JPH0339088A - 細胞捕獲及び回収のための装置及び方法 - Google Patents

細胞捕獲及び回収のための装置及び方法

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JPH0339088A
JPH0339088A JP2039890A JP3989090A JPH0339088A JP H0339088 A JPH0339088 A JP H0339088A JP 2039890 A JP2039890 A JP 2039890A JP 3989090 A JP3989090 A JP 3989090A JP H0339088 A JPH0339088 A JP H0339088A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、細胞表面タンパク質に対する特異性を有する
装置を用いての細胞分離に関する。特に、その細胞源は
、血液、を髄液、骨髄、腫瘍ホモジネート、リンパ様組
織及び同様のものであろう。
〔背　景〕
細胞混合物から細胞の特定の種類を分離し、又は特定の
組の細胞を除くことに興味がある多くの情況が存在する
。これまで使用されて来た技法は、螢光細胞選別、磁気
免疫ビーズ、補体介在溶解、アフィニティクロマトグラ
フィー、遠心溶離及び細胞のポリスチレンバンニングを
包含する。実質的な密度の差異を有する細胞、たとえば
血小板と赤血球細胞とは、傾斜遠心分離方法により総合
的に分別され得る。しかしながら、同じ密度を有する哺
乳類細胞、たとえば腫瘍細胞、リンパ球サブセット、顆
粒球又は幹細胞は、それらの表現型と相互関係する表面
マーカーの分子認識を用いての分離形を必要とする。同
様に、分子機構は、複雑な混合物においてお互いからウ
ィルス及び細菌を分離するのに必要とされる。それぞれ
の前記方法は、多くの用途（細胞の特定のサブセットの
単離又は除去に興味がある）のために重大な欠点を有し
、選別された生存細胞の回収のための螢光活性化細胞選
別の欠点は、その工程の遅さ、単離された細胞が抗体に
より被覆される事実、及びその方法により得られる細胞
の制限された量である。
免疫ビーズに関しては、分離の後、ビーズから細胞を回
収することが難かしく；細胞は時々、抗体及び磁気ビー
ズにより被覆され、そして明確な分離を遠戚するのは難
かしい。補体介在溶解は、２つの理由のために問題があ
る：第１に、標的細胞の消耗が不完全であり、そして第
２に、非標的細胞が、補体及び標的細胞溶解の毒性副生
酸物への暴露により悪影響を受ける。たとえば抗体に結
合された５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０を用いての細胞の
アフイニティクロマトグラフィーは、標的細胞の良好で
ない回収及び不十分な消耗を有する。遠心溶離は、細胞
の異なった表現型サブ集団及び異なった大きさの細胞を
分離することができない。
ポリスチレン上に受動的に吸着された抗体を利用する、
Ｗｙｓｏｃｋｔ及び５ａｔｏ　、　ＰＮＡＳ　、　７５
　：　２８４４（１９７８）により開発された最後の方
法、すなわちバンニングは、特に不適切である。低い回
収率が遠戚され、そしてその方法は、特異性の欠除及び
分離された細胞の抗体による汚染を有する。
免疫防御システムが解明されるにつれて、細胞のサブセ
ットは、比較的狭い範囲の活性を有することがますます
明らかになって来た。従って、サブセットは、特定の疾
病、たとえば新形成、感染、ウィルスは細胞、等への応
答のために、移植への応答のために及び同様のために特
殊化され得る。
従って、それらの作用を理解するためだけではなく、ま
た予防及び治療目的のためにこれらの細胞を使用するた
めに、これらの細胞のサブセットを同定し、そして精製
することができることがひじょうに興味深い。所望する
結果を得るためには、所望する細胞のサブセットの実質
的に純粋な集団を得ることが必要である。さらに、それ
らの細胞は、（１）それらの表面上に抗体を有さす、（
２）生存しており、（３）それらの正常な機能を行なう
ことができ、そして（４）それらの通常の環境下で正常
な細胞と同じ態様で生物物質による活性化に対して敏感
であるべきである。
〔発明の要約〕
複製できる生物学的粒子、特にウィルス粒子及び細胞の
選択的捕獲及び開放のための方法、＆［ｌ酸物及び装置
が提供される。その粒子を含む培地が、高い密度の特異
的受容体部位を有する固体支持体と接触せしめられ、そ
れによって、その相補的リガンドを有する粒子が、その
表面に結合するようになる。生物学的物質が、リガンド
放出及び開放をもたらす生物学的活性化又は物理的手段
、たとえばピペット処理、機械的振動又は超音波処理の
いづれかにより受容体から開放され得る。細胞は数的に
拡張され、分化及び／又は活性化又は同様のもののため
に生物学的物質又は他の因子にゆだねられ、そして研究
、診断、予防及び／又は治療目的のために使用され得る
。
〔特定の態様の記載〕
生物学的に複製できる粒子、特に細胞の特別な集団を、
粒子の混合物から、１又は複数の特異的受容体の媒介体
を通して固体支持体に前記集団を結合せしめることによ
って単離するための方法、組成物及び装置が提供される
。場合によっては、次に、粒子は、集団サイズ及び／又
は捕獲された粒子の特徴に影響を及ぼすために種々の方
法で処理され得る。次に細胞は、受容体を実質的に有さ
ない支持体から開放され得る。
集取装置において支持体に結合される受容体と粒子の源
とを接触せしめる方法が関与し、ここで表面上の受容体
の集団が、対象のリガンドのために高い結合密度を提供
する。接触のための条件は、粒子の受容体への特異的な
結合を可能にするのに十分な時間及び低度の濁りである
。結合が十分な時間起った後、培地は除去され、そして
その表面は、非特異的に結合される粒子を除去するため
に洗浄される。粒子は、高い結合活性を有するために、
通常多くの部位で表面に結合されるので、洗浄は、すべ
ての非特異的結合粒子の実質的に完全な除去を確保する
ために相当に激しく行なわれ得る０次に、粒子は、広範
囲の種類の条件又は処理、通常１又は複数の試薬との接
触にゆだねられる。
場合によっては、次に、その試薬を含む培地が除去され
、そして粒子が受容体から開放される。開放は、マイト
ジェン剤及びリンホカインの組合せ又は物理的手段、た
とえばピペット処理、振動又は音波処理のいづれかによ
り達成され得る。次に、粒子が単離され、そしてそれら
の意図する目的のために使用され得る。
大部分、細胞の混合物が使用され、そして従って、残る
論議は細胞に向けられるであろう。しかしながら、同じ
方法がウィルス及び細菌粒子の単離のために実質的に使
用され得、そして細胞に関しては、ウィルス及び細菌は
通常、それらのために交換され得ることが理解されるべ
きである。
本発明の装置は、多くの異なった情況で適用される。第
１は、生理学的流体から所望としない細胞を捕獲し、そ
して除去することを所望する情況であり、それによって
、医療、診断用途又は研究用途のために所望しない細胞
の流体を消費しつくす。これは、移植片対宿主疾患を減
じるために、一定のＴ−リンパ球の骨髄を消費しつくす
ことによって示される。所望しない細胞を消費しつくさ
れた骨髄は、骨髄受容体中への移植のためにすぐに調製
される。
第２の情況は、研究及び診断のために生理学的流体から
一定の細胞を捕獲し、そして回収することである０診断
適用は、捕獲及び続くその捕獲された、（１）血液又は
他の組織からの亜性細胞、（２）ウィルス又は細菌感染
の開孔類細胞、（３）生理学的流体からのウィルス又は
細菌又は寄生体自体、（４）血液からの核型分析のため
のヒト胎児細胞、（５）骨髄移植からの回復度の指数と
しての血液からの移植細胞、及び（６）活性化の状態を
示す特定の表面マーカー、たとえばＩＬ−２受容体の存
在による免疫コンピテント細胞の列挙及び説明を包含す
ることができる。研究のためには、（１）捕獲された細
胞の遺伝子分析又は変性、（２）特定の疾病過程により
活性化され又は抑制され得るある種の細胞の生理学の分
析及び変性及び（３）分子レベルで、特定の疾病の病原
に関与する細胞の表面膜組成分析及び変性に興味が存在
する。
第３の情況は、変性（活性化）のために生理学的流体か
ら細胞の捕獲及び再生及び所望する治療効果のために元
の患者への返還に存在する。その方法は、細胞捕獲及び
回収、数の拡張及び／又は生物学的活性化をもたらす、
その捕獲された細胞又は消耗された細胞集団の処理、及
び続くこれらの細胞の再生及び使用を包含する。
第３の情況は、３種のレベルの用途にさらに分けられ得
る。第１レベルは、捕獲され／回収された細胞自体の生
物学的活性化である。活性化は、細胞の追加の分別なし
に行なわれる。たとえば、ＡＩＤＳ患者の場合、末梢血
液から捕獲されたＣＤ８陽性細胞が、元の患者に戻すた
めに拡張され、そして活性化され得る。第２レベルは、
選択的活性化である。捕獲され、そして回収された細胞
は、捕獲された細胞のサブセットを得るためにさらに処
理され又は分別され、たとえば抗原特異性により同定さ
れ、そして次に活性化され、モして／又は拡張される。
たとえば、捕獲されたＣＤ８陽性細胞のある抗原制限サ
ブセットは、所望するサブセットの拡張及び活性化を単
に可能にする、ある同時培養条件及びリンホカインの濃
度により選択され得る。第３レベルは、免疫機能の活性
化又は抑制のために抗原特異的患者のユニーク細胞の−
（７ビトロでの生成である。典型的なこの情況は、単球
又はＢ−細胞の捕獲及びその捕獲された単球又はＢ−細
胞の、単球又はＢ−細胞抗原摂取、プロセッシング、及
び高められた表面ＭＭＣ発現と共にそれらの表示を高め
る条件下での患者特異的免疫複合体又は他の抗原への暴
露である。次に、抗原−感作単球又はＢ−細胞と相互作
用せしめるために、同じ患者から捕獲されたエフェクタ
ーのサブセット又は調節細胞が添加される。抗原特異的
Ｔ−細胞活性化の過程は、損われていない動物又はヒト
のリンパ節に生じる態様で、多く生じるであろう。本発
明の方法により可能にされた細胞変性の追加の例は、ウ
ィルス又は他のベクター又は他の手段による外因性遺伝
子のその捕獲された細胞への導入及びその外因性遺伝子
を発現する細胞のサブ集団の第２装置における続く捕獲
である。
細胞源は、いづれか細胞の混合物であり得る。
しかしながら、単一又は複数マーカー又は多くのマーカ
ー又はリガンドにより定義され得る予定された集団を有
することが所望される。動物宿主からの対象の細胞源は
、器官、たとえば血液、脳、腎臓、牌臓、心臓、腸、骨
髄、を髄液、リンパ様組織、又は同様のもの、又は上記
器官のいづれかからの腫瘍細胞を包含する。他の源は、
動物細胞と混合される寄生体、ウィルス又は細菌である
。
細胞は、流動形、便利には分散液として使用される。細
胞が、血液中におけるように、−緒に保持されない場合
、血液は通常、白血球細胞の混合物を得るために除去さ
れる赤血球細胞、血小板及び血漿を有するであろう、細
胞が、膜性物質又は他の結合物質により一緒に保持され
る場合、その細胞は、従来の技法に従って、機械的に又
は酵素的に分散され得る０次に、個々の細胞が、本発明
の方法による分離のためにそれらの適切な栄養培地に分
散され得る。
血液に関して、赤血球細胞は凝集により除去され、塩化
アンモニウムにより溶解され、レクチン又は既知の方法
による遠心分離により除去され得る。血小板及び赤血球
細胞はまた、Ｆｉｃｏｌｌ又はＬｅｕｋｏｐｒｅｐを用
い、そしてバッフイーコートを分離するグラジェント密
度遠心分離により、遠心分離により又は同様の方法によ
り除去され得る。
種々の細胞源が、上記処理の他に、種々の処理にかけら
れ得る。いくつかの情況においては、細胞を、いづれか
便利な手段により濃縮し、続いて適切な栄養培地に分散
することが所望される。ある情況においては、特定の集
団を拡張することが所望され、ここで細胞の１つのグル
ープを、細胞の他のグループに対して選択的に拡張する
ことができる。拡張のためには、種々のマイトジェン剤
、又はインターロイキン、増殖因子又は同様のものが使
用され得る０次に、これらの細胞は通常、それらが単離
され又は維持されて来た培地を実質的に除くためにいづ
れか便利な手段により濃縮されるであろう。通常、これ
らの細胞は、流動性分散物を提供するために、少なくと
も約１０体積％〜約９０体積％の使用されるべき分散体
を含んで成るであろう、装置中に導入される細胞の濃度
は、便利には、誘導体化されたポリスチレン表面の表面
積に基づかれ、そして投入細胞懸濁液中における標的細
胞の頻度に依存して広く異なるであろう０通常、その濃
度は、少なくともｌＸｌ０’個の細胞／ｄ〜ｌＸｌ０”
個の細胞／ｄ、通常約ｌＸｌ０’個の細胞／　ｃｄ〜ｌ
Ｘｌ０’個の細胞／ｃ′Ｉｉであろう。
分離装置は、広範囲の種類の形をとることができる。大
部分、装置は、ひじょうに滑らかな表面を有するように
、好ましくは成形又は押出されたポリスチレン表面から
戒り、ここで前記ポリスチレンは、約０．５％以下、通
常約０．１％以下の架橋、好ましくは実質的に架橋を有
さない、この性質のポリスチレン表面は、誘導体化の実
質的な均等性を可能にし、ここで受容体の配向は、結合
部位の高いレベルの接近性を提供する。受容体に関して
、その用語はまったく任意であることが理解されるべき
である。受容体は、相補的分子に特異的に結合すること
ができる分子に向けられる。従って、本発明の目的のた
めには、受容体は、ヘプテン及び抗原の両者を含むリガ
ンド、又は他の分子に特異的に結合する表面膜タンパク
質、たとえば免疫グロブリン、Ｔ−細胞受容体、インシ
ュリン受容体、等、又は細胞内に見出される分子、たと
えばステロイド結合タンパク質、又は体液中に見出され
る分子、たとえばチロキシン結合グロブリン、リポタン
パク質、等である。従って、表面結合“°受容体”に特
異的に結合する膜タンパク質は、“リガンド”として（
モ意に言及される。便利には、それらは、特異的結合対
の相補的膜として言及されるであろう。
官能化されたポリスチレン表面は、壁、仕切り、シート
、中空ファイバー、ビーズ、粒子又は同様のものの表面
であり得る。大部分、いくつかの情況においては、他の
表面が適用されるけれども、平らな表面を使用すること
が所望されるであろう。
装置は、ボトル、標準のＴ型フラスコ、シート、等、容
器中に多くの分離されたシート、円柱状又は曲線状シー
トを有するバッグ又はボックス、長方形のボックス又は
同様のものの形を取ることができる。装置の選択は、便
利さ、分離の目的、他の装置との相互作用、対象の細胞
集団、予定された装置、対照の集団が陽性又は陰性の選
択の結果として存在するかいづれか、又は同様のものに
依存するであろう。
その表面は、求電子性試薬によるポリスチレンのベンゼ
ン環の置換により、特にポリスチレンを軟化又は熔解し
ない溶媒中におけるＦｒ１ｅｄｅｌ−Ｃｒａｆ　を反応
により誘導体化されるであろう。この目的のためには、
スルホランが特に適用される。比較的温和な状態が用い
られ、そしてベンゼンは種々の物質、たとえばニトロ（
アミ）に還元され得る）、ハロメチル（アミノを形成す
るために使用され得る）、ヒドロキシル又はチオール基
、又は置換されたＮ−ヒドロキシメチルアセトアミド（
該置換基は活性ハロゲン又は偽ハロゲンである）により
誘導体化され得る０反応の説明は、ＥＰＡに見出され得
る。
次に、誘導体化されたポリスチレン表面は、受容体と反
応せしめられる。誘導体化の条件下で、高い割合のベン
ゼンが表面で誘導体化され、その結果、その表面で高密
度の受容体を得ることができることが見出される。
受容体の性質に依存して、種々の反応が、表面に受容体
を結合するために行なわれ得る。表面へのタンパク質の
結合が特に興味の対象である。タンパク質は、完全な反
応のために十分な時間、温和な条件下で、活性イロゲン
、活性化されたカルボキシ基、たとえばエステル、又は
同様のものを有する官能化された表面と水性培地中のタ
ンパク質とを接触せしめることによって結合され得る。
残存する未反応官能基は、適切な小さな分子阻止剤を用
いることによって阻止され得る。たとえば、活性ハロゲ
ンは、脂肪族アミンにより、チオールはメレイミドによ
り、又は同様のように阻止される。ある情況においては
、過剰の反応性基を阻止８８−３０４５１６・３ する必要はない、なぜならば、それらは工程における続
の段階を妨げないあろうからである０次に、表面は、非
特異的に結合された受容体を除くために洗浄され、そし
て適切な受容体結合が生じたことを確認するために評価
される。
収集装置の性質に依存して、細胞を含む培地との接触は
変更されるであろう、たとえば、ローラーボトルに関し
ては、ローラーボトル中に培地を導入し、そして次に、
細胞が結合するようになる十分な時間にわたってそのボ
トルをゆっくりと回転せしめる。Ｔ−フラスコ又はプレ
ート−イン−バッグ／ボックス（ｐｌａｔｅ−ｉｎ−ａ
−ｂａｇ／ｂｏｘ）形態に関しては、装置を同じ高さの
表面上に置き又は振盪用プラットフォーム上でわずかに
撹拌され、続いてその装置をひっくり返し、そしてこの
工程を他方でもくり返す。同様の技法が、他のタイプ容
器によっても使用され得る。さらに、装置は、接触表面
に標的細胞を押しつけるために遠心分離され得る。
収集バッグ／ボックスとして言及される装置が、特に興
味の対象である。そのバッグ／ボックスは、１つのシー
ト上に他のシートを重ねられ又は積層され、そしてシー
トの間の流れを可能にするためにお互い分離されている
、ポリスチレンシートを含む硬い又は柔軟な壁の容器で
あろう。濃縮、たとえばグラジェント密度遠心分離又は
遠心分離の結果としての充填された細胞は、水平位置で
維持されているバッグ／ボックス中への流れを可能にさ
れる。細胞分散液は、バッグ／ボックス中における受容
体被覆されたポリスチレン表面の実質的にすべてと接触
するように、バッグ／ボックスしゆうに広げられるであ
ろう。細胞が結合する十分な時間の後、そのバッグ／ボ
ックスは、表面の有効な利用を提供するために、まだ分
散され又は解放されている細胞（フィルム表面の下に存
在する）のフィルム表面への沈降を可能にするために引
っくり返され得る。他方、そのバッグ／ボックスは、接
触表面に細胞を押しつけるために、個々の側で１度、遠
心分離され得る。
接触時間は、細胞表面上のリガンドの濃度、受容体の結
合親和性、培地中の細胞の濃度、収集装置の性質及び同
様のものに依存して、広く異なるであろう０通常、接触
時間は、少なくとも約５分〜約１２０分、普通約１５〜
６０分であろう。
細胞分散液は、いづれか便利な手段により収集装置を通
して移動され得る。圧力差異が、ポンプ輸送の手段によ
り収集装置を通して達成され得る。
他方、重力的流れが、適切な流速を付与することができ
る。細胞の生存性に有意に影響を与えないで表面への結
合を可能にする細胞の流速をもたらすいづれか便利な技
法が、使用され得る。
本発明の装置は、収集装置の性質に悪影響を与えないで
、Ｔ放射線又は電子ビーム放射線を用いて殺菌され得る
。すなわち、受容体の活性が保持され、同時に、表面へ
のその結合の共有性質が保持されている。従って、その
収集装置が使用される場合、表面に結合される受容体は
実質的にほとんど失われない。
細胞が表面に結合されるようになった後、すぐに、その
収集装置は、広範囲の種類の処理にゆだねられ得る。激
しい洗浄が非付着性細胞を除くために使用される。なぜ
ならば、付着性細胞は、多くの接触で表面に堅く結合さ
れるからである。洗浄媒体は、ポンプで出し入れされ得
、装置を通して流れるリガンドを使用することもでき、
又は穏やかであるが、しかし比較的激しい撹拌の他の手
段を使用することもできる。洗浄溶液は、脱イオン水、
食塩水、り酸緩衝溶液、栄養媒体又は同様のものであり
得る。使用される特定の洗浄溶液は、通常、細胞がいか
にして使用されるかに依存するであろう。
細胞分離が、細胞集団からの細胞の除去に関与する場合
（細胞消耗）、捕獲された細胞は捨てられ、そしてその
消耗された細胞集団が収穫され、いづれか追加の処理に
ゆだねられ、そして次にその意図される目的のために使
用される。
大部分、本発明は、続いての使用のために単離された細
胞のために特に適用される。意図される使用及び細胞の
性質に依存して、細胞は広範囲の種類の処理にゆだねら
れ得る。特に、リンパ球又は骨髄系統に関与される場合
、これらの細胞は、特定の細胞のセット又はサブセット
の活性を拡張又は変性するために処理され得る。従って
、細胞の増殖、細胞の活性化、１又は複数の表面膜タン
パク質の増強又は減少及び同様のものをもたらす種々の
因子が添加され得る。処理の間、結合されるすべての細
胞を有することを所望するか、または遊離細胞の形成を
所望するかのいづれかに依存して、容器中における結合
された細胞に対する受容体の適切な割合が付与され得る
。初めに結合された細胞に比べて多数の受容体を有する
ことによって、いづれかの前駆体がまた結合されるよう
になり、そして表面上に保持されるようになるであろう
。これは、追加の解決法として作用することができる。
なぜならば、これまで存在し、そして拡張されて来た他
の細胞が結合されなくなり、そして収集容器から除去さ
れ得るからである。
大部分、対象の細胞は、血液、骨髄、固形腫瘍及びリン
パ様組織から得られるであろう、これらの細胞は、リン
パ系統及び骨髄系統に分けられ得る。考慮されるべき第
１の系統は、リンパ系統であろう、この系統は、さらに
Ｂ−細胞及びＴ−細胞のカテゴリーに分けられ得る。Ｂ
−細胞は、表面マーカーとしてｓＩｇを有し、そして免
疫グロブリン座で転位された生殖系ＤＮＡを有すること
によって同定される。Ｔ−細胞は、大部分、表面マーカ
ーとしてＣＤ２及び／又はＣＤ５を有し、モしてＴ−細
胞受容体圧で転位された生殖系ＤＮＡを有する。多能性
幹細胞は別に論議されるであろうけれども、Ｂ−及びＴ
−細胞はまた特定の前駆体細胞を含み、モしてＢ−細胞
の場合、血漿細胞もまた含まれる。
マーカーにより単離され得る他の特殊化されたリンパ様
細胞は、次のものを包含する。：リンホカイン活性化キ
ラー（ＬＡＫ）細胞、天然のキラー（ＮＫ）細胞、腫瘍
浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）　、抗体依存性細胞毒性細胞
（ＡＤＣＣ）、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、等。
骨髄系統においては、単球、マクロファージ、好酸球、
好塩基球、多形核白血球、樹枝状細胞、等を単離するこ
とに興味がある。
Ｂ−細胞は、インターロイキン１〜７又は他のもの、特
にＩＬ−１，−２，−３又は同様のものによる処理によ
り拡張され得る。Ｂ−細胞は、表面結合抗原、表面マー
カー（たとえばＣＤ２０）又は可溶性抗原への特異的結
合により選択され得、ここでそのような抗原が細胞に添
加される場合、抗原を認識する表面免疫グロブリンを有
するそれらの細胞が、エンドサイドースされ、そして処
理される複合体を形成するために抗原を結合するであろ
う０次に、細胞のＭＭＣ抗原を有する抗原のフラグメン
トが表されるであろう、Ｂ−細胞により制限される媒体
にＴ−細胞を添加することによって、その抗原フラグメ
ントを認識するＴ−細胞がリンホカインを分泌し、モし
てＢ−細胞の増殖をもたらすであろう、固体表面上に過
剰の受容体を付与することによって又は第２収集装置に
おいて細胞集団を分離するＢ−細胞の開放の後、対象の
抗原を認識するＢ−細胞及び血漿細胞の数を実質的に増
大することができる。
他方、Ｂ−細胞融合パートナ−（ハイブリドーマ細胞）
又はいづれかの源からの他のＢ−細胞は、共有結合され
る抗原を担持するポリスチレン表面に結合することによ
って選択され得る。ポリスチレンに結合される抗原と反
応性の所望するハイブリドーマ又はｓｌｇを担持する他
のＢ−細胞は、ポリスチレン表面上に捕獲され、特定の
ハイブリドーマ又は他のＢ−細胞の抗原特異的選択を可
能にする。次に、捕獲された細胞は、本発明の方法に従
って回収され、そして拡張され得る。他方、特定の表面
受容体を含むＴ−細胞又はいづれかの細胞は、前記ポリ
スチレン表面が前記共有結合される抗原を含む場合、そ
のポリスチレン表面により捕獲され得る。
特定のＢ−細胞のサブセットを使い尽＜シたい場合毒素
に接合される抗原を添加することができ、すなわち表面
免疫グロブリン及び補体に対して特異的な抗体又は他の
選択的細胞毒性能力を使用することができる。この方法
においては、特定の抗原に応答する細胞を選択的に減じ
ることができる。
他方、抗原又はＢ−細胞マーカー（たとえばｃｏ２０　
）は、ポリスチレンに固定され、そして標的Ｂ−細胞集
団はその表面上に捕獲される。特に、記憶細胞が存在す
る場合、特定の抗原に対するその記憶細胞集団を実質的
に使い尽くすことによって体液性応答を減じることがで
きる。
Ｔ−細胞集団は、機能的にＢ−細胞集団よりも異なる。
ｔｃ熟Ｔ−細胞集団は、ＣＤ４　ＭＨＣＣ１ａｓｓＩＩ
制限性細胞毒性ヘルパー又はサプレッサー細胞及びＣＤ
８　？ｆＨＣＣ１ａｓｓ　Ｉ制限性細胞毒性サプレッサ
ーに分けられ、ここでそれらの細胞は異なった機能を有
し、そしてそれらの拡張及び消耗が興味の対象である。
いづれかのＴ−細胞集団（ＣＤ　４又はＣＤ８）のため
には、特異的抗原を認識するＴ−Ｊｉ［ＩＩ胞を活性化
することが所望される。多くの方法が、この目的のため
に使用され得る。特定の抗原に対して特異的なり一細胞
は、その抗原に暴露され、そして次に特定の抗原により
制限されたＴ−細胞サブセットを活性化するために抗原
存在細胞として使用され得る。他方、単球又はマクロフ
ァージは、抗原存在細胞として使用され得る。マクロフ
ァージは、特定の抗原に対するＢ−細胞の特異性を有さ
ないので、好ましい。従って、抗原により付随的に前処
理又は処理された単球及び／又はマクロファージを、結
合されたＴ−細胞に導入し、ＭＭＣに関連してその単球
／マクロファージにより示される場合、抗原フラグメン
トを認識するこれらのＴ−細胞の拡張を提供することが
できる。
細胞の生物学的活性化は、特定の可溶性又は固定された
リンホカイン、たとえばＩＬ−２の結果として、又は特
異的結合化合物、たとえば抗体の使用にまり達成され得
る。たとえば、Ｔ−細胞は、抗−Ｔ−細胞（たとえばＣ
Ｄ−５）表面を用いて選択され得る。次に、ＣＤ−５＋
捕獲細胞が放され、そして活性化する抗−Ｃ０３表面上
に又はリンホカインが共有結合されている表面に導入さ
れる。その細胞は結合し、そして活性化するようになる
であろう、活性化の後、その細胞は音波処理、機械的撹
拌又は他の便利な手段により開放され、そして収穫され
得る。
骨髄又は末梢血液から得られる幹細胞に特別な興味があ
る。これらの幹細胞は、１又は複類の血液細胞系の前駆
体として作用することができる。
この幹細胞の単離は、消耗（負の選択）及び／又は正の
選択の両者の結果として存在することができる。従って
、初めに受容体が培地からの細胞の除去（負の選択）の
ために所望としない細胞に結合するであろう一連の装置
を供給することができる。次に、末結合細胞が単離され
、捕獲された細胞から開放され、そして細胞の結合集団
を残して、幹細胞に関連する種々のマーカーを有する細
胞についてさらに選択され（正の選択）、次にこれは、
幹細胞を含む集団に対して特異的なマーカーについてさ
らに正の選択が行なわれ得る。この場合、類似する最終
マーカーを有する他の細胞は、前の工程段階により除去
され得る。
血液細胞以外の細胞が関与する場合、単離のための対象
の細胞は、ランゲルハンス島、ダリア細胞、アストログ
リア、ニューロン、内皮細胞、上皮様細胞、基質細胞、
幹細胞、鱗状細胞又は同様のものを包含する。
細胞が静止状態又は活性化状態にある場合、約９５％以
上、通常９８％の実質的に均質の細胞集団が達成され得
る。細胞組成物は、固定された受容体により認識される
表面マーカー（リガンド）を表わすいづれかの細胞集団
を含むことができる。そのような組成物は、ＣＤ（クラ
スター名称シリーズ）の！！識された白血球抗原のいづ
れか又は特定の細胞表面リガンドに対するモノクローナ
ル抗体により認識される他のものを担持する細胞を含む
。
そのような組成物は、他の血液細胞、腫瘍細胞、細菌、
ウィルス又は通常の表面マーカーを同じように共有する
寄生体を含むことができる。実際、すべての細胞集団（
この膜は固定された受容体により認識される表面リガン
ドを共有する）は、そのような細胞組成物を構成するこ
とができる。
多くの種類の自己免疫、腫瘍性、感染性、代謝性、血液
学的及び免疫学的疾患及び状！！（疾病分野）が、本発
明に従って処理され得る。自己免疫疾患の中には、糖尿
病、紅斑性狼癒及びリウマチ様関節炎がある。感染性疾
患の中には、グラム陽性球菌、ダラム陰性球菌、ダラム
陰性杆菌、嫌気性細胞、マイコバクテリウム、菌類、ウ
ィルス、原生動物、等による局部性及び全身性感染があ
る。
腫瘍性疾患の中には、すべての固形及び血液悪性がある
０代謝性疾患の中には、アテローム硬化症及び敗血性シ
ョックがある。血液学的疾患の中には、鎌状細胞貧血症
及び家族性高コレステロール血症がある。免疫学的疾患
の中には、器官移植及び免疫欠損症がある。
これらの及び他の疾患又は状態は、次の通りに本発明の
方法により説明される。他の方法によれば、自己免疫、
感染性又は腫瘍性疾患に関連する免疫複合体を単離する
ことができる（１９８８年９月１３日に出願された同時
継続出願第２４３．７８６号）。
上記のように、特定の抗原により活性化されるＢ−及び
Ｔ−細胞の両者を選択するために、その複合体から得ら
れる抗原を使用することができる。
従って、自己免疫又は腫瘍性疾患を有する宿主から血液
を除くことができ、そしてその疾患に関連するＢ−及び
／又はＴ−細胞を選択的に消耗せしめ、又は自己免疫疾
患を抑制し又は腫瘍細胞を検出し、そして排除するため
にＴ−又はＢ−細胞を活性化することができる。この場
合、緩解傾向、疾病の進行の停止又は同様のことがある
。
他方、感染性、自己免疫又は腫瘍性疾患の場合、特定の
病原体又は疾病抗原と反応性のＢ−及びＴ−細胞の選択
を付与することができる。この場合、免疫防御に関連す
るＢ−及びＴ−細胞の濃度を高めることが所望される。
従って、病原体、自己免疫又は腫瘍性疾患、又は病原体
、自己反応性又は腫瘍性細胞自体に関連する複合体又は
抗原を用いて、それらの疾病に対する防御に関連するリ
ンパ様細胞集団を高めることができる。本発明の装置を
用いて、病原体、自己反応性又は腫瘍性細胞を単離する
ことができ、そしてその単離された病原体又は細胞を、
疾病に対する防御において活性的な適切なＴ−又はＢ−
細胞を捕獲するために上記に定義されたように、免疫原
又は受容体として使用することができる。従って、選択
されたこれらの細胞を、起原の患者への続く返還のため
に上記のようにして回収し、拡張し、活性化することが
できる。この技法は、ウィルス、たとえばＡＩＤＳ　、
　）ＩＴＬＶ−１又は■、細菌、原生動物、菌類、嬬虫
及び同様のものに関連する広範囲の種類の疾病に使用さ
れ得る。
さらに、本発明の方法は、病気の予防及び診断目的のた
めにも使用され得る。本発明の方法はまた、Ｂ−及びＴ
−細胞応答を検出し、免疫応答を調査し、自己免疫疾患
に関連するエピトープを同定するための研究にも使用さ
れ、そして究極的には、遺伝子療法のためにも使用され
るであろう。
Ｂ−細胞を活性化し、次にそのＢ−細胞を不滅化し、通
常適切な融合パートナ−と融合することによって、モノ
クローナル抗体を生成するための本発明の装置をまた使
用することができる。この場合、抗原に対してヒトリン
パ球を免疫化することができ、ヒト宿主に通常投与する
ことができず、そして二重選択、初めにＢ−細胞のため
の選択、一般的に続いて、抗原に結合することができる
それらの特異的Ｂ−細胞のための選択を付与する。
従って、抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を得
る可能性をひじょうに高めるために、抗原に対して特異
的なり一細胞をひじょうに濃縮することができる。
細胞は、種々の方法により収集装置から単離され得る０
分裂促進剤、たとえば植物凝集素（ＰＨＡ）及び増殖因
子様活性を有する化合物、たとえばインターロイキン又
は増殖因子、たとえばインターロイキン−２（ＩＬ−２
）　　、ＧＭ−Ｃ５Ｆ：、等（受容体に結合される細胞
表面上にリガンドを付与することによって細胞の開放を
もたらす）の使用が特に興味の対象である。培地は、約
２０〜１０００単位／ｄのＩＬ−２及び約０．１〜５．
　Ｏｎ　／−の植物凝集素を含む標準の組織培養培地で
あり得る。他方、細胞は、物理的な方法、たとえば機械
的な破壊、特に剪断、たとえば振動、活発なピペット処
理、又は超音波処理器を用いての音波処理及び水浴中へ
の収集装置の配置により開放され得る。便利には、Ｃｒ
ｅｓ　を超音波処理器が使用される。　Ｍｅｎｓｓｅｎ
＋　ｔｌ−ζ＋ｌ　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ（１９８７）１０４　：　１〜６を参照のこと。
本発明をさらに理解するために、図面が添付される。第
１図は、標的細胞の源として血液を用いての本発明の方
法の図的なフローチャートである。
この図面は、赤血球細胞及び血小板が上滑液を得るため
に除去される分離容器１０を含む第１段階を包含する。
次に、上清液には、管１４を有する遠心分離機に移され
、ここで上清液１２が管１６の標的細胞２０を：ａ縮す
るために遠心分離される０次に、その標的細胞が、弁２
４を通して細胞捕獲装置１１ｆ２６中に標的細胞を供給
する供給容器２２に移される。この方法は、引用される
例により制限されない、赤血球細胞、血小板及び血漿を
除去するための通常使用される方法は、末梢血液又は骨
髄から標的細胞集団２０を得るために使用され得る。他
方、固形組織は、標的細胞集団２０を得るために酵素的
又は物理的手段により分解される。
細胞捕獲装置２６は、支持体３２により分離される多く
のポリスチレンフィルム又はシート３０を有する。上方
のフィルム又はシート３０上に、Ｒとして命名された受
容体３４の存在が示される。受容体３４は、数枚のフィ
ルム又はシート上に単に示されており、そして受容体は
フィルム又はシートの両側上に存在することが示されて
いるが、しかしフィルム又はシートのすべてが受容体に
より両側上に被覆されていることが理解されるべきであ
る。他方、細胞捕獲装置は、Ｔ−フラスコ、マイクロタ
イタープレート、マルチウェルプレート、ローラーボト
ル、細胞ファーム又は他のいづれかのポリスチレン容器
（これらの内部ポリスチレン表面のすべて又は一部は、
それに固定された受容体を有する）であり得る。
細胞は、ダクト３６を通して細胞捕獲装置２６に人いる
。細胞捕獲装置２６２６が実質的に一杯である場合、そ
れは、細胞が沈降するのに十分な時間静置され、そして
液体層下のフィルム又はシート上への受容体の接解を可
能にされる。細胞が沈降し、そして接触されるようにな
る十′分な時間の後、次に細胞捕獲装置２６は、特異的
に結合されなかった細胞が。
フィルム又はシート３０の反対側上に沈降し、そしてそ
の側上の受容体に結合されるようになるように、ひつく
り返えされる。次に、細胞捕獲装置は、ダクト３６を通
して洗浄溶液を導入し、そしてそれをダクト４０を通し
て出すことによって洗浄され、非特異的に結合される細
胞が除去される。
次に、ｌ又は複数の処理溶液又は細胞懸濁液が、捕獲さ
れた細胞の数を拡張し、その細胞を活性化し、捕獲され
た細胞のサブセットを消耗せしめ、捕獲された細胞中に
外因性遺伝子を導入し、又は同様のことを行なうために
導入され得る。その処理が完結した後、容器は、処理溶
液、細胞残骸物又は同様のものを除去するために再び洗
浄され、そして適切な培地が、結合された細胞の生存性
を保持する光めに導入される０次に、細胞が、インター
ロイキン−２及び分裂促進剤を含む培地を添加すること
によって、又は細胞捕獲装置２６を取り、そしてそれを
超音波槽中に導入し又はそれを機械的振動又は活発なピ
ペット処理にゆだねることによって開放される。そのよ
うな物理的処理又は比較的穏やかな音波振動下での短期
間の後、捕獲された細胞は開放され、そして収穫され得
る。
次の例は、例示的であって、限定するものではない。
ＨＭＢＡを、ホルコリンの存在下でｐＨ１０で、市販の
２−ブロモアセトアミドから従来の方法（Ｌｅｏｎａｒ
ｄ菫ζ、、ム紅り並！、創：２４８０（１９８）　）に
より合威し、これは、出発反応体、Ｎ−（ヒドロキシメ
チル）２−ブロモアセトアミド（ＨＭＢＡ）の９３％収
率を付与する。
第２段階は、ブロモアセトアミドポリスチレン表面（Ｂ
Ａ−ＰＳ）の生成を包含する。この段階においては、２
Ｍのトリフリル酸及び０．２ＭのＨＭＢＡ〔両者ともラ
ハラメチレンスルホン（スルホラン）中における〕が、
活性化されているポリスチレン容器の内表面を被覆する
のに十分な体積で１：１で混合される。その反応は、２
７℃で３時間、行なわれる。反応溶液が排水され、装置
を水により洗浄し、続いてエタノールにより洗浄し、そ
して活性化されたポリスチレンチャンバーが空気乾燥せ
しめられる。得られたブロモアセトアミドポリスチレン
表面を、６力月間室部で安定している。
Ｂ、　　　　　　　　　　の　　　　　　　　　　　び
次の段階は、受容体捕獲である（モノクローナル抗体が
ブロモアセトアミド−ポリスチレン表面に共有結合され
る）。対象のモノクローナル抗体を、リン酸緩衝溶液（
ｐＨ７，４）中で約０．０１〜０．０５■／ｄに希釈す
る。希釈されたモノクローナル抗体の適切な体積を、ポ
リスチレンチャンバー中に導入し、そしてその反応を、
回転しながら、約２〜２０、好ましくは約２〜４時間、
２７°Ｃで進行せしめる。その反応の後、残存する抗体
がデカントされ、そして続く被膜反応において１０回ま
で再利用され得る。
次に、抗体結合装置を、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（ｐ
Ｈ７，４）により１０回清浄し、そして次に、その表面
を、２％スクロース１０．２％ヒト血清アルブミン（Ｉ
ＳＡ）　（医薬器種）を個々の装置に添加することによ
り安定化せしめる。スクロース／アルブミン溶液は、そ
の表面の被覆を可能にされ、この後、過剰のスクロース
／Ｈ３Ａ溶液がデカントされ、そして安定化されたポリ
スチレンチャンバーが２５°Ｃで真空（＜０．１０）ル
）下で２４〜９６時間乾燥せしめられる。乾燥の後、真
空が乾燥窒素により開放され、そして装置が不活性乾燥
ガスによりフラッシュされ、そしてきつくキャップをさ
れる。装置を密封し、そして次に殺菌する。殺菌は、２
．７±０．２メガラドの電子ビーム又はγ放射線による
照射にまり達成される。殺菌試験は、フラスコが、１４
日間の現場培地のインキュベーションの後、無菌状態で
あったことを示した。
Ｃ０の六の声 種々の表面官能化基を用い、そしてその表面への抗体の
結合の安定性について試験した。ポリスチレンを、Ｎ−
（ヒドロキシメチル）−２−ハロアセトアミド（ここで
ハロ基はクロロ、ブロモ又はヨード；ジアゾニウム及び
スルホニウムである）を用いて官能化した。これらの表
面を用いてのモノクローナル抗体の付着の後、フラスコ
を、それぞれＰＢＳにより１０度洗浄し、そして５５°
Ｃで１４時間、１％ＳＤＳにより１度洗浄した０次に、
プラスチック表面を、ラベルされたモノクローナル抗体
の放射性についてアッセイし、そしてその結果を、モノ
クローナル抗体のための表面密度として、ｎ　ｇ　／　
ｃｄで表わした。ブロモアセトアミドは、約２５０ｎｇ
／ｃｄの抗体の表面密度を有し、これはＩｍａ＋ｕｌｏ
ｎ−２丁’（Ｄｙｎａｔｅｋ）表面上への吸着により達
成されるよりも２．５倍以上高かった。ブロモアセトア
ミドは最高の表面密度を提供するが、他の官能性につい
ての表面密度は、２００〜約２４０ｎｇ／ｃｄに低下し
た。
Ｄ、　　　六の 抗体結合の安定性を、０．０２■／ＩＩｉの（”Ｓ）ヒ
トＩｇＧにより表面を被覆することによって決定した。
フラスコを、硼酸塩−カーボネート緩衝液により５度、
硼酸塩−カーボネート緩衝液により１度（８時間）及び
硼酸塩−カーポネー）ｔｌｌ液液より２度（−晩）洗浄
した０個々の洗浄物のアリコートを保存し、そして放射
性についてアッセイした０、２回目の洗浄の後、いづれ
の抗体の浸出も確認されなかった０表面に結合される抗
体についてのＥＩＪＳＡアッセイを用いての第２研究に
おいて、その観察された結果は、抽出可能な抗体の量は
、アッセイの検出限界よりも低かった（７．７ｎｇ／Ｈ
１）ことを示した。
受容体−誘導体化されたポリスチレン表面は、その光学
的鮮明度を保持するので、誘導体化されたポリスチレン
の単位面積当たりの捕獲された細胞の密度は、直接的に
顕微鏡により計算され得る。
はとんどの細胞捕獲用途に関して、結合された細胞の密
度は、単層上での球体の最っとも接近した充填率に近づ
く、マウス又はヒト起原のリンパ球に関して、その結合
密度は、０．５Ｘ１０’個の細胞／ｄ〜ｌＸｌ０’個の
細胞／ｄである。投入細胞懸濁液中の標的細胞の頻度及
び大きさに依存して、結合された細胞の密度は、広く異
なり、すなわち、大きな、数少ない標的細胞のためには
ｌ×１０３個の細胞／ｄ〜小さな多くの細胞又は粒子、
たとえば細胞又はウィルスのためには１０Ｉ＠以上の細
胞／ｄである。
官能化されたポリスチレン表面への細胞結合は、ポリス
チレンに結合される受容体により特異的に決定される。
次の実験は、細胞結合の特異的を示す、単核細胞を、標
準の組織学的遠心分離により末梢血液から調製し、そし
て３Ｘ１０’個の細胞／ＰＢＳ　Ｉ　ｍに希釈した。そ
の投入物のアリコートを、流動細胞計測法による表現型
の分析のために保存した。細胞懸濁液を、次のものをそ
れらの内部底面上に含むＴ−２５フラスコに添加した：
Ｔｈｙ１．２（ネズ電Ｔ−細胞マーカー）、（２）ＣＤ
５、（３）ＣＤ８又はＣＤ８及びＣＤ５抗体（ヒトＴ−
細胞マーカー）の等モル混合物のいづれかに対する特異
性を有する、本発明の方法により共有結合された精製モ
ノクローナル抗体、細胞を３０分間インキエベートし、
次に少々振動せしめ、そしてさらに３０分間、沈降せし
めた。非付着性細胞（フラスコ表面に付着しない細胞）
を、デカントすることにより回収し、そしてそのアリコ
ートをまた、流動細胞計測法により分析される表現型組
成物のために保存した。すべての場合（但し、ｒｈｙｔ
、ｚを除＜）、すなわち細胞のフラスコへの結合が見−
られないフラスコの場合、フラスコの顕微鏡的試験は、
０．５×１０’個の細胞／ｄの密度での集密的細胞結合
を示した。流動細胞計測法を、マーカーＣＤ５．ＣＤ８
（ヒトＴ−細胞）　、ＣＤ１４　（ヒト単球）、ＣＤ１
６（ヒトＮＫ−細胞）及びＣＤ２０　（ヒトＢ−細胞）
についてすべての投入及び流出（非付着性）細胞集団に
対して行ない、そして投入及び流出液におけるこれらの
マーカーの相対的頻度を、個々のフラスコについて比較
した。その結果は、Ｔｈｙｌ、２フラスコに間して、投
入及び流出液間に差異が存在しないことを示す。ＣＤ５
及びＣＤ８フラスコはそれぞれ流出液におけるＣＤ５及
びＣＤ８細胞の９８％以上の消耗を示し、そしてＣＤ５
／８フラスコは、単一特異性ＣＤ５又はＣＤ８フラスコ
のいづれかの程度に等しい程度へのＣＤ５及びＣＤ８１
１１胞の消耗を示した。単球及びＮＫ−細胞並びにＢ−
細胞のためマーカーは、それらがフラスコにより捕獲さ
れない場合、流出液中に比較的冨んでいることを示した
。これらのデータは、（１）細胞が細胞捕獲装置により
量的に及び特異的に捕獲され、（２）官能化された表面
が非特異的細胞結合を示さず、そして（３１以上の細胞
の表現型が二回誘導体化されたポリスチレン表面により
同時に捕獲され得ることを示す。
Ｇ、°の　　　　のための ２種の技法を用いて、捕獲装置から細胞を回収した。両
者は、定量的細胞回収、良好な生存性、回収された細胞
の表面上でのモノクローナル抗体の不在及び複製及び機
能の両者のための十分な生物学的活性を示す。リンホカ
イン開放と呼ばれる第１の方法は、上記本発明の方法に
従って、正常なヒト末梢血液から捕獲されたＣＯ８°細
胞毒性Ｔ−細胞により試験された。非付着性細胞をデカ
ントし及び顕！鏡観察により集密的結合を確認した後、
組換え体ＩＬ−２（３００単位／ｄ）（通常２０〜１０
００単位／−の間）及び植物凝集素（ＰＨＡ　：　Ｇｉ
ｂｃ。
Ｏ，１■／ｄ）（通常、０．１〜５．０■／Ｉｄの間）
により補足された標準の組織培養培地を添加した。
培養の４８〜７２時間後、捕獲されたＣＤ８°細胞がフ
ラスコから自発的に分離し、ポリスチレン表面に共有結
合されたモノクローナル抗体のすべてが残った・ 捕獲されたＣＤ８細胞は、螢光化された抗−マウス抗体
を用いての流動細胞計測法により表面結合モノクローナ
ル抗体を有さない″ことが示された。
さらに、フラスコは、捕獲表面を再生する、４ＭのＭｇ
Ｃ１を含むＰＢＳによる洗浄により細胞捕獲のために再
使用され得る。そのような再使用フラスコは、４〜６循
環の間、確実に作用し、その後、反復された洗浄は結合
される抗体活性を減じる。
さらにポリスチレン表面による抗体の保持の証明は、ポ
リスチレンプロット研究によりその場で提供され、ここ
で放射性ラベルされた抗−マウス抗体は誘導体化された
ポリスチレンと反応せしめられ、激しく洗浄され、そし
てその表面がオートラジオグラフ法又は直接的なシンチ
レーション計数法のいづれかによりアッセイされる０両
セットの実験において、ポリスチレン表面は、結合され
たモノクローナル抗体により十分に飽和され、そしてこ
れは、装置におけるその抗体の保持を示している。
デカントにより回収された、その分離された細胞を、Ｉ
Ｌ−２及び植物凝集素により補足された標準組織培養チ
ャンバー中で数的に拡張することができる。トリバンブ
ルー排除試験による生存率は、９８％以上であることが
示され、そして回収された均ｔｍ胞集団は約１０日間に
わたって２倍に拡張され得る。
超音波開放と呼ばれる、細胞回収のための第２の方法は
、Ｃｒｅｓｔ　Ｖｉｂｒａ−捧により水浴を均等に分配
されている超音波浴（Ｃｒｅｓ　ｔυ１ｔｒｕｓｏｎ５
ｃｓモデル會Ｈ−４ＨＴ−’１０１４−６）を用いる。
電力供給は４０〜９０ＫＨｚで５００ワツトである。超
音波浴は、流体６ガロンの体積を保持する。１ＯＸ１４
インチの浸漬タンクを有し、この流体のｌｌ１（タンク
底から０．５インチ）が本発明の研究における音波処理
のために含まれる０種々の大きさの浸漬タンクが市販さ
れている。
結合細胞を含む捕獲装置を、超音波浴においてｌｌの流
体中に浸漬し、そして電力供給及び電力適用時間を実験
的に決定する。細胞表現型に依存して、時間及び電力は
異なる：たとえばＣＤ４”Ｔ−細胞：７８％の最大電力
、１７秒：ＣＤ８°Ｔ−細胞：３０％の最大電力、２０
秒；　Ｌｅｕ　１９細胞：７５％の最大電力、１０秒、
等。
音波処理により回収された細胞がなお生存し、そしてそ
れらの生理学的活性を保持することを示すために、ＣＤ
１６”　ＮＫ−細胞を、最大電力での１５〜２０秒間の
音波処理により回収した。音波処理により回収された細
胞は、（１）トリバンブルー排除試験により８５％以上
の生存率があり、そして（２）ＮＫ−細胞活性を定量化
するために通常使用される溶解アッセイにおいてひじょ
うに活性的であった。音波処理により回収された細胞は
、マイトジェン／リンホカイン誘導の上記方法により回
収された細胞と同じように、モノクローナル抗体を有さ
ないことが流動細胞計測法を用いて示された。
従って、両方法により回収された細胞において、抗体は
、細胞が回収される場合、細胞上に残存せず、モノクロ
ーナル抗体を有さない生存する均質の十分に官能的な細
胞が付与される。
Ｈｏ　　　れた　　の 投入及び流出（捕獲されなかった）細胞の表現型の前記
（セクションＦ）分析は、細胞捕獲装置により結合する
細胞がその装置表面に共有結合されるモノクローナル抗
体により特定されることを示した。このセクションにお
いて、データは、リンホカイン開放により装置から回収
された細胞の流動細胞計測法による分析によりこれらの
発見を確証し、そして拡張することが示される。正常な
ヒトの末梢血液からの単核細胞を上記のようにして標準
のヒストオバーク遠心分離により調製し、そして内表面
に共有結合されるＣＤ８又はＣＤ４モノクローナル抗体
のいづれかを含む細胞捕獲装置中に、３×１０ｈ個の細
胞／ａｄＰＢＳの濃度で導入した。標準のインキュベー
ション及び結合されない細胞のデカントの後、捕獲され
た細胞を、セクションＧに記載のようにしてＩＬ−２及
びＰ）ＩＡと共に４８時間のインキュベーションにより
回収した。
次に、回収された細胞を、流動細胞計数法により表現型
決定し、モしてＩＬ−２及びＰＨＡにより補充された標
準培養培地中で培養した。細胞のアリコートを、流動細
胞計数法のために培養物中から６〜２５日間にわたって
定期的にサンプルとして採取した。そのデータは、時間
ゼロ（装置から回収の後すぐ）で、それぞれＣＤ４及び
ＣＤ８装置からの回収された細胞上のＣＤ４”及びＣＤ
８”表面マーカーについて９５％以上の均等性を示す。
より重要なことには、回収された細胞が培養物中で対数
増殖する場合、それらの表現型の均等性は保持され、そ
して培養物は、６〜２５日間の培養期間にわたってそれ
ぞれＣＤ４及びＣＤ８マーカーについて９５％以上の純
度を保持した。従って、開放された細胞は表現型で均等
であり、そしてそれらの均等性は、４ｙビトロでの対数
増殖の間、維持される。
１、　　　　れた　　の　・な ６人の異なった個人からのヒト末梢血液単核細胞を用い
てのＣＤ８捕獲装置からのリンホカイン力により回収さ
れたＣ［１８”細胞を、湿潤されたインキュベーター中
における標準培養容器中で、ＩＬ−２及びＰＨＡ（それ
ぞれ３００単位／Ｉｄ及び０．Ｉｎ／ｄ）により補充さ
れた標準培養培地において３７°Ｃで培養した。細胞を
、トリバンプルー排除法による生存性及び血球計数器に
よる細胞数についての研究のために、培養の２５日間に
わたって定期的に採取した。それぞれの個々の細胞は、
他とは分離して維持された。そのデータは、９５％以上
の細胞生存率及び２０日間にわたっての細胞数の２対数
上昇を示す、これらのデータは、標準組織培養における
捕獲装置から回収された細胞の数の指数的に上昇する能
力を示す。
この研究においては、正常なヒトの末梢血液から回収さ
れたＣＤ８”細胞を、ＣＤ８”抗体を含む本発明の装置
により捕獲し、そしてリンホカイン力により回収した。
次に回収された細胞を、紐換えＩＬ−２及びＰＨＡによ
り補充された標準組織培養培地を用いて標準組織培養フ
ラスコ中で培養し、又は組換えＩＬ−２又はＰＨＡのい
づれよりも補充されていない標準培地を用いて、共有結
合された抗−ＣＤ３モノクローナル抗体と共に本発明の
装置中で培養した。抗−ＣＤ３モノクローナル抗体を有
する二本のフラスコを用いた６時間ゼロで、同数の細胞
を、フラスコＡ、Ｂ及びＣ（Ａ＝ＩＬ−２／ＰＨＡ補充
培地を有する標準組織培養フラスコ：Ｂ及びＣ−ＩＬ−
２又はＰＨＡを有さないＣＤ３装置）中にそれぞれ充填
した。５日間の培養の後、個々の培養物を２つのアリコ
ートに分け、そして同一の培養条件下で同一のフラスコ
中に再プレートした０次に、細胞を９日目、再計数し、
５日〜９日で次の倍数−拡張をもたらした：Ａ：２．７
；Ｂ：２．５５　；　Ｃ：　６．７５．　ＣＤ　８　”
細胞がＩＬ−２又はＰＨＡ補充物を有さない標準組織培
養容器中で培養されている対照培養物は、まったく増殖
しなかった。
従って、細胞拡張は、標準組織培養フラスコ中でのＩＬ
−２／ＰＨＡ補充培地と比較して、固定された抗−ＣＤ
３抗体及び本発明の装置を用いれば、前記と同じか又は
前記よりも複数倍高く達成された。
これらのデータは、本発明の方法に従ってポリスチレン
表面にＴ−細胞活性化モノクローナル抗体（ＣＤ　３　
）を固定化することによって、Ｔ−細胞活性化／増殖が
、培養培地中において可溶性活性化因子（ＩＬ−２７Ｐ
ＨＡ）の不在下で前記固定されたモノクローナル抗体に
より達成され得ることを示す。
Ｕ−葺足坐班 Ａ、豆日長値 この第１の例においては、骨髄移植のためのＴ−細胞消
耗が例示される。データは、骨１１１物質に存在するＣ
Ｄ５”及びＣＤ８”Ｔ−細胞が対宿主移植片疾患を引き
起こすことを示す、上記装置が、ＣＤ５及びＣＤ８陽性
ヒトＴ−細胞に対するモノクローナル抗体を用いて調製
された。正常なヒトから得られたヒト骨髄のアリコート
を、本発明の装置に導入し、そして細胞を上記のように
してインキユベートシた。非付着性細胞を回収し、表現
型を決定し、そして断片化されなかった骨髄の投入と比
較して、前駆体細胞のための富化を定量化するために４
７　ビトロ培養にゆだねた０次の表は、典型的な結果を
示す。
ＣＤ５　　　ＣＤ８　　　ＣＤ４　　　ＣＤ１４　　　
ＣＤ１６　　　ＣＤ１９９１　　　９６　　　６５　　
−１２９　　−２９　　　４ＣＦＵ−ＥＵ　　　　ＢＦ
Ｕ−Ｅ　　　　ＣＰＵ−ＧＭ　　　　ＣＰＵ−Ｍ　　　
　ＣＰＵ−Ｇ５１３　　　　　６３３　　　　３７６　
　　　　３１１　　　　２４４ＣＰＵ−ＥＵ＝コロニー
形戒形成、赤芽球単位ＢＦＵ−Ｅ−バースト形成単位、
赤芽球ＣＦ［Ｊ−ＧＭ　＝コロニー形成単位、顆粒球−
単球ＣＦ［Ｉ４　＝コロニー形成単位、単球前記表中の
データは、ＣＤ５”及びＣＤ８”細胞の特異的消耗を示
しくＣＤ１４”　、　ＣＤｌ６”細胞は富化され、ＣＤ
１９”は変化を受けなかった）、そして前駆体細胞のた
めには２〜６倍の富化を示す。これらのデータは、所望
する前駆体細胞を富化しながら、対宿主移植片疾患を引
き起こす細胞を特異的に消耗するための本発明の方法の
使用を例示する。
骨髄移植適用の２番目の例においては、骨髄又は末梢血
液からの細胞の混合物中における特定の微量細胞集団を
ｍ縮する本発明の装置の能力が示される。濃縮されるべ
き細胞は、ヒト骨髄からの前駆体幹細胞である。この例
において、本発明の装置は、ポリスチレン表面に共有結
合されるＣＤ３４モノクローナル抗体を導入する。この
例の第１の場合、ヒト骨髄サンプルがＣＤ３４の装置中
に導入され、細胞が上記のようにインキエベートされ、
非付着性細胞がデカントにより回収され、そして捕獲さ
れた細胞が音波処理により回収される。３種の両分、す
なわち投入細胞、非付着性及び付着性細胞を、前駆体細
胞のための標準アッセイを用いてＣＦＵ−Ｃについてア
ッセイした。次の表は、その結果を示す： 投入細胞 非付着性細胞 データは、 前駆体細胞の１５倍の上昇が、 本発明 の装置及び音波処理による細胞回収の本発明の方法によ
り達成されることを示す。
この例の第２の場合、末梢血液単核細胞がもう１つのＣ
Ｄ３４装置中に導入された。非付着性細胞を、デカント
により回収し、付着性細胞を音波処理により再び回収し
た。投入細胞及び付着性細胞のアリコートを、ＣＤ３４
　”表現型について分析した。投入細胞は、ＣＤ３４”
細胞に対して０．１％以下陽性であった。音波処理によ
り回収された付着性細胞は、ＣＤ３４　”に対して１５
％陽性であり、これは、末梢血液から生存する前駆体細
胞を回収するための本発明の装置及び方法の利用性を示
す。
Ｂ、　　　ウィルス　　　　　たとえばＡＩＤＳのｐ次
の例においては、ウィルス感染、たとえばＡＩＤＳの治
療のための方法が例示される。この技法は、末梢血液単
核細胞からＣＤ８”細胞毒性Ｔ−細胞を捕獲することに
よってＣＤ８°細胞を拡張する。
次に、捕獲されたＣＤ８”細胞が、レクチン及び組換え
ＩＬ−２（リンホカイン力）を含む培地中での短い培養
により回収され、続いて最終洗浄の前、１４〜２８日間
、標準の組織培養容器中での分離された細胞の拡張及び
元の患者への再注入のための収集が伴われる。
特に、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅにより濃縮された
末梢血液ヒト単核細胞（ＰＢＭＣ）を、共有結合された
抗−ＣＤ８モノクローナル抗体を有するＴ−１５０ポリ
スチレンフラスコ中に導入した。１時間のインキュベー
ションの後、血液をデカントし、そして組織培養培地を
ｒＬ−２（３００単位／−）及びＰＨＡ（０，１ｘ／ｄ
）により補充した。４８〜７２時間の培養の後、ＣＤ８
”細胞は、流動細胞計数分析により示されるように、ポ
リスチレンの表面に共有結合される抗体を残して、フラ
スコから自発的に分離し、その分離された細胞の表面上
にモノクローナル抗体の不在を示す０次に、その分離さ
れた細胞を、上記のようｅｌＬ−２及びＰＨＡにより補
充された標準組織培養チャンバー中で拡張する。
流動細胞計数法による分析は、ＣＤ３ｔＨ胞表面マーカ
ーに対して１００％陽性である集団及びＣＤ８マーカー
に対して９８％陽性である集団を示した。捕獲された細
胞の表現型は、ＣＤ８表面マーカーを担持する細胞毒性
リンパ球のために報告される記載と一致する。
６人の健康な供給者からの捕獲されたＣＤ８”細胞は、
上記のようなＩＬ−２及びＰＨＡを含む培地による培養
において１５〜３６日までの間、対数的に増殖すること
が示された。７日、１０日、１５日及び２５日目での増
殖の間の細胞の分析は、ＣＤ３゜ＣＤ８’表現型が２５
日間の拡張の間じゅう接続的であった（９８％以上の陽
性）ことを示す。コンカナバリンＡ−被覆されたＯＥＭ
細胞を用いるレクチン依、存性細胞毒性アッセイにおい
て、５人の異なった正常な供給者からの細胞の複合溶解
活性が決定された。実質的な溶解は、標的に対するエフ
ェクターの割合が２．５〜１０の範囲の割合で観察され
た。拡張の後、これらの同じＣＤ８”細胞は、健康な供
給者からの正常な自己ＰＢＭＣの溶解性を示さない。従
って、これらの細胞は、適切な標的細胞に対して正常な
細胞毒性活性を有し、ところが自己免疫細胞毒性活性を
欠いている。
これらの細胞は、それらが、自己ＰＢＭＣによる免疫攻
撃を受けやすくする変化を受けたかどうかを決定するた
めに調べられた。クロムによりラベルされた自己ＣＤ８
１１１胞及び非自己ＣＤ８細胞に対して応答が供給者の
ＰＭＢＣの試験された、異なった供給者からの２種の実
験の結果は、ラベルされていない非自己ＣＤ８°細胞に
より工之ビトロで感作した後、溶解は非自己ＣＤ８°細
胞のためにのみ生じたことを示した。従って、ＣＤ８°
細胞は、元の患者への再注入の後、それらを自己免疫工
程のための標的にする表面の表現型の変化を受けない。
これらの細胞は、単離及び拡張の後、抗原特異性のＭＭ
Ｃ制限細胞溶解活性を保持することが示された。ＣＤ８
°ＩＩＩ胞は、ＥＢｖ（エプスタイン−バールウィルス
）−陽性の健康な供給者から収穫され、そしてクロムに
よりラベルされたＥＢＶ−感染性マイトマイシン−Ｃ処
理された自己Ｂ−細胞に対する特異的な細胞毒性につい
て試験された。
同時培養の間、減じられた量のＩＬ−２がその培地に添
加され、ＥＢＶ−感染性ＭＨＣ制限自己Ｂ−細胞に対す
る特異的反応性を有するＣＤ８°細胞の選択的拡張を可
能にした。このアッセイのための方法は、ＣＤ８”細胞
は増殖されるが、しかし感作されず、そして次に９日目
及びその後、クロム開放アッセイにゆだねられる対照を
包含することであった。この実験は、（１）感作の前、
細胞のアリコートが、日ゼロでクロム開放アッセイにゆ
だねられ、（２）他のアリコートが日ゼロで感作に使用
され、７日目に再び感作に使用され、そして次に、９日
目及びそれ以後、クロム開放アッセイにゆだねられるこ
とを包含する。結果は次の通りであった：　（１）ＥＢ
Ｖ−形質転換性自己Ｂ−細胞に暴露されなかったＣＤ８
”細胞は、溶解活性を示さず、（２）ＥＢＶ−血清−陰
性の健康な供給者からのＣＤ８”細胞を利用する対照培
養は、感作されても又は感作されなくても溶解活性をま
た示さず、（３）ＥＢＶ−血清−陽性供給者からの感作
されたＣＤ８”・細胞に関して、エフェクター二標的の
比が３：１２．５である比で％特異性溶解は２５〜約４
５の範囲であった。これらの結果は、冷培養での１４日
後、収穫され、そして拡張されたＣＤ８＋細胞が、宿主
の抗原周囲に適切な抗原特異性ＭＭＣ制限細胞毒性を示
すことを示す。
次の研究において、ＣＤ８“細胞を、ＨＩＶ−陽性供与
体から得た。その細胞を上記のようにして、Ｆｉｃｏｌ
ｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　ＰＢＭＣから収穫し、ＣＤ８装置
により捕獲し、そして上記のようにしてリンホカイン開
放により回収した。　　１００％近くの生存率を有する
１８日間の培養における対数増殖が、ＨＩＶ−陽性供与
体からのＣＤ８”細胞により達成された。
ＣＤ８０表現型は、±ｌビトロでの拡張の間、実質的に
保持された（９５％以上の陽性ｃｏ８）。これらの細胞
は、レシチン被覆されたＣＥＭ細胞に対して適切な細胞
毒性を示し、モしてに５６２標的に対するＮＫ様溶解活
性は示さなかった。さらに、ＣＤ８”細胞は、Ｂ−細胞
免疫グロブリン合成アッセイにおいてサプレッサー活性
を示さなかった。
その細胞は形質転換されず、増殖相で維持するためには
一定のＩＬ−２を必要とする。その細胞はＨＩＶウィル
スを産生せず、そして洗浄の後、リンホカイン、ＰＨＡ
及びモノクローナル抗体を有さない。
拡張されたＣＤ８°細胞は、安定した表現型、正常な溶
解活性を示し、他のタイプの細胞のためのマーカーの不
在を維持し、そして適切な標的細胞に対して細胞溶解活
性を有した。最っとも重要なことには、これらのｃｏ８
”ｌｌｌ胞は、±ｌ旦上旦で自己ＨＩＶウィルス複製の
阻害を示した。これは、自己拡張されたＣＤ８”細胞と
ＨＩＶにより感染されたＣＤ４°細胞との組合せにより
達成された。
ＨＩＶ複製の完全な抑制は、７日後、１：０．２５（Ｃ
Ｄ４　：　ＣＤ８　）のような低い比で達成された。異
なった期間及び異なったＣＤ４・：ＣＤ８の比は、異な
った供与体により包含されるが、しかしすべての場合、
ＨＩＶ抑制は自己環境下で完結し、培養において３５日
間まで続いた（最長期間が試験された）。
要約すれば、これらのデータは、本発明の方法によりＰ
ＢＭＣから捕獲され、そしてリンホカイン力により回収
されたＣＤ８”細胞は、（１）表現型的に純粋であり、
（２）４７　ビトロで指数増殖することができ、（３）
指数増殖の間、表現型的に安定しており、（４）可能性
ある適切な細胞毒性活性であることができ、（５）ＣＤ
８°細胞がＨＩ■血清陽性供与体から捕獲される場合、
自己ＣＤ４”細胞におけるＨＩＶ複製を抑制することが
でき、（６）＝船釣にＭＨＣ及び抗原制限細胞毒性を示
し、（７）自己反応性を示さず、（８）自己認識を示さ
ず、（９）サプレッサー細胞活性を示さず、（１０）形
質転換されず、（１１）ＨＩＶウィルスを産生せず、そ
して（１２）洗浄の後、培養過程に由来する残留生物学
的物質を保持しない。これらの細胞は、種々の治療用途
、たとえばＡＩＤＳ、サイトメガロウィルス感染、ＥＢ
Ｖ感染、トキソプラスマ感染、等のために適切である。
さらに、ＣＤ８”細胞は、癌患者からの腫瘍又はリンパ
様均質物から本発明の方法により単離される場合、次の
例に示されるように、実質的な抗−癌活性を示す。
Ｃ６゛　　　１　ンパ 癌患者からの腫瘍又はリンパ様組織の酵素消化により得
られた細胞懸濁液を、表面に結合されるＣＤ４又はＣＤ
８モノクローナル抗体を含む装置中に導入した。０口４
°又はＣＤ８”細胞を捕獲し、そしてそれらを音波処理
又はリンホカイン力のいづれかにより回収した後、その
回収された細胞は、９８％以上生存しており、そして９
５％以上表現型的に純粋なＣＤ４”又はＣＤ８”である
ことが示された。
試験されたすべての場合において、精製されたＣＤ４’
″又は精製されたＣＤ８＋細胞のいづれかは、分離され
ていない出発組織悲濁液と少なくとも同じはと自己腫瘍
細胞毒性を示した。精製された集団は、同種免疫腫瘍の
非特異的殺害を示さなかった。精製された集団は、対数
増殖することができ、生存性を維持することができ、表
現型的均等性及び自己ＩＩＩｆ！１１細胞毒性を示すこ
とができた。細胞毒性細胞の表現型は、腫瘍型の間で異
なり、すなわちＣＤ８”は黒色腫及び鱗状細胞癌のため
に卓越し、ＣＤ４°は腎細胞癌のために卓越する。
Ｄ、リンホカイン　　　キラー　　（ＬＡＫ次の例にお
いては、抗−ＣＤ５、抗−ＣＤ１４及び抗−ＣＤ２０モ
ノクローナル抗体が、ＮＫ−細胞についての負の選択に
より富化するためにＰＢＭＣを消耗する本発明の装置に
使用された。抗体は、ＣＤ５”表現型を約９８％以上、
ＣＤ１４”表現型を５０％以上及びＣＤ２０”表現型を
９０％以上消耗することができることが示された。ＬＡ
Ｋ細胞を得るために、１．５×１０８個の単核細胞が、
ＣＤ５モノクローナル抗体を含む収集装置に添加された
。３０分間のインキュベーションの後、非付着性細胞を
デカントすることにより回収し、そして共有結合される
抗−ＣＤ１４抗体を含む装置に移した。インキュベーシ
ョンの後、非付着性細胞をデカントすることにより再び
回収し、そして第３装置に移した。この装置は表面に共
有結合されるＣＤ２０モノクローナル抗体を含む。
インキュベーションを室温で３０分間、再び行なった０
次に、第３集団の非付着性細胞を４８〜７２時間、ＩＬ
−２中で培養し、そしてそれらの溶解活性を、ＮＫ活性
のためにはに５６２及びＬＡＫ活性のためにはＣ０ＬＯ
−２０５細胞を用いて、標準の４時間クロム開放アッセ
イにより検出した。標的に対するエフェクターの異なっ
た割合についての％特異的熔解性を決定し、ここで標的
に対するエフェクターの割合は２．５〜２０であった。
いくつかの異なった正常な供与体からの細胞を用いれば
、ＬＡＫ活性の富化は、同一の条件下で培養された投入
細胞よりも５０％〜３００％異なった。
本発明の装置に由来する細胞集団は、Ｔ−及びＢ−細胞
を実際に有さないＬＡＫ前駆体のために実質的に富化さ
れ、モして単球を有意に消耗することが示された。本発
明の装置により精製されたＬＡＫ前駆体の表現型は、Ｃ
Ｄ　３−　、　ＣＤ１６−及びＬｅｕ１９”であること
が見出された。
次の研究においては、溶解単位活性が、精製されたサン
プルにおけるＮＫ細胞の表現型富化と釣り合いを失って
高められるかどうかの問題が論議された。溶解単位を、
１０６個のＮＫエフェクター細胞当たりの投入画分及び
精製された両分について計算した。　１０”個のＮＫエ
フェクター細胞当たり溶解単位の２〜５０倍の上昇が、
前記３段階モノクローナル抗体陰性消耗方法により達成
された。
これは、単球、Ｂ−細胞、Ｔ−細胞消耗法が、ＮＫエフ
ェクター細胞当たりに表わされる溶解単位活性を２〜５
０倍、高めることを確立した。この上昇は、ＬＡＫ活性
に対して阻害的影響を直接的又は間接的に及ぼす他の細
胞の除去により達成される。Ｎｉｉ＋　星＆１ｒｎｔ、
Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ（１９８８）４１　：　３３〜４０　
；　Ｈｏｙｅｒ亙（！ｌ’　、　、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ
ｅｓ、　（１９８６）４６　：　２８３４〜２９３８を
参照のこと、これらの著者は、活性化された自己単球に
より、ヒト活性化キラー細胞／ＩＬ−２活性化を下げる
調節を報告する。この方法は、ＮＫ活性化を行なうため
に必要とされる培養供給源の節約をもらたす合計細胞数
の９０％減少を達成し；そして溶解活性における２〜５
０倍の増加率がＮＫエフェクター細胞基礎当たりに表わ
された。
上記データは、本発明の方法が、ＩＬ−２／ＬＡＫ療法
の効力を改良し、治療の費用を低くし、そしてＩＬ−２
活性化の後、再浸潤のために標的とされる合計溶解活性
を生成するために必要な白血球搬出により得られる細胞
の合計数を低めることにより本発明の方法の毒性を減じ
ることを示す。
Ｅ、サプレッサー−インー゛ユーサー 前記方法に類似する態様において、サプレッサー／イン
デューサー細胞、すなわち特定のサプレッサー細胞を誘
発する細胞に結合するモノクローナル抗体２Ｈ４を用い
て、自己免疫疾患を処理するためにサプレッサー／イン
デューサー細胞を収穫し、回収し、活性化し、そして拡
張することができる。サプレッサー／インデューサー細
胞は、ＰＢＭＣから明確に選択され、音波処理により収
集装置から回収され、拡張され、そして従来の方法に従
って数的に活性化されるであろう。これらの拡張され、
そして活性化されたサプレッサー／インデューサー細胞
は、問題の自己免疫疾患を有する元の患者に再注入され
、これが、患者の病態生理学に対して適切なサプレッサ
ー細胞活性の誘発をもたらすであろう。
上記結果は、異なった表面マーカーを有する広範囲の種
類の細胞を単離することにおける本発明の装置及び方法
の力を示す、この方法は、研究、診断及び治療に使用さ
れ得る。さらに、この方法は、ひじょうに高い％で細胞
の生存率を保持しながら、細胞の収集、拡張及び活性化
を可能にする。
さらに、血液又はＭｉ織の抗原性成分、たとえば免疫複
合体又はｌ！！ｌ！瘍細胞又は正常な組織が患者から採
取され、そして抗原又は細胞に対する特異的応答を活性
化し又は非活性化するために使用される。
従って、細胞応答は、広範囲のＩＪ類の疾病、たとえば
幹細胞がそれらの表現型を変性するためにトランスフェ
クトされている遺伝病；サプレッサー細胞が免疫応答を
抑制するために使用され得る自己免疫疾患；キラー細胞
がそれらの処理に使用される癌及びウィルス性疾病；及
びヘルパー及びＢ−細胞が広範囲の種類の病原体に対す
る保護に使用され得る病原体由来の疾病に提供され得る
。
本明細書に引用されるすべての出版物及び特許出願は、
引用により本明細書に組込まれる。
前述の発明は、明確に理解するために例示的及び測的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で修飾および変更を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の捕獲装置のために末梢血液又は骨髄
から細胞を調製するための方法の図であり；そして 第２図は、細胞捕獲装置の内部の略図である。 図中の主な番号の説明：１０：分離容器、１２：上清液
、１４：管、２０：標的細胞、２６：細胞捕獲装置、３
０：ポリスチレンフィルム又はシート、３４：受容体、
３６：ダクト。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、複製できる生物学的粒子上に存在する少なくとも１
    つのリガンドに対して特異的な受容体（該受容体は、飽
    和で、実質的に均等な粒子の層を付与するために、実質
    的に均等な濃分布で滑らかなプラスチック表面に結合さ
    れている）を用いて、前記粒子の混合物の組成を変える
    ための方法であって： 前記生物学的粒子が前記表面に結合するように、前記表
    面と前記生物学的粒子の混合物とを十分な時間、接触し
    ； 有意に分布する特異的に結合された生物学的粒子を有さ
    ない非特異的に結合された生物学的粒子を活発に除去し
    ；そして 機械的破壊又はマイトジェン剤を用いるマイトジェン開
    放により、受容体を実質的に有さない前記生物学的粒子
    を開放することを含んで成る方法。 ２、前記マイトジェン剤としてインターロイキン又は増
    殖因子が使用される請求項１記載の方法。 ３、前記粒子が細胞である請求項１記載の方法。 ４、前記細胞が造血細胞である請求項２記載の方法。 ５、非特異的に結合された細胞を有さない前記特異的に
    結合された細胞と少なくとも１つの活性化剤、抗原、前
    記結合された細胞の表面タンパク質に結合できる細胞、
    免疫複合体、マイトジェン剤、トランスフェクションベ
    クター、活性化抗体又は細胞毒性剤とを接触する追加の
    段階を含んで成る請求項４記載の方法。 ６、前記結合された細胞がリンパ球であり、そして前記
    活性化剤がインターロイキンである請求項５記載の方法
    。 ７、第２又は第３表面（これに、前の受容体とは異なる
    受容体が結合されている）と前記開放により得られた、
    受容体を有さない前記生物学的粒子とを接触せしめ、そ
    して少なくとも２又は３種の表面マーカーを欠く細胞集
    団を得るために前記除去及び開放段階をくり返す追加の
    段階を含んで成る請求項１記載の方法。 ８、前記表面が、透明且つ少なくとも実質的に架橋され
    ていないポリスチレン（これに受容体が、アセトアミド
    結合を通して結合される）である請求項１記載の方法。 ９、赤血球細胞及び血小板を有さない造血細胞上に存在
    する少なくとも１つの細胞表面タンパク質に対して特異
    的なモノクローナル抗体（該モノクローナル抗体は、飽
    和で、実質的に均等な細胞の層を付与するために、実質
    的に均等な濃分布で滑らかなプラスチック表面に結合さ
    れている）を用いて、前記細胞の混合物の組成を変える
    ための方法であって：前記細胞が前記表面に結合するよ
    うに、前記表面と前記造血細胞の混合物とを十分な時間
    、接触し； 有意に分布する特異的に結合された細胞を有さない非特
    異的に結合された細胞を活発に除去し；そして 音波処理又は増殖因子様活性を有する化合物と組合して
    マイトジェン剤を用いる分裂開放により、モノクローナ
    ル抗体を実質的に有さない前記細胞を開放することを含
    んで成る方法。 １０、前記モノクローナル抗体が、リンパ球のための少
    なくとも１つのタンパク質マーカーに対して特異的であ
    る請求項９記載の方法。 １１、前記マーカーが、Ｔ−細胞のために存在する請求
    項１０記載の方法。 １２、前記マーカーが、細胞毒性Ｔ−細胞のために存在
    する請求項１１記載の方法。 １３、前記マーカーが、サプレッサーインデューサーＴ
    −細胞のために存在する請求項１２記載の方法。 １４、開放段階の前、免疫複合体、活性化抗体、抗原、
    又は抗原存在細胞（これによって、前記Ｔ−細胞が制限
    される）により前記細胞毒性Ｔ−細胞を活性化する追加
    の段階を含んで成る請求項１２記載の方法。 １５、前記マーカーが、Ｂ−細胞のために存在する請求
    項１０記載の方法。 １６、開放段階の前、前記Ｂ−細胞により制限されたヘ
    ルパーＴ−細胞により前記Ｂ−細胞を活性化する追加の
    段階を含んで成る請求項１５記載の方法。 １７、前記造血細胞が骨髄系の細胞である請求項９記載
    の方法。 １８、ＡＩＤＳ患者の処置のための治療用細胞組成物を
    調製するための方法であって： ＡＩＤＳ患者からの末梢血液の単核細胞とＣＤ８に対し
    て特異的なモノクローナル抗体（該モノクローナル抗体
    は、飽和で、実質的に均等な細胞の層を付与するために
    、実質的に均等な濃分布で滑らかなプラスチック表面に
    結合されている）とを接触し（それによって、ＣＤ８＾
    ＋細胞が前記表面に結合するようになる）； ＣＤ８＾＋結合細胞を残すために、前記結合細胞から非
    特異的結合細胞のすべてを除去し； 音波処理又はマイドジェン剤及びリンホカインの組合せ
    により結合された細胞を開放し；そして治療剤として使
    用するために、細胞溶解活性を有する実質的に均質の表
    現型集団を得るために、前記開放されたＣＤ８＾＋細胞
    を、少なくとも１種のリンホカインと共に少なくとも７
    日間、培養により拡張することを含んで成る方法。 １９、前記細胞源が腫瘍又はリンパ様組織懸濁液であり
    、そして前記抗体がＣＤ８又はＣＤ４であり、そして開
    放された細胞がＣＤ８＾＋又はＣＤ４＾＋であり、そし
    て治療剤として使用するために細胞溶解活性を有する、
    請求項１８記載の癌の処置のための治療用細胞組成物を
    鋼製するための方法。 ２０、前記細胞源が末梢血液、骨髄又はリンパ様組織で
    あり、そして前記抗体がサプレッサー−インデューサー
    −細胞に対して特異的であり、そして前記開放された細
    胞が、自己免疫疾患を抑制するために有効なサプレッサ
    ー−インデューサー活性を有する、請求項１８記載の自
    己免疫疾患の処置のための治療用細胞組成物を調製する
    ための方法。 ２１、前記細胞源が末梢血液、骨髄又はリンパ様組織で
    あり、そして前記抗体が多分化能性前駆細胞に対して特
    異的であり、そして前記開放された細胞が、前記開放さ
    れた細胞に発現できる外来性遺伝子を含んで成るトラン
    スフェクションベクターにより処理される、請求項１８
    記載の遺伝子治療のための細胞性組成物を調製するため
    の方法。 ２２、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）の
    実質的に均質な集団を調製するための方法であって： 癌患者からの末梢血液単核細胞とＣＤ３又はＣＤ５に対
    して特異的なモノクローナル抗体（該モノクローナル抗
    体は、飽和で、実質的に均等な細胞の層を付与するため
    に、実質的に均等な濃分布で滑らかなプラスチック表面
    に結合されている）とを接触し（それによって、ＣＤ３
    ＾＋又はＣＤ５＾＋細胞が前記表面に結合するようにな
    る）； ＣＤ３又はＣＤ５消耗流出液とＣＤ１４、ＣＤ１９、Ｃ
    Ｄ２０に対して特異的なモノクローナル抗体（該モノク
    ローナル抗体は、飽和で、実質的に均等な細胞の層を付
    与するために、実質的に均等な濃分布で滑らかなプラス
    チック表面に結合されている）とを接触し（それによっ
    て、ＣＤ１４、ＣＤ１９及びＣＤ２０の少なくとも１種
    に対して陽性の細胞が前記表面に結合するようになる）
    ；そして 腫瘍細胞に対する細胞溶解活性を有する実質的に均質の
    ＬＡＫ細胞集団を得るために、前記細胞集団を拡張し又
    は活性化するのに十分な時間、リンホカインを含む培養
    中でＣＤ３、−５、−１４、−１９及び−２０のための
    消耗された末結合細胞を培養することを含んで成る方法
    。 ２３、活性化されたＴ−細胞の実質的に均質な集団を調
    製するための方法であって、 末梢血液単核細胞とＴ−細胞に対して特異的なモノクロ
    ーナル抗体（該モノクローナル抗体は、飽和で、実質的
    に均等な細胞の層を付与するために、実質的に均等な濃
    分布で滑らかなプラスチック表面に結合されている）と
    を接触し（それによって、Ｔ−細胞が前記表面に結合す
    るようになる）；実質的に均質のＴ−細胞集団を得るた
    めに、前記抗体から音波処理又は機械的振動により前記
    Ｔ−細胞を開放し（ここで、前記細胞はＴ−細胞に対す
    る抗体を実質的に有さない）； 前記Ｔ−細胞と活性化するＣＤ３特異的モノクローナル
    抗体（該モノクローナル抗体は、飽和で、実質的に均等
    な細胞の層を付与するために、実質的に均等な濃分布で
    滑らかなプラスチック表面に結合されている）とを接触
    し（それによって、前記Ｔ−細胞は前記活性化する抗体
    に結合するようになり、そして従って活性化するように
    なる）；そして 活性化されたＴ−細胞抗体の実質的に均質の集団を得る
    ために、前記活性化する抗体から音波処理又は機械的振
    動により前記結合された活性化Ｔ−細胞を開放すること
    を含んで成る方法。 ２４、請求項９〜２３のいづれか１項記載の方法により
    調製された実質的に均質の細胞集団。
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GR (1) GR3030533T3 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001309800A (ja) * 2000-03-24 2001-11-06 Walter Schubert 細胞特異的標的構造の同定法及び富化法
JP2005336080A (ja) * 2004-05-26 2005-12-08 Asahi Kasei Medical Co Ltd 血管新生療法用細胞の分離回収方法および分離回収システム

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0578740A4 (en) * 1991-04-05 1995-12-20 Univ Minnesota Method of enhancing the immunotherapeutic activity of immune cells by depletion/positive selection of cell subsets
US5725855A (en) * 1991-04-05 1998-03-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of treating tumors with CD8+ -depleted or CD4+ T cell subpopulations
FR2709309B1 (fr) * 1993-08-25 1995-11-10 Centre Nat Rech Scient Compositions cellulaires, préparation et utilisations thérapeutiques.
EP0852618A1 (en) * 1995-07-25 1998-07-15 Celltherapy Inc. Autologous immune cell therapy: cell compositions, methods and applications to treatment of human disease
WO1999012553A1 (en) * 1997-09-08 1999-03-18 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods for producing human antibodies in scid mice using dendritic cells
AU777970C (en) 1999-05-07 2006-08-17 F. Hoffman-La Roche Ag Treatment of autoimmune diseases with antagonists which bind to B cell surface markers
AU5967100A (en) * 1999-07-21 2001-02-13 Britta Christensen A novel method for the improved isolation of a target cell population
DE10014685B4 (de) * 2000-03-24 2004-07-01 Schubert, Walter, Dr. Verfahren zur Identifizierung von zellspezifischen Zielstrukturen
US7462181B2 (en) 2002-06-04 2008-12-09 Stanford Office Of Technology Licensing Device and method for rapid aspiration and collection of body tissue from within an enclosed body space
US20070276352A1 (en) * 2002-06-04 2007-11-29 Stemcor Systems, Inc. Removable device and method for tissue disruption
US8895298B2 (en) 2002-09-27 2014-11-25 The General Hospital Corporation Microfluidic device for cell separation and uses thereof
EP1576126A3 (en) * 2002-10-30 2005-10-26 Pointilliste, Inc. Systems for capture and analysis of biological particles and methods using the systems
DE10311981A1 (de) * 2003-03-12 2004-09-23 Oligene Gmbh Vorrichtung und Verfahren für den vivo-Zelltransfer
WO2005014801A1 (en) * 2003-08-04 2005-02-17 University Court Of The University Of Edinburgh Improvements in cell culture productivity
US7996825B2 (en) * 2003-10-31 2011-08-09 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Cross-file inlining by using summaries and global worklist
US20060018911A1 (en) * 2004-01-12 2006-01-26 Dana Ault-Riche Design of therapeutics and therapeutics
US20070196820A1 (en) 2005-04-05 2007-08-23 Ravi Kapur Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles
US8921102B2 (en) 2005-07-29 2014-12-30 Gpb Scientific, Llc Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
US8137912B2 (en) 2006-06-14 2012-03-20 The General Hospital Corporation Methods for the diagnosis of fetal abnormalities
EP2589668A1 (en) 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
EP2029779A4 (en) 2006-06-14 2010-01-20 Living Microsystems Inc HIGHLY PARALLEL SNP GENOTYPING UTILIZATION FOR FETAL DIAGNOSIS
US8691568B2 (en) * 2006-11-22 2014-04-08 Hua Liu Method for preparing cell populations with anti-tumor immune response activity
PT2562268T (pt) 2008-09-20 2017-03-29 Univ Leland Stanford Junior Diagnóstico não invasivo de aneuploidia fetal por sequenciação
US8895291B2 (en) 2010-10-08 2014-11-25 Terumo Bct, Inc. Methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system with control conditions
US9617506B2 (en) 2013-11-16 2017-04-11 Terumo Bct, Inc. Expanding cells in a bioreactor
EP3613841B1 (en) 2014-03-25 2022-04-20 Terumo BCT, Inc. Passive replacement of media
CN106715676A (zh) 2014-09-26 2017-05-24 泰尔茂比司特公司 按计划供养
US20160178490A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-23 Saint-Gobain Performance Plastics Corporation Capture system of cells and methods
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
EP3397172A4 (en) 2016-02-01 2019-03-06 Regenmed Systems, Inc. CANNULA FOR TISSUE BREAKAGE
US11965175B2 (en) 2016-05-25 2024-04-23 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
US11702634B2 (en) 2017-03-31 2023-07-18 Terumo Bct, Inc. Expanding cells in a bioreactor
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1676579A (en) 1927-02-14 1928-07-10 Daniel Laurence Light-treatment process
US3016336A (en) 1957-09-30 1962-01-09 Fermco Lab Inc Deoxygenating method and product
US3645849A (en) 1969-04-17 1972-02-29 Gray Ind Inc Stability of enzymes
US3956219A (en) 1973-02-01 1976-05-11 Eli Lilly And Company Crosslinked polystyrene and substituted polystyrene compositions
IL43366A (en) 1973-10-04 1976-09-30 Yeda Res & Dev Production of organic reagents for the acylation of organic compounds
US4250139A (en) 1979-02-01 1981-02-10 Collagen Corporation Microwave sterilization of dry protein
US4497796A (en) * 1980-03-26 1985-02-05 The Regents Of The University Of California Gene transfer in intact mammals
US4464165A (en) 1980-11-24 1984-08-07 American Hoechst Corporation Material and method for removing immunoglobulins from whole blood
US4438198A (en) 1981-09-30 1984-03-20 Trimedyne, Inc. Biochemically active matrix for use in a bio-artificial organ
US4699877A (en) 1982-11-04 1987-10-13 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for detecting human tumors
US4460445A (en) 1983-02-28 1984-07-17 Milliken Research Corporation Radiation-stable polyolefin compositions containing benzaldehyde acetals
DE3311889A1 (de) 1983-03-31 1984-10-11 Byk-Mallinckrodt Chemische Produkte Gmbh, 6057 Dietzenbach Verfahren zur irreversiblen bindung von protein an polystyroloberflaechen unter erhaltung der biologischen aktivitaet, so erhaltene polystyroloberflaechen und ihre verwendung
US4727027A (en) 1983-05-02 1988-02-23 Diamond Scientific Co. Photochemical decontamination treatment of whole blood or blood components
JPS6035263A (ja) * 1983-08-05 1985-02-23 Wako Pure Chem Ind Ltd 不溶性担体に固定化された免疫活性物質の安定化法及び該物質を構成単位として含む生理活性物質測定用試薬
US4620908A (en) 1983-10-03 1986-11-04 Biocell Laboratories, Inc. Method for destroying microbial contamination in protein materials
US4714680B1 (en) 1984-02-06 1995-06-27 Univ Johns Hopkins Human stem cells
US4614513A (en) 1984-08-13 1986-09-30 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method and apparatus for treatment to remove immunoreactive substances from blood
FR2582815B1 (fr) 1985-05-31 1989-04-07 Commissariat Energie Atomique Procede de separation des anticorps antifacteur viii : c, utilisable notamment pour l'epuration du plasma sanguin d'un hemophile de type a
US4690915A (en) * 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US5081029A (en) 1985-09-25 1992-01-14 Oncogen Methods of adoptive immunotherapy for treatment of aids
WO1987004628A1 (en) * 1986-01-30 1987-08-13 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunoselection method
SE459008B (sv) * 1986-09-04 1989-05-29 Bioinvent Int Ab Saett att framsstaella humana monoklonala antikroppar
US4851341A (en) 1986-12-19 1989-07-25 Immunex Corporation Immunoaffinity purification system
US5241012A (en) 1987-05-19 1993-08-31 Applied Immune Sciences, Inc. Activated and conjugated polystyrene substrate
US5215926A (en) * 1988-06-03 1993-06-01 Cellpro, Inc. Procedure for designing efficient affinity cell separation processes
JP2639834B2 (ja) 1988-11-30 1997-08-13 有限会社ジオリサーチ 免疫記憶細胞懸濁液およびその調製方法
US4933410A (en) 1989-03-29 1990-06-12 Applied Immunesciences, Inc. Covalent attachment of macromolecules on substrate surfaces
US5081030A (en) * 1989-04-25 1992-01-14 The Johns Hopkins University Release of cells from affinity matrices
US5126132A (en) 1989-08-21 1992-06-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Tumor infiltrating lymphocytes as a treatment modality for human cancer

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001309800A (ja) * 2000-03-24 2001-11-06 Walter Schubert 細胞特異的標的構造の同定法及び富化法
JP2005336080A (ja) * 2004-05-26 2005-12-08 Asahi Kasei Medical Co Ltd 血管新生療法用細胞の分離回収方法および分離回収システム

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