COLO-205-Zellen für die LAK-Aktivität untersucht. Der prozentuale Anteil der spezifischen Lyse für verschiedene Effektor-zu-Ziel- Verhältnisse wurde bestimmt, wobei das Effektor-zu-Ziel-Verhältnis von 2,5 bis 20 variierte. Unter Verwendung von Zellen von mehreren verschiedenen normalen Spendern variierte die Erhöhung der LAK-Aktivität von 50% bis 300% gegenüber den unter identischen Bedingungen kultivierten zugeführten Zellen.
Die aus der vorliegenden Vorrichtung stammende Zellpopulation erwies sich als beträchtlich angereichert mit LAK-Vorläufern, nahezu frei von T- und B-Zellen und beträchtlich abgereichert von Monozyten. Der Ühänotyp des mittels der vorliegenden Vorrichtung ausgereinigten LAK-Vorläufers wurde als CD3&supmin;, CD16&spplus; und Leu19&spplus; festgestellt.
Die nächste Untersuchung richtete sich auf die Frage, ob die Aktivität der lytischen Einheit überproportional zur phänotypischen Anreicherung an NK-Zellen in den ausgereinigten Proben angestiegen war. Die lytischen Einheiten wurden für die zugeführten und die ausgereinigten Fraktionen pro 106 NK-Effektorzellen berechnet. Mit dem beschriebenen dreistufigen negativen Abreicherungsverfahren mit monoklonalen Antikörpern wird eine 2- bis 50fache Zunahme an lytischen Einheiten pro 10&sup6; NK-Effektorzellen erreicht. Dies zeigte, daß das Monozyten-, B-Zell, T-Zell- Abreicherungsprotokoll die Aktivität des lytischen Einheit um einen Faktor von 2 bis 50 erhöhte, ausgedrückt pro NK-Effektorzelle. Dieser Anstieg wird durch Entfernen der anderen Zellen bewirkt, die direkt oder indirekt hemmende Einflüsse auf die LAK- Aktivität ausüben. Siehe Nii, et al., Int. J. Cancer (1988) 41: 33-40; Hoyer, et al., Cancer Res. (1986) 46: 2834-2938. Diese Autoren berichten von einer Herabregulierung durch aktivierte autologe Monozyten der humanen Lymphokin-IL-2- aktivierten Killerzell-Aktivität. Das vorliegende Verfahren erzielte eine 90%ige Reduktion der Gesamtzellzahl, was zu Einsparungen bei den zur Durchführung der NK-Aktivierung erforderlichen Kulturmaterialien führt; und eine 2- bis 50-fache Verstärkung der lytischen Aktivität, wie auf pro-NK-Effektorzell-Basis ausgedrückt.
Die oben präsentierten Daten zeigen, daß die vorliegende Methodik die Wirksamkeit der IL-2/LAK-Therapie verbessert, die Kosten der Therapie senkt und die Toxizität des Verfahrens mindert, indem die Gesamtzahl an durch Leukapherese erhaltenen Zellen gesenkt wird, die zur Erzeugung der angezielten gesamtlytischen Aktivität zur Reinfusion nach IL-2-Aktivierung erforderlich sind.

E. Suppressor-Induktor-Zellen

Ähnlich den vorangegangenen Verfahrensweisen kann der monoklonale Antikörper 2H4, der an die Suppressor/Induktor-Zelle bindet, d. h. eine Zelle, die spezifische Suppressorzellen induziert, zur Ernte, Rückgewinnung, Aktivierung und Erweiterung der Suppressor/Induktor-Zellen für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen genutzt werden. Die Suppressor/Induktor-Zelle wird aus PBMCs positiv ausgewählt, aus der Einfangvorrichtung durch Beschallung rückgewonnen, zahlenmäßig erweitert und aktiviert gemäß der bisherigen Verfahrensweisen. Diese erweiterten und aktivierten Suppressor/Induktor-Zellen können dann dem Patienten des Ursprungs mit der vorliegenden Autoimmunerkrankung reinfundiert werden, was eine geeignete Induktion der Suppressorzellaktivität für die Pathophysiologie des Patienten ergibt.
Die obigen Ergebnisse belegen die Leistungsfähigkeit der vorliegenden Vorrichtung und des Verfahrens in der Isolierung einer breiten Vielfalt von Zellen mit verschiedenen Oberflächenmarkern. Die Verfahrensweisen sind in Forschung, Diagnostik und Therapie anwendbar. Darüber hinaus erlaubt das Verfahren das Einfangen, Erweitern und Aktivieren von Zellen bei gleichzeitiger Erhaltung eines sehr hohen Prozentsatzes an lebensfähigen Zellen. Außerdem können antigene Komponenten aus Blut oder Gewebe des Patienten entnommen werden, wie z. B. Immunkomplexe oder Tumorzellen oder normales Gewebe, und zur Aktivierung oder Inaktivierung spezifischer Reaktionen auf ein Antigen oder eine Zelle verwendet werden. Auf diese Weise können Zellreaktionen auf eine breite Vielfalt von Erkrankungen bereitgestellt werden, einschließlich: genetischer Erkrankungen, wobei Stammzellen zur Modifikation ihres Phänotyps transfiziert werden können; Autoimmunerkrankungen, wobei Suppressorzellen zur Unterdrückung einer Immunantwort eingesetzt werden können; Krebs- und Viruserkrankungen, wobei Killerzellen zu deren Behandlung eingesetzt werden können; und durch Pathogene bewirkte Erkrankungen, wobei Helfer- und B-Zellen zur Abwehr einer breiten Vielfalt von Pathogenen verwendet werden können.
Alle in dieser Beschreibung zitierten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind hierin durch Bezugnahme so mitaufgenommen, als ob jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und einzelnen als durch Bezugnahme mitaufgenommen genannt worden wäre.
Obschon die vorangegangene Erfindung durch Veranschaulichung und Beispiele zu Zwecken eines klaren Verständnisses in einiger Ausführlichkeit beschrieben wurde, so wird es für die Fachleute des Bereichs im Lichte der Lehren dieser Erfindung jedoch leicht erkennbar sein, daß gewisse Veränderungen und Abwandlungen daran vorgenommen werden können.

Claims

1. Verfahren zum Ändern der zellulären Zusammensetzung eines Zellgemischs, welches Verfahren das Durchleiten der Flüssigkeit durch eine Zelleinfangvorrichtung in derartiger Weise umfaßt, daß die Zellen mindestens eine interne flache Polystyrol-Oberfläche der Vorrichtung, bei der es sich um eine Platte, Faser, Behälterwand oder Zwischenwand handelt, kontaktieren, wobei die Oberfläche an mindestens einen Rezeptor kovalent gebunden hat, der für mindestens einen Liganden spezifisch ist, der auf zumindest einem Teil der Zellen in der Flüssigkeit vorhanden ist, über einen ausreichend langen Zeitraum hinweg, daß Zellen, die diesen Liganden enthalten, spezifisch an die Oberfläche binden; und

Entfernen der Zellen, die nicht spezifisch gebunden sind, ohne im wesentlichen spezifisch gebundene Zellen zu zerstören.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Faser eine Hohlfaser ist und/oder die Zusammensetzung eine physiologische Flüssigkeit umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, außerdem umfassend, nach dem Entfernungsschritt, die Freisetzung der gebundenen Zellen, im wesentlichen in Rezeptor-freier Form, um eine Zusammensetzung der spezifisch gebundenen Zellen zu erhalten.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Freisetzung mittels eines physikalischen Verfahrens oder durch Behandeln mit einem Interleukin, Wachstumsfaktor und/oder einem Mitogen erfolgt.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zellen hämopoetische Zellen sind.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, außerdem umfassend das Zusammenbringen der spezifisch gebundenen Zellen, wahlweise frei von den nicht spezifisch gebundenen Zellen, mit mindestens einem von einem Aktivierungsmittel, einem Antigen, einer zum Binden an ein Oberflächenprotein der gebundenen Zelle fähigen Zelle, einem Immunkomplex, einem Mitogen, einem Transfektionsvektor, einem aktivierenden Antikörper oder einem zytotoxischen Mittel.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung bei der Herstellung einer therapeutischen zellulären Zusammensetzung zur Behandlung von Patienten, wobei die Rezeptoren monoklonale Antikörper umfassen.

8. Verfahren nach Anspruch 6, außerdem umfassend das Erweitern der Population der spezifisch gebundenen Zellen.

9. Verfahren zum Erhalt einer therapeutischen zellulären Zusammensetzung, umfassend spezifisch gebundene Zellen, die im wesentlichen frei von Rezeptor sind, wobei das Verfahren ein Verfahren nach Anspruch 1 und das Freisetzen von solchen Zellen, die an die Oberfläche gebunden haben, welche kovalent gebundene Rezeptoren enthält, die für mindestens einen auf den spezifisch gebundenen Zellen vorhandenen Liganden spezifisch sind, von dieser Oberfläche umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Freisetzung durch Beschallung erfolgt oder das Behandeln mit einem Interleukin, Wachstumsfaktor und/oder einem Mitogen umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 9, außerdem umfassend das Erweitern der Population der spezifisch gebundenen Zellen.

12. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Rezeptoren monoklonale Antikörper umfassen.

13. Verfahren nach Anspruch 7 oder 12, wobei die therapeutische zelluläre Zusammensetzung zur Verwendung bei Knochenmarkstransplantationen geeignet ist,

das Zellgemisch Knochenmarkzellen eines Knochenmarkspenders umfaßt; und

die monoklonalen Antikörper für CD8 und/oder CD5 spezifisch sind.

14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Antikörper für CD8 und CD5 spezifisch sind.

15. Verfahren nach Anspruch 7 oder 12, wobei die therapeutische zelluläre Zusammensetzung zur Verwendung bei Transplantationen geeignet ist,

das Zellgemisch peripheres Blut oder Knochenmark umfaßt; und

die monoklonalen Antikörper für CD34 spezifisch sind.

16. Verfahren nach Anspruch 7 oder 12, wobei die therapeutische zelluläre Zusammensetzung zur Verwendung in der Gentherapie geeignet ist,

das Zellgemisch peripheres Blut oder Knochenmark umfaßt; und

die monoklonalen Antikörper für CD34 spezifisch sind.

17. Verfahren nach Anspruch 7 oder 12, wobei die therapeutische zelluläre Zusammensetzung zur Behandlung eines mit einem Virus infizierten Patienten geeignet ist,

das Zellgemisch eine Zusammensetzung aus mononuklearen Zellen des peripheren Blutes ist; und

die monoklonalen Antikörper für CD8 spezifisch sind.

18. Verfahren nach Anspruch 7 oder 12, wobei die therapeutische zelluläre Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten mit einem Neoplasma geeignet ist,

das Zellgemisch eine Tumor- oder lymphoide Zell- oder Gewebe-Suspension von einem Patienten mit einem Neoplasma umfaßt; und

die monoklonalen Antikörper für CD8 oder CD4 spezifisch sind.

19. Verfahren nach Anspruch 7 oder 12, wobei die therapeutische zelluläre Zusammensetzung Lymphokin-aktivierte Killerzellen umfaßt,

das Zellgemisch monoklonale Zellen des peripheren Blutes umfaßt; und

die monoklonalen Antikörper für CD5, CD14 oder CD20 spezifisch sind.

20. Verfahren nach Anspruch 7 oder 12, wobei die therapeutische zelluläre Zusammensetzung zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung geeignet ist,

das Zellgemisch monoklonale Zellen des peripheren Blutes umfaßt; und

die monoklonalen Antikörper für Suppressor-induzierte Zellen spezifisch sind.