CN116814731A - 纯化t细胞的方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及纯化T细胞的方法及其用途，具体提供一种纯化CD3+T细胞的方法，其特征在于，包括步骤：(1)在DPBS中孵育标记的抗CD3抗体和PBMC，所述PBMC中的CD3+T细胞比例小于30％，和(2)通过所述标记分离PBMC中的CD3+T细胞。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及纯化T细胞的方法及其用途。
背景技术
过去二十年来，癌症治疗中的免疫细胞疗法有飞跃性的发展。免疫细胞疗法使用患者自身或供者的免疫细胞，在体外经培养扩增或基因修饰后回输到患者体内，以清除或控制癌症细胞。CAR-T细胞属于免疫细胞疗法的一种，患者或供者的T细胞经体外活化及基因工程修饰，能在T细胞上表达癌变细胞相关的抗原识别分子片段，并在胞内连接有T细胞受体活化分子及共刺激信号分子等，在与癌变细胞抗原结合后，传递下游信号，使CAR-T细胞执行杀伤癌变细胞的功能。
目前全世界已有七款CAR-T细胞产品通过监管机构审查并上市。CAR-T细胞从实验室走出至产业化阶段，其生产工艺经过许多改良，主要的操作步骤包含以下数个工序：患者或供者机采血采集、自单采血中分离PBMC、自PBMC中分离及活化T细胞、CAR基因修饰T细胞、CAR-T细胞扩增、CAR-T细胞灌装及冻存。T细胞为CAR-T细胞生产的基础材料，因此需从PBMC中分离出T细胞，去除不需要的细胞族群，如CD19+B细胞及CD14+单核细胞。由于CD3为T细胞表面的重要抗原标志，且B细胞及单核细胞的细胞膜上皆不表达CD3，所以T细胞的分离主要利用共价偶联抗-CD3和抗-CD28抗体的磁珠与PBMC共同孵育后，磁性分离与磁珠结合的T细胞。磁珠分选方式固然可以去除大部分悬浮的CD3阴性细胞，但由于单核细胞在体外培养时具有贴附在培养容器表面的特性，因此在磁性分选后，仍有部分单核细胞残留在培养容器中，根据过去文献发表及本公司研发经验，这部分单核细胞还可能吞噬磁珠，影响T细胞的活化。因此，在磁珠分选过程中，如何排除单核细胞的影响是需要研究的课题。
此外，上述CAR-T生产的操作工序固然可以在生物安全柜的开放环境中以培养板及培养瓶作为培养容器，并以移液管及离心管完成操作，但根据2019年11月国家药品监督管理局食品药品审核查验中心发布的《GMP附录-细胞治疗产品》(征求意见稿)中第十三条【密闭系统】中：“宜采用密闭设备、管路进行细胞治疗产品的生产操作；密闭设备、管路安置环境的洁净度级别可适当降低”，因此，CAR-T细胞的生产在封闭系统中进行较为符合GMP原则的指导，也是目前同行业中大多数采取的方式。
但是，用于制备CAR-T细胞的T细胞在处理过程中需要根据CD3+T细胞阳性比例使用不同的方法和试剂，导致整个制备过程难以实现高封闭性。
发明内容
本发明通过优化T细胞的纯化过程，实现以封闭工艺高效纯化CD3+T细胞，降低单核细胞对CAR-T细胞制备的不良影响。
本发明第一方面提供一种纯化CD3+T细胞的方法，包括步骤：
(1)在DPBS中孵育标记的抗CD3抗体和PBMC，和
(2)通过所述标记分离PBMC中的CD3+T细胞，
其中，所述方法不包括根据PBMC中的CD3+T细胞比例选择孵育缓冲液、调整细胞密度和孵育时间的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述PBMC中的CD3+T细胞比例小于30％。
在一个或多个实施方案中，所述标记为便于将抗体和含表面抗原的细胞的复合物与体系中的其他组分分离的物质。
在一个或多个实施方案中，孵育混合物中还含有标记的抗CD28抗体。在一些实施方案中，所述抗CD3抗体和/或抗CD28抗体与所述标记偶联。
在一个或多个实施方案中，所述标记包括但不限于生物素、固相载体。在一些优选的实施方案中，所述固相载体为磁颗粒。
在一个或多个实施方案中，所述DPBS中CD3+T细胞密度为4-10*106个细胞/mL，优选为4-7*106个细胞/mL或7-10*106个细胞/mL。
在一个或多个实施方案中，所述孵育为摇动孵育，所述摇动为20-500rpm，优选50-100rpm。在一些实施方案中，所述孵育的温度为10-40℃。在一些实施方案中，所述孵育时间为20-60分钟，优选30-45分钟。
在一个或多个实施方案中，所述方法具体包括步骤：
(a)DPBS中重悬PBMC，其中CD3+T细胞密度为4-10*106个细胞/mL，优选为4-7*106个细胞/mL或7-10*106个细胞/mL；
(b)加入等体积的偶联抗CD3抗体的磁颗粒，摇动孵育20-60分钟；
(c)通过磁性捕获分离结合有CD3+T细胞的磁颗粒；
(d)将磁颗粒与细胞分离，获得CD3+T细胞，
并且，所述方法不包括获取PBMC中的CD3+T细胞比例的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括活化CD3+T细胞的步骤，例如使用含IL-2的培养基孵育CD3+T细胞至少24小时，优选48小时。
在一个或多个实施方案中，所述方法在纯化CD3+T细胞前，还包括获取PBMC的步骤。
本发明还提供一种使用Sepax C-Pro细胞处理系统纯化CD3+T细胞的方法，包括步骤：(I)使用Sepax C-Pro细胞处理系统对血液样品进行PBMC分离和冻存，去除样品中残留的红细胞及白细胞中的多核细胞，(II)使用Sepax C-Pro细胞处理系统对冻存的PBMC进行洗涤和复苏，恢复PBMC的活率及功能性，去除死细胞，(III)使用Sepax C-Pro细胞处理系统对复苏的PBMC进行CD3+T分选和活化，包括使用本发明第一方面任一实施方案所述的方法。
优选地，所述方法包括步骤：
(I)使用血细胞分离机采集血浆20mL～200mL，置于2～8℃冷藏，
(II)使用Sepax C-Pro细胞处理系统及封闭管路套件(例如CT-90.1)，执行NeatCell程序，对单采血样品进行PBMC分离，将PBMC重悬于PBMC冻存液，
(III)使用Sepax C-Pro细胞处理系统及封闭管路套件(例如CT-90.1)，使用CultureWash程序，将融解的PBMC重悬于培养基中，以37±1℃及5±0.5％CO2培养过夜，所述PBMC中的CD3+T细胞比例小于30％，
(IV)使用Sepax C-Pro细胞处理系统及封闭管路套件(例如CT-90.1)，用DPBS洗涤PBMC和共价偶联抗CD3和抗CD28抗体的磁珠，并在DPBS中以60rpm室温摇动孵育所述磁珠和PBMC 30分钟，其中CD3+T细胞密度为4-10*106个细胞/mL(优选为4-7*106个细胞/mL或7-10*106个细胞/mL)，获得富集在磁珠上的CD3+T细胞；然后以含IL-2的培养基重悬CD3+细胞，37±1℃、5±0.5％CO2培养，分离磁珠后获得纯化的CD3+T细胞。
本发明还提供一种制备CAR-T细胞的方法，包括以下步骤：
(1)使用血细胞分离机采集血浆20mL～200mL，置于2～8℃冷藏，
(2)使用Sepax C-Pro细胞处理系统及封闭管路套件(例如CT-90.1)，执行NeatCell程序，对单采血样品进行PBMC分离，将PBMC重悬于PBMC冻存液，
(3)使用Sepax C-Pro细胞处理系统及封闭管路套件(例如CT-90.1)，使用CultureWash程序，将融解的PBMC重悬于培养基中，以37±1℃及5±0.5％CO2培养过夜，
(4)使用Sepax C-Pro细胞处理系统及封闭管路套件(例如CT-90.1)，用DPBS洗涤PBMC和共价偶联抗CD3和抗CD28抗体的磁珠，并在DPBS中以60rpm室温摇动孵育所述磁珠和PBMC 30分钟，其中CD3+T细胞密度为4-10*106个细胞/mL(优选4-7*106个细胞/mL或7-10*106个细胞/mL)，获得富集在磁珠上的CD3+T细胞；然后以含IL-2的培养基重悬CD3+细胞，37±1℃、5±0.5％CO2培养，分离磁珠后获得纯化的CD3+T细胞，
(5)使用Sepax C-Pro细胞处理系统及封闭管路套件(例如CT-90.1)，在RetroNectin包被的细胞培养袋中，将细胞悬液和含有CAR编码序列的病毒在37±1℃及5±0.5％CO2的条件下中培养过夜，获得CAR-T细胞，
(6)使用Sepax C-Pro细胞处理系统及封闭管路套件(例如CT-90.1)，洗涤CAR-T细胞并以含IL-2培养基重悬，在37±1℃及5±0.5％CO2的条件下传代培养至所需细胞数，
(7)使用Sepax C-Pro细胞处理系统及封闭管路套件(例如CT-90.1)，使用氯化钠注射液洗涤CAR-T细胞并以冻存液重悬CAR-T细胞，使用程序降温仪冻存细胞。
本发明还提供本发明第一方面任意实施方案所述的纯化CD3+T细胞的方法在制备含活化的T细胞的试剂中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述活化的T细胞是CAR-T细胞。
本发明还提供一种消除或减弱细胞对固相载体的非特异性粘附的方法，包括在DPBS存在的条件下孵育所述细胞和固相载体。
在一个或多个实施方案中，所述细胞优选单核细胞，例如PBMC。
在一个或多个实施方案中，所述固相载体是容器壁或磁颗粒。
本发明具有以下有益效果：
改进后的步骤能有效避免CD3低比例及CD14高比例的PBMC样品在磁珠分选过程中发生单核细胞吞噬磁珠影响细胞活化的现象，使细胞得到正常活化及扩增。其次，改进后的工艺可简化CD3+T细胞分选活化的操作，不需要根据样品中CD3比例进行不同的计算，实现真正全封闭流程，降低污染和错误的可能性。
附图说明
图1是封闭工艺CAR-T细胞制备流程示意图。
图2是封闭工艺与改进前开放工艺的制备的CAR-T细胞性状检测结果。
图3是封闭工艺与改进前开放工艺的制备的CAR-T细胞功能检测结果。
图4是封闭工艺中CD3+T细胞分选活化工序操作步骤与改进前开放工艺的步骤及参数比较。
图5是孵育缓冲液对CAR-T细胞制备中间性状的影响。
图6是磁珠孵育时间对CAR-T细胞制备中间性状的影响。
图7是磁珠孵育细胞密度CAR-T细胞制备中间性状的影响。
图8是三个低CD3高CD14的PBMC样品制备CAR-T细胞的实验结果。
具体实施方式
在工艺变更的研究实验中，由于改进前开放工艺中的CD3+T细胞分选的操作较为复杂，需以PBMC样品中的CD3比例来决定磁珠孵育时的缓冲液种类、孵育时间及细胞密度。因此在发展封闭工艺制备CAR-T的过程中，发明人尝试将磁珠孵育缓冲液固定为含5％人血浆的X-VIVO培养基(Lonza X-VIVOTM15培养基)，取代原有的X-VIVO或DPBS。然而在实验过程中发现，使用含5％人血浆的X-VIVO培养基作为磁珠孵育缓冲液时，会出现单核细胞吞噬磁珠的现象，影响CD3+T细胞分选及活化效果。此外，本公司临床试验I期的结果表明使用不含血浆的X-VIVO作为磁珠孵育缓冲液的两名CD3比例低CD14比例高的供者，其CAR-T细胞扩增速率明显低于使用DPBS作为磁珠孵育缓冲液的其他供者。以上两个现象表明，不论是否添加人血浆，使用X-VIVO作为磁珠孵育缓冲液都会对CAR-T制备造成不良影响，且原因可能与单核细胞相关。
基于此，本发明中依据原有开放工艺，提供了改进的封闭工艺纯化CD3+T细胞的方法及其用途，并能解决CD14+单核细胞影响磁珠分选步骤的问题。本发明的CD3+T细胞分选活化工序中，PBMC与共价偶联抗-CD3和抗-CD28抗体的磁珠共同孵育时，删除因PBMC中CD3细胞比例不同而选用不同孵育缓冲液的操作，固定使用DPBS作为孵育缓冲液。
本文中，样品是包含PBMC的任何血液来源的样品，例如全血。优选地，样品是符合采集规程及运输方式的机采单采血。
DPBS全称Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline，即杜氏磷酸缓冲盐溶液，主要成分包括NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4等，pH为7.2-7.4。根据是否含有钙镁离子将DPBS分为两种，与常规PBS不同的是DPBS磷酸盐的含量稍低。
因此，本发明第一个方面提供一种纯化CD3+T细胞的方法，包括步骤：
(1)在DPBS中孵育标记的抗CD3抗体和PBMC，和
(2)通过所述标记分离PBMC中的CD3+T细胞，
其中，所述方法不包括根据PBMC中的CD3+T细胞比例选择孵育缓冲液、调整细胞密度和孵育时间的步骤。所述PBMC中的CD3+T细胞比例大于或等于或小于30％。所述DPBS中还含有标记的抗CD28抗体。
本文所述“标记”是便于将抗体(例如抗CD3抗体和抗CD28抗体)和含表面抗原(例如CD3和CD28)的细胞的复合物与体系中的其他组分分离的物质，例如生物素、固相载体，其中抗CD3抗体和/或抗CD28抗体与这些标记偶联。优选的固相载体是磁颗粒，当然，本领域通常用于偶联抗体的其他固相载体也可用于本发明。
抗CD3抗体和抗CD28抗体可以是本领域已知的任何能结合CD3、CD28的抗体。优选的序列如SEQ ID NO:1和2所示。
本发明方法不包括根据PBMC中的CD3+T细胞比例选择孵育缓冲液、调整细胞密度和孵育时间的步骤。发明人发现，当PBMC的细胞密度为4-10*106个细胞/mL时，不论其中CD3的比例如何，均可使用DPBS进行细胞重悬、抗体孵育。现有技术中，需要根据PBMC中CD3+T细胞的比例使用不同的细胞密度和孵育体系：当CD3+T细胞比例大于或等于30％时，需要将细胞重悬于DPBS中，并且孵育时CD3+T细胞的细胞密度需要调整为1*107个细胞/mL；而当CD3+T细胞比例小于30％时，需要将细胞重悬于细胞培养基中，并且孵育时总细胞密度需要调整为3*107个细胞/mL。整个过程涉及以PBMC样品中的CD3比例来决定磁珠孵育时的缓冲液种类、孵育时间及细胞密度，增加了封闭操作的难度。本发明方法无需获取PBMC中的CD3+T细胞比例，整个纯化过程可以全封闭进行。优选地，所述PBMC中的CD3+T细胞比例小于30％。
令人意外的是，DPBS可以消除或减弱单核细胞对固相载体的非特异性粘附性，因此，用DPBS孵育单核细胞和固相载体可以减弱单核细胞占据、吞噬固相载体的效应，降低其对T细胞活化的影响。这可能是本发明方法无需根据PBMC中的CD3+T细胞比例选择孵育缓冲液、调整细胞密度和孵育时间的原因之一。
发明人还发现，根据本发明方法，无需根据DPBS中的CD3的比例来调整抗体孵育的时间。现有技术中，当CD3+T细胞比例大于或等于30％时，孵育时间不能超过30分钟；当CD3+T细胞比例小于30％时，孵育时间需要达到60分钟。而本发明方法中，孵育时间无需调整，可以为20-60分钟，优选30-45分钟。
所述孵育是摇动孵育，所述摇动是20-500rpm，优选50-100rpm，例如60rpm。
本发明的纯化CD3+T细胞的方法具体包括步骤：
(1)在DPBS中重悬PBMC，CD3+T细胞密度为4-10*106个细胞/mL，优选为4-7*106个细胞/mL或7-10*106个细胞/mL，
(2)加入等体积的偶联抗CD3抗体的磁颗粒，摇动孵育20-60分钟，
(3)通过磁性捕获分离结合有CD3+T细胞的磁颗粒，
(4)将磁颗粒与细胞分离，获得CD3+T细胞，
并且，所述方法不包括获取PBMC中的CD3+T细胞比例的步骤。
所述方法还包括活化CD3+T细胞的步骤。活化CD3+T细胞的方法本领域周知，例如使用含IL-2的培养基孵育CD3+T细胞至少24小时，优选48小时。
所述方法在纯化CD3+T细胞前，通常还包括获取PBMC的步骤，例如血细胞提取、PBMC分离、PBMC复苏，这些均是本领域技术人员的常规知识。示例性地，本发明提供使用Sepax C-Pro细胞处理系统纯化CD3+T细胞的方法：(1)使用Sepax C-Pro细胞处理系统对血液样品进行PBMC分离和冻存，去除样品中残留的红细胞及白细胞中的多核细胞，(2)使用Sepax C-Pro细胞处理系统对冻存的PBMC进行洗涤和复苏，使PBMC的活率及功能性得到恢复，去除死细胞，(3)使用Sepax C-Pro细胞处理系统对复苏的PBMC执行本发明的纯化CD3+T细胞的方法，对PBMC进行CD3分选、活化。通常，Sepax C-Pro细胞处理系统与其对应的封闭管路套件CT-60.1一起使用。具体地，使用Sepax C-Pro细胞处理系统的纯化CD3+T细胞的方法的具体步骤包括：
样品采集：
使用血细胞分离机(Spectra、Spectra/>FenwalTM/>或等同设备的标准机采设备)，在临床中心病区进行白细胞及血浆的采集分离。单采血采集量约为20mL～200mL，血浆量约为20mL～200mL。将采集完成的单采血及血浆样品放置于2～8℃冷藏运输箱内，以冷链物流方式运输至细胞制备中心。本领域技术人员周知，根据《药品生产质量管理规范(2010年修订)》，将洁净区进行ABCD分级，A级：高风险操作区，如灌装区、放置胶塞桶和与无菌制剂直接接触的敞口包装容器的区域及无菌装配或连接操作的区域，应当用单向流操作台(罩)维持该区的环境状态。单向流系统在其工作区域必须均匀送风，风速为0.36-0.54m/s(指导值)。应当有数据证明单向流的状态并经过验证。在密闭的隔离操作器或手套箱内，可使用较低的风速。B级：指无菌配制和灌装等高风险操作A级洁净区所处的背景区域。C级和D级：指无菌药品生产过程中重要程度较低操作步骤的洁净区。本发明在细胞制备中心的B+A(即B级背景下的A级环境)或C+A(C级背景下的A级环境)环境下，开始进行以下的细胞处理步骤。
PBMC分离：
PBMC为外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)是指外周血中的单个核细胞，主要包含淋巴细胞及单核细胞和其他少量细胞。为目前T细胞相关细胞治疗的重要原材料。
本工序使用Sepax C-Pro细胞处理系统及对应的一次性使用封闭管路套件CT-90.1对单采血进行PBMC分离。首先将CT-90.1套件安装至Sepax C-Pro细胞处理系统上，再将装有患者单采血的单采血袋与CT-90.1套件连接，执行仪器制造商开发的NeatCell程序以分离PBMC。NeatCell程序最终将PBMC重悬于PBMC冻存液中并输出至细胞冻存袋，细胞冻存袋在程序降温仪中进行冻存，最后转移至液氮罐中储存。装有供者血浆的血袋在56℃水浴锅中灭活30分钟后，以离心方式使血浆中的变性蛋白及其他杂质沉降到袋子底部。利用血液分浆夹将上清血浆转移至冻存袋中，于-80℃冻存备用。本工序目的在于分离出CAR-T细胞制备所需要的PBMC，去除单采血样品中残留的红细胞及白细胞中的多核细胞。处理过的血浆用以配制整个制备过程中所使用的培养基，培养基中含5％人血浆。
PBMC复苏：
本工序使用Sepax C-Pro细胞处理系统及对应的一次性使用封闭管路套件CT-60.1对融解的PBMC悬液进行洗涤并将冻存液置换为培养基，开始PBMC缓解培养。首先在Sepax C-Pro细胞处理系统中选择CultureWash程序并安装CT-60.1套件，执行程序至仪器提示连接细胞冻存袋的步骤。将在液氮中保存的冻存PBMC取出，置于37℃水浴中，轻柔摇晃袋体使PBMC悬液融化。将解冻的细胞冻存袋连接到套件上，继续执行CultureWash程序。CultureWash程序最终将PBMC以培养基重悬，并输出至PL325细胞培养袋(OrigenBiomedical)中，经取样计数后，再以Sepax C-Pro细胞处理系统的Dilution程序补加培养基于PBMC悬液中，调整细胞密度。将装有PBMC悬液的PL325细胞培养袋放入二氧化碳培养箱，以37±1℃及5±0.5％CO2培养过夜。本工序目的在于使PBMC的活率及功能性得到恢复，去除凋亡细胞。
CD3+T细胞纯化：
本工序使用Sepax C-Pro细胞处理系统及对应的一次性使用封闭管路套件CT-60.1对缓解培养完成的PBMC进行洗涤，之后以共价偶联抗-CD3和抗-CD28抗体的磁珠对PBMC进行CD3分选及活化。首先将CT-60.1套件安装至Sepax C-Pro细胞处理系统上，并自二氧化碳培养箱取出缓解培养完成的PBMC，将承装PBMC的细胞培养袋管路与200目过滤网接管后再连接至套件上，在细胞悬液进入套件时能截留缓解培养后产生的絮状物。将作为洗涤液和磁珠孵育缓冲液的DPBS包袋连接至套件上，执行CultureWash程序以DPBS洗涤PBMC。CultureWash程序最终将PBMC以DPBS重悬，并输出至PL240细胞培养袋(OrigenBiomedical)中。洗涤后PBMC经取样计数，再根据PBMC流式表型检测结果计算CD3+细胞数，并以Dilution程序补加DPBS于PBMC悬液中，调整CD3+细胞密度。在上述PL240细胞培养袋中加入以DPBS清洗过的共价偶联抗-CD3和抗-CD28抗体的磁珠(CTSTMDynabeadsTMCD3/CD28)，利用水平摇床使细胞磁珠共孵育期间得到充分混合。孵育完成后将细胞培养袋置于CTSDynaMag磁性分离器上，将与磁珠结合的CD3+细胞以磁性捕获并留滞在细胞培养袋中，弃去上清及CD3-细胞。将细胞培养袋重新与套件连接，以Dilution程序加入含IL-2的培养基重悬CD3+细胞。将装有CD3+细胞悬液的PL240细胞培养袋放入二氧化碳培养箱，在37±1℃及5±0.5％CO2的环境下活化培养。本工序目的在于分选出用以转导病毒的CD3+T细胞，进一步去除其他细胞族群，并以CD3及CD28抗体共刺激T细胞，利于逆转录病毒的转导。本发明封闭工艺CD3+T细胞纯化操作步骤与改进前开放工艺的步骤及参数比较参见图4。
本文中，“冻存液”指用于将其中的细胞冷冻保存的介质。本领域技术人员知晓适用于细胞，特别是免疫细胞(例如PBMC或CD3+T细胞)的冻存液组分。这些冻存液通常可商购。
本文中，“培养基”指用于培养细胞的介质。本领域技术人员知晓适用于细胞，特别是免疫细胞(例如PBMC或CD3+T细胞)的培养基组分。这些冻存液通常可商购，例如X-VIVO15。
纯化的CD3+T细胞可用于后续研究，例如单链可变片段于细胞表面表达的鉴定、CAR分子于T细胞上的表达量、CAR-T细胞杀伤能力、CAR-T细胞的细胞因子分泌图谱、CAR-T细胞表型、动物模型的体内药效学研究及毒性试验等。还可用于制作TCR-T细胞，进行TCR-T细胞的非临床研究。若不对T细胞进行基因改造，可用于执行T细胞相关的免疫学研究，例如T细胞激活机制、T细胞迁移机制、T细胞胞内信息转导等研究。
纯化的CD3+T细胞还可用于制备CAR-T细胞。因此本发明另一方面提供一种改进的制备CAR-T细胞的方法，包括步骤：
(1)使用本文所述纯化CD3+T细胞的方法获得CD3+T细胞；
(2)将CAR导入所述CD3+T细胞，获得CAR-T细胞。
相应地，本发明还提供纯化CD3+T细胞的方法在制备含活化的T细胞的试剂中的用途。所述活化的T细胞是CAR-T细胞。
可以采用本领域已知的任何将CAR导入T细胞的方法进行所述步骤(2)。优选通过逆转录病毒载体将CAR导入T细胞。
在获得CAR-T后，所述方法通常包括CAR-T细胞扩大培养、CAR-T细胞灌装冻存等步骤。因此，本发明的CAR-T细胞的制备方法的具体操作步骤包括：PBMC分离、PBMC复苏缓解、CD3+T细胞分选活化、逆转录病毒转导T细胞、CAR-T细胞扩大培养及CAR-T细胞灌装冻存，参见图1。示例性地，本发明提供使用Sepax C-Pro细胞处理系统制备CAR-T细胞的方法：(1)使用Sepax C-Pro细胞处理系统对血液样品进行PBMC分离和冻存，去除样品中残留的红细胞及白细胞中的多核细胞，(2)使用Sepax C-Pro细胞处理系统对冻存的PBMC进行洗涤和复苏，使PBMC的活率及功能性得到恢复，去除死细胞，(3)使用Sepax C-Pro细胞处理系统对复苏的PBMC执行本发明的纯化CD3+T细胞的方法，对PBMC进行CD3分选、活化，(4)将细胞与固相载体(例如磁颗粒)分离后，使用Sepax C-Pro细胞处理系统对活化的CD3+T细胞进行洗涤，并将细胞培养液及病毒液在RetroNectin存在下孵育，将CAR基因转导入T细胞，(5)使用Sepax C-Pro细胞处理系统对CAR-T细胞进行洗涤并转移至较大体积的细胞培养袋使细胞扩增，(6)使用Sepax C-Pro细胞处理系统对CAR-T细胞进行洗涤和灌装，并以程序降温仪完成CAR-T细胞冻存。具体地，上述步骤(1)-(3)的具体步骤如上纯化CD3+T细胞的方法所述；步骤(4)-(6)的具体步骤包括：
逆转录病毒转导T细胞：
本工序使用磁性分离器及Sepax C-Pro细胞处理系统和对应的一次性使用封闭管路套件CT-60.1对活化完成的细胞进行洗涤，并利用RetroNectin介导及增加逆转录病毒液感染T细胞的效率。首先在37℃环境下以15μg/mL RetroNectin工作液包被PL70-2G细胞培养袋，包被完成后将培养袋中上清弃去。
将活化培养完成的CD3+T细胞放置于CTS DynaMag磁性分离器上，磁性捕获自细胞上自动脱落的游离磁珠，并转移出未带磁珠的CD3+细胞悬液。将细胞悬液包袋连接至已安装在Sepax C-Pro细胞处理系统上的CT-60.1套件上，以CultureWash程序进行细胞洗涤，最终将细胞以含IL-2培养基重悬输出。洗涤后细胞经取样计数，计算转导MOI。
病毒液的生产来自逆转录病毒载体稳转株，稳转株的构建参考自Loew R,MeyerY,Kuehlcke K,Gama-Norton L,Wirth D,Hauser H,Stein S,Grez M,Thornhill S,Thrasher A,Baum C,Schambach A.A new PG13-based packaging cell line for stableproduction of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors usingtargeted integration.Gene Ther.2010Feb；17(2):272-80.doi:10.1038/gt.2009.134.Epub 2009Oct 29.PMID:19865181.详细步骤为将冻存的稳转细胞株解冻后扩大培养(培养基为DMEM+10％FBS，培养条件为37℃，5％CO2)，当总活细胞数达到1E8-1E9之间时，将细胞接种至多层培养瓶。细胞培养24小时后换一次液，分别在换液后24小时及48小时收集含悬浮病毒颗粒的培养上清液，将两次收集的上清液混合后即为病毒液。将细胞悬液及病毒液共同放入RetroNectin包被完成的细胞培养袋中，在37±1℃及5±0.5％CO2的二氧化碳培养箱中培养过夜。本工序目的为去除成品杂质成分之一的磁珠，并将CAR基因转导入T细胞，实现CAR-T细胞制备。
CAR-T细胞扩大培养：
CAR-T，嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。
本工序使用Sepax C-Pro细胞处理系统和对应的一次性使用封闭管路套件CT-60.1对CAR-T细胞进行洗涤并转移至较大体积的细胞培养袋使细胞扩增。首先将CT-60.1套件安装至Sepax C-Pro细胞处理系统上，再将病毒转导完成的CAR-T细胞培养袋自二氧化碳培养箱中取出，连接到套件上，执行CultureWash程序以培养基洗涤CAR-T细胞。CultureWash程序最终将CAR-T细胞以含IL-2培养基重悬，并输出至PL325细胞培养袋中。洗涤后CAR-T细胞经取样计数，再以Sepax C-Pro细胞处理系统的Dilution程序补加含IL-2培养基于CAR-T悬液中，调整细胞密度。将细胞培养袋放回37±1℃及5±0.5％CO2的二氧化碳培养箱中进行培养，之后每1-3天进行细胞计数及补液。本工序目的为清洗去除病毒液相关杂质并扩增CAR-T细胞到所需细胞数。
CAR-T细胞灌装冻存：
本工序使用Sepax C-Pro细胞处理系统和对应的一次性使用封闭管路套件CT-60.1对CAR-T细胞进行洗涤和灌装，并以程序降温仪完成CAR-T细胞冻存。首先将CT-60.1套件安装至Sepax C-Pro细胞处理系统上，再将CAR-T细胞培养袋自二氧化碳培养箱中取出，连接到套件上。将作为洗涤液的氯化钠注射液包袋也连接至套件上，执行CultureWash程序以氯化钠注射液洗涤CAR-T细胞三次。CultureWash程序最终将CAR-T细胞以冻存液重悬输出，经取样计数后，再以Sepax C-Pro细胞处理系统的Dilution程序分装CAR-T细胞于冻存袋中，再运输至程序降温仪。待降温完毕，转移至液氮中长期保存。
此外，本发明还提供一种消除或减弱细胞对固相载体(例如容器壁或磁颗粒)的非特异性粘附性的方法，包括在DPBS存在的条件下孵育所述细胞和固相载体。从而避免细胞因贴壁效应而占据、吞噬固相载体，影响T细胞的活化。所述细胞优选单核细胞，例如PBMC。具体实施方案中，所述方法包括本文所述的纯化CD3+T细胞的方法的步骤。
以下将以具体实施例的方式对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非用于限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域的常规方法和试剂。
实施例
实施例1：磁珠分选条件多因素研究
磁珠分选条件多因素研究共进行过三次重复DOE实验，研究磁珠孵育时间(研究范围为30～60分钟)、磁珠孵育细胞密度(研究范围为4～10×106个细胞/毫升)、磁珠孵育缓冲液等因素。为使实验结果能运用于不同CD3比例的PBMC样品，将CD3比例也作为一个研究因素，但CD3比例在生产过程中是不可控制的变量，因其完全取决于PBMC样品的属性。具体实验分组和孵育液细胞浓度见下方表1和表2。
DPBS(21-031-CVR，Corning)每瓶500mL，浓度为1X，组分为：0.20g/LKCl，0.20g/LKH2PO4，8.00g/LNaCl，1.15g/LNa2HPO4。
表1：DOE实验设计分组
表2，孵育液细胞浓度
实施例2：实验细胞的制备
自单采血中分离PBMC后冻存。将解冻的PBMC置于T瓶中缓解培养过夜后，以CD3/28磁珠(CTS Dynabeads CD3/CD28，货号40203D，Thermo Fisher Scientific)进行磁性分选。分选时的使用的实验条件根据上表中的组别来分配。将分选后的CD3+T细胞进行活化培养48±4小时。活化完成的CD3+T细胞以相同的MOI进行逆转录病毒的转导，之后在T瓶中扩大培养CAR-T细胞。
在实验期间取样对细胞数、细胞活率、细胞直径、细胞表型等提示细胞生长、活化及CAR感染率的指标。细胞数、细胞活率及细胞直径由NC-200细胞计数仪检测。细胞表型由流式细胞仪进行检测。取样点分别为PBMC复苏后、PBMC缓解后、CD3+T细胞活化后、逆病毒转导后、CAR-T细胞扩大培养第6天及CAR-T细胞扩大培养第9天。
图2展示CAR-T细胞制备工艺改进前后的CAR-T细胞的活率、直径、扩增倍数、流式表型及CAR感染率的全流程可比性。改进后的工艺所生产出的CAR-T细胞在与产品质量高度相关的指标，包括CAR感染率、细胞活率、CD3比例、CD19比例等均与改进前工艺生产的CAR-T细胞的质量差异小。工艺改进前后的细胞活化相关的指标，如CD25、CD69及细胞直径的变化趋势一致，未出现延迟活化或不活化的异常现象。细胞扩增方面，自病毒转导开始至培养终点，改进后工艺的细胞扩增大于50倍，足以满足一般的回输要求。总细胞群体中的CD19、CD14、CD16/56的表达比例在T细胞分选后趋近0％，后续培养过程中也无异常升高。
图3展示CAR-T细胞制备工艺改进前后的培养终点的CAR-T细胞功能检测结果。功能检测是以CAR-T细胞与表达相应靶点的靶细胞共同培养，取培养上清液检测细胞因子的释放，取CAR-T细胞检测CD107a表达，以及取靶细胞检测被杀伤比例。由图3可以看出，固然在六个批次中发生因供者不同而产生的个体差异导致功能性检测结果各有高低，但总体来说，改进后工艺生产的CAR-T细胞在CD107a表达、靶细胞杀伤功能、IFN-γ及IL-2的释放能力都远高于变更前组别。
结果表明，改进后工艺生产的CAR-T细胞与改进前相比具有可比性，对产品质量无影响，且全程以封闭工艺进行，降低交叉污染及外源污染的风险，更加符合基因治疗产品的法规需求。
实施例3：孵育缓冲液对CAR-T细胞制备中间性状的影响
实施例结果如图5所示。首先可以看到孵育缓冲液的种类不影响细胞活率，实验周期中两种处理的细胞活率平均都高于90％。观察实验周期中的细胞直径变化可以发现，使用X-VIVO 15基础培养基作为孵育缓冲液的组别在活化48±4小时后，平均细胞直径低于10微米，直径峰值延迟至Day7出现，且平均低于11微米。使用DPBS作为孵育缓冲液的组别，细胞直径于Day5达到峰值，约为13毫米。X-VIVO组CD25表达同样出现峰值延迟及降低的现象，CD69峰值虽未延迟出现，但平均最高值约40％，明显低于DPBS组(平均值约为70％)。细胞未得到良好活化导致扩增倍数的低下，X-VIVO组扩增倍数至Day13仍然低于100倍，DPBS组扩增倍数至Day13平均可超过400倍。孵育缓冲液的种类不影响制备过程中CD3细胞比例，两组别Day4平均CD3比例皆大于80％，Day10开始持续维持超过90％，显示终产品纯度高。CAR感染率同样不受孵育缓冲液种类的影响，两组别在三个时间点的CAR感染率保持一致，约在60％-80％。综上所述，使用X-VIVO 15基础培养基作为磁珠孵育缓冲液对细胞活化产生不利影响，进而使细胞无法顺利扩增，但对其他指标无影响。
实施例4：磁珠孵育时间及磁珠孵育的细胞密度
如图6及图7所示，磁珠孵育时间(30分钟、45分钟、60分钟)及磁珠孵育的细胞密度(4×106个细胞/毫升、7×106个细胞/毫升、10×106个细胞/毫升)不影响实验周期中的平均细胞活率(≥90％)、细胞活化状态(平均细胞直径峰值出现于Day5，大于11微米；平均CD25表达峰值接近60％；平均CD69表达峰值约为40％-60％；三种孵育时间变化趋势一致)、平均细胞扩增倍数(大于200倍，三种孵育时间变化趋势一致)、CD3细胞比例(Day4后>80％，Day5后>90％，三种孵育时间变化趋势一致)及CAR感染率(>60％，三种孵育时间变化趋势一致)。
综合以上观察到的各项结果可以得出，在CD3+T细胞分选操作中，磁珠孵育时间30到60分钟及磁珠孵育细胞密度4～10×106个细胞/毫升皆不影响CAR-T细胞制备期间各项指标，因此将工艺改进，不需再因样品中CD3细胞比例不同而改变孵育时间和孵育细胞密度。本实验也确认了磁珠孵育缓冲液对T细胞活化及后续的CAR-T细胞扩增有明显影响，因此改进后的工艺不再因样品中CD3细胞比例不同而选用不同的磁珠孵育缓冲液，将磁珠孵育缓冲液固定为DPBS。
实施例5：实验细胞的制备
自单采血中分离PBMC后冻存。将解冻的PBMC置于细胞培养袋中缓解培养过夜后，以CD3/28磁珠进行磁性分选。将分选后的CD3+T细胞在细胞培养袋中活化培养48±4小时。活化完成的CD3+T细胞以相同的MOI在细胞培养袋中进行逆转录病毒的转导，之后在较大体积的细胞培养袋中扩大培养CAR-T细胞。
在实验期间取样对细胞数、细胞活率、细胞直径、细胞表型等提示细胞生长、活化及CAR感染率的指标。细胞数、细胞活率及细胞直径由NC-200细胞计数仪检测。细胞表型由流式细胞仪进行检测。取样点分别为PBMC复苏后、PBMC缓解后、CD3+T细胞活化后、逆病毒转导后、CAR-T细胞扩大培养第3天、CAR-T细胞扩大培养第6天及CAR-T细胞扩大培养第9天。
接着，以上述改进后的CD3+T细胞分选条件制备三名供者的CAR-T细胞，此三名供者的PBMC样品为CD3比例低且CD14比例高，藉此证明工艺获得改善，使用DPBS作为磁珠孵育缓冲液能够成功生产CAR-T细胞，且不受CD3及CD14比例的限制。下表中为三名供者PBMC的CD3及CD14比例。
表3：三名供者PBMC中CD3及CD14比例
| 供者编号 | CD3+(％) | CD14+(％) |
| #1 | 12.9 | 56.7 |
| #2 | 30.7 | 50.7 |
| #3 | 7.97 | 72 |
三名低CD3高CD14的PBMC制备CAR-T细胞的实验结果如图8。细胞活率方面，三组细胞在整个实验流程中活率皆不低于85％，CD3分选后细胞活率维持在90％以上，满足放行标准。细胞直径方面，在细胞活化48±4小时后，直径维持超过10微米，直径峰值出现在Day4或Day5，符合一般的活化模式。其他两个细胞活化相关指标CD25及CD69也呈现出相同的趋势。细胞扩增方面固然因为个体差异性而导致扩增倍数有所不同，但三组细胞在Day13时皆扩增超过100倍，已经可以满足生产需求。CD3+细胞比例方面，分选的CD3+比例持续高于89％，同样满足CAR-T细胞生产标准。CAR表达率方面，三组细胞自Day7开始CAR感染率大于45％，Day10开始大于60％，显示病毒稳定转导，可制成相应比例的CAR-T细胞。
根据上述实验结果，证明改进后的工艺可行。改进后的步骤能有效避免CD3低比例及CD14高比例的PBMC样品在磁珠分选过程中发生单核细胞吞噬磁珠影响细胞活化的现象，使细胞得到正常活化及扩增。其次，改进后的工艺可简化CD3+T细胞分选活化的操作，不需要根据样品中CD3比例进行不同的计算，降低人为错误的可能性。
Claims (10)
1.一种从PBMC纯化CD3+T细胞的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)在DPBS中孵育标记的抗CD3抗体和PBMC，和
(2)通过所述标记分离PBMC中的CD3+T细胞，
其中，所述方法不包括根据PBMC中的CD3+T细胞比例选择孵育缓冲液、调整细胞密度和孵育时间的步骤，
优选地，所述方法在纯化CD3+T细胞前还包括获取PBMC的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记为便于将抗体和表面抗原的细胞的复合物与体系中的其他组分分离的物质，
优选地，所述DPBS中还含有标记的抗CD28抗体，
优选地，所述抗CD3抗体和/或抗CD28抗体与所述标记偶联。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记包括生物素或固相载体；优选地，所述固相载体为磁颗粒。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBMC中的CD3+T细胞比例小于30％，
优选地，所述DPBS中CD3+T细胞密度为4-10*106个细胞/mL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育为摇动孵育，其中
所述摇动为20-500rpm，优选50-100rpm，和/或
所述孵育温度为10-40℃，和/或
所述孵育时间为20-60分钟，优选30-45分钟。
6.如权利要求1-5中任一种所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)DPBS中重悬PBMC，其中CD3+T细胞密度为4-10*106个细胞/mL；
(b)加入等体积的偶联抗CD3抗体的磁颗粒，摇动孵育20-60分钟；
(c)通过磁性捕获分离结合有CD3+T细胞的磁颗粒；
(d)将磁颗粒与细胞分离，获得CD3+T细胞，
并且，所述方法不包括获取PBMC中的CD3+T细胞比例的步骤。
7.如权利要求1-5中任一种所述的方法，其特征在于，所述方法还包括活化CD3+T细胞的步骤，例如使用含IL-2的培养基孵育CD3+T细胞至少24小时。
8.一种使用Sepax C-Pro细胞处理系统纯化CD3+T细胞的方法，包括步骤：
(I)使用Sepax C-Pro细胞处理系统对血液样品进行PBMC分离和冻存，去除样品中残留的红细胞及白细胞中的多核细胞，
(II)使用Sepax C-Pro细胞处理系统对冻存的PBMC进行洗涤和复苏，恢复PBMC的活率及功能性，去除死细胞，
(III)使用Sepax C-Pro细胞处理系统对复苏的PBMC进行CD3+T分选和活化，包括使用权利要求1-7中任一项所述的方法。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法在制备含活化的T细胞的试剂中的用途；优选地，所述活化的T细胞是CAR-T细胞。
10.一种消除或减弱细胞对固相载体的非特异性粘附的方法，其特征在于，所述方法包括在DPBS存在的条件下孵育所述细胞和固相载体，
优选地，
所述细胞为单核细胞，例如PBMC，和/或
所述固相载体为容器壁或磁颗粒。
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