JP7094100B2 - ＴＣＲａｂ陽性細胞およびＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を枯渇させた細胞組成物 - Google Patents

ＴＣＲａｂ陽性細胞およびＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を枯渇させた細胞組成物 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、骨髄または血液から得られる細胞組成物であって、細胞集団は、ＴＣＲα／β陽性細胞およびＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇しているものとする細胞組成物、該細胞組成物を提供する方法ならびに該細胞組成物の使用に関する。
背景
幹細胞移植は、血液学的、腫瘍学的、免疫学的および遺伝的な疾患の治療にますます利用されている。通常、幹細胞は、骨髄または白血球除去後に処理された動員された血液から抽出される。
ドナーによっては、幹細胞移植には依然として、レシピエントに対する移植片の反応に由来する合併症（移植片対宿主病、ＧｖＨＤまたはＧｖＨＲ）が生じるという欠点がある。他の一般的な合併症としては、移植された幹細胞の生着の失敗、コンディショニングステップの毒性または長期のもしくは不完全な免疫再構築による治療下での感染が挙げられる。
合併症を回避し、かつ幹細胞移植片を所与のレシピエントに適合させるべく、出発細胞組成物から特定の細胞亜集団を濃縮および／または枯渇させることが知られている。これに関して、いくつかの枯渇および／または濃縮戦略が先行技術に記載されている。特に、本分野において知られている方法は、ＣＤ３４＋細胞の濃縮およびＣＤ３＋細胞の枯渇である。
米国特許出願公開第２０１４０３０８２５０号明細書（ＵＳ ２０１４０３０８２５０ Ａ１）に開示されたもう１つの方法では、骨髄または血液から得られる細胞集団からＴＣＲα／β陽性細胞を枯渇させ、また同時にＣＤ１９陽性細胞を枯渇させる。このようにして得られた細胞集団を、幹細胞または骨髄の移植後のヒトの造血系の再構築に用いることができる。この細胞集団は、追加の免疫細胞、例えばナチュラルキラー細胞、γ／δＴ細胞、樹状細胞、単球を含む。これらの細胞集団は、抗腫瘍効果および／もしくは抗ウイルス効果を有するか、または幹細胞の生着に寄与する。しかし、この米国特許出願公開第２０１４０３０８２５０号明細書（ＵＳ ２０１４０３０８２５０ Ａ１）に開示された方法により得られる細胞組成物は、ＮＫ細胞およびγ／δＴ細胞単独よりも効率的に感染に対処しうる病原体特異的Ｔ細胞を含まない。
ウイルス抗原に遭遇した際のサイトカイン分泌に基づく別個の細胞サンプルからのウイルス特異的Ｔ細胞の単離は、知られている。この方法は、高コストで時間がかかり、得られる細胞の量は少なく、処理に使用される抗原に対する反応性が限定的である。
本発明の課題は、ＴＣＲα／β陽性細胞およびＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の枯渇によって造血系の再構築に適切でありつつも、ＮＫ細胞、ＴＣＲγ／δＴ細胞、Ｂ細胞および血液樹状細胞の他にさらにメモリーＴ細胞をも含む方法ならびに細胞組成物を提供することである。
本発明の主な用途は幹細胞移植であるが、感染、混合キメリズムおよび癌再発を治療するためのドナーリンパ球輸注のような養子細胞療法を含む他の臨床的状況においても、本発明を使用することができる。
概要
本発明の第１の態様は、骨髄または血液に由来するサンプルから細胞集団を調製する方法であって、
ａ）前記サンプルを、前記サンプルの細胞の５０～９９％を含む第１の画分と、前記サンプルの細胞の５０～１％を含む第２の画分とに分割するステップ、
ｂ）前記第１の画分の細胞を、ＴＣＲα／βに対する第１のマーカーで標識するステップ、
ｃ）前記第２の画分の細胞を、ＣＤ４５ＲＡに対する第２のマーカーで標識するステップ、
ｄ）前記標識された細胞を前記第１および第２の画分から除去し、残りの細胞を合して細胞集団とするステップ
を含む方法である。
本発明のもう１つの目的は、骨髄、全血または処理された血液から得られる細胞集団を含む医薬組成物であって、該細胞集団は、ＴＣＲα／β陽性細胞およびＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が０．１～７．０ ｌｏｇだけ枯渇しているものとする医薬組成物である。
本発明のさらなるもう１つの目的は、幹細胞もしくは骨髄の移植後にヒトの造血系を再構築するための；または、感染、混合キメリズムもしくは癌再発を養子細胞移植の形態で予防および治療するための、前記医薬組成物の使用もしくは使用方法である。
以下の図を参照して、様々な例示的詳細を説明する。
図１に、白血球除去物、ＴＣＲａｂ枯渇画分および９５：５の混合物（ＴＣＲａｂ枯渇：ＣＤ４５ＲＡ枯渇）についてのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ生成から、各サンプルについて陰性対照を差し引いたものを示す。 図２に、ＴＣＲａｂ枯渇画分および９５：５の混合物（ＴＣＲａｂ枯渇：ＣＤ４５ＲＡ枯渇）についてのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ生成から、各サンプルについて陰性対照を差し引いたものを示す。 図３に、同種異系細胞との相互作用に際しての、ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞およびＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の細胞培養上清の細胞のＢｒｄＵカウント数ならびにインターフェロンγ含分を示す。
詳細な説明
本発明の方法は、骨髄または血液に由来するサンプルから細胞集団を調製する方法を含む。「骨髄または血液に由来するサンプル」という用語には、骨髄、その画分または前処理された骨髄、全血、血液画分、血液製剤または処理された血液、白血球アフェレーシス（白血球除去）、静脈穿刺または骨髄穿刺により得られるすべての細胞集団が包含される。好ましくは、細胞調製物は、幹細胞移植の状況において幹細胞動員薬剤で予め処置された健康なドナーから得られる。
「枯渇」という用語は、細胞集団から特定の細胞の量を減少させることを指す。この枯渇は、少なくとも２の対数段階により、好ましくは少なくとも３の対数段階により、特に好ましくは少なくとも４の対数段階（例えば４．６の対数段階）により、最も好ましくは少なくとも４ないし５の対数段階による、例えばＴＣＲα／βまたはＣＤ４５ＲＡのような細胞表面マーカーの存在（または非存在）によって定められる細胞の量に基づくことができる。
対数段階による除去は、以下の通りである：１ ｌｏｇ：不要な細胞を９０％除去、２ ｌｏｇ：不要な細胞を９９％除去、３ ｌｏｇ：不要な細胞を９９．９％除去、４ ｌｏｇ：不要な細胞を９９．９９％除去。分離性能を算出するための方法は当業者に知られており、例えばＢｏｓｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， ２００９に記載されている。
本発明の枯渇プロセスは、細胞表面マーカーＴＣＲα／βおよび表面マーカーＣＤ４５ＲＡを用いて行われる。この枯渇は、従来技術で知られているいずれの技術で実施されてもよく、例えばパニング、エルトリエーションまたは磁気細胞分離で行われることができる。枯渇効率が高いことから、例えばＣＬＩＮＩＭＡＣＳ ＰｌｕｓまたはＣＬＩＮＩＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ装置（いずれもＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨより入手可能）による磁気細胞分離を用いる枯渇が好ましい。
さらなる変形形態において、本発明は、細胞集団を調製するための方法に関し、特にインビトロで細胞集団を調製するための方法に関する。本方法は、以下のステップを含む。
－ ドナーの骨髄または血液に由来する細胞サンプル（すなわち、特にＴＣＲα／β陽性細胞およびＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を含む集団の細胞サンプル）を準備するステップ、
－ 前記細胞サンプルを、第１の画分と第２の画分とに分割するステップ、
－ 前記第１の細胞集団からＴＣＲα／β陽性細胞を枯渇させるステップ、
－ 前記第２の細胞集団からＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を枯渇させるステップ、
－ 前記ＴＣＲα／β枯渇生成物と前記ＣＤ４５ＲＡ枯渇生成物とを合するステップ。
好ましくは、ＴＣＲα／β陽性細胞の枯渇は、ＴＣＲα／βに対する抗体または抗原結合性フラグメントを用いて行われる。受容体ＴＣＲα／βの配列番号１～１１（配列プロトコル参照）によるタンパク質またはヌクレオチド配列に基づき、ＴＣＲα／βに対する抗体フラグメントもしくは抗原フラグメントまたはそれらの誘導体もしくは複合体を作製し、これをＴＣＲα／β陽性細胞の枯渇に用いることができる。
好ましい一実施形態において、本方法は、以下のステップをさらに含む：第１の画分および／または第２の画分および／または細胞集団のＣＤ１９を発現する細胞を、第３のマーカーで標識し、標識された細胞を除去するステップ。
標識
本発明の方法において使用される第１、第２および／または第３のマーカーは、それぞれＴＣＲα／βおよび／またはＣＤ４５ＲＡおよび／またはＣＤ１９に対する抗体または抗原結合性フラグメントと、検出部分とを含みうる。
これらのマーカーの検出部分は、同一であっても異なっていてもよく、蛍光色素、磁性粒子または放射性標識であってもよい。
ＣＤ４５ＲＡは、ナイーブＴ細胞およびナイーブＢ細胞上の表面分子である。「ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞」という用語は、表面上にＣＤ４５ＲＡ分子を発現する細胞を指し、このＣＤ４５ＲＡ分子に、適切なＣＤ４５ＲＡ結合性分子、例えばＣＤ４５ＲＡに対する抗体が、特異的に結合しうる。
ＴＣＲα／βは、Ｔ細胞上の表面分子である。「ＴＣＲα／β陽性細胞」という用語は、表面上にＴＣＲα／β分子を発現する細胞を指し、このＴＣＲα／β分子に、適切なＴＣＲα／β結合性分子、例えば抗体が、特異的に結合しうる。
「抗体」という用語は、ヒト由来または動物由来の、例えばラット、ウサギ、ヤギ、ウマもしくはマウス由来のいずれのモノクローナルまたはポリクローナル抗体をも指すとともに、これらの抗体の誘導体であって結合能力または元の抗体を大部分保持するものをも指す。これらの抗体の好ましい誘導体はキメラ抗体であり、これには例えば、マウスまたはラットの可変領域とヒトの定常領域とのキメラ抗体が含まれる。「抗体」という用語には、二官能性または二重特異性の抗体および抗体構築物、例えば１本鎖由来のＦｖ（ｓｃＦｖ）または抗体融合タンパク質も含まれる。「ｓｃＦｖ」という用語（１本鎖Ｆｖフラグメント）は当業者に知られており、このフラグメントが組換え様式で生成されることが好ましい。
本発明において利用される抗体は、ヒト抗体であってもヒト化抗体であってもよい。「ヒト化抗体」という用語は、少なくとも１つの抗体結合部位（相補性決定領域、ＣＤＲ）、例えばＣＤＲ３、好ましくは６つのＣＤＲすべてが、所望の特異性を有するヒト抗体由来のＣＤＲにより置換されたヒト抗体を指す。必要に応じて、非ヒト定常領域をヒト抗体の定常領域に置換した。ヒト抗体の生成方法は、例えば欧州特許出願公開第０２３９４００号明細書（ＥＰ ０２３９４００ Ａ１）および国際公開第９０／０７８６１号（ＷＯ ９０／０７８６１ Ａ１）に記載されている。
「抗原結合性フラグメント」という用語は、例えば、分離された軽鎖および重鎖、Ｆａｂ、ａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２のような、上記に定義した抗体のフラグメントを指す。抗原結合性フラグメントは、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含むことができるが、必ずしも両方を一緒に含むわけではない。
第１、第２および／または第３のマーカーの検出部分は、蛍光色素、磁性粒子または放射性標識であってもよい。検出部分を抗体または抗原結合性フラグメントに接合させるのに適した検出部分および方法は、当業者に周知である。
枯渇
本発明の方法において、サンプルの細胞を、第１の画分と第２の画分とに分割する。好ましくは、第１の画分は、サンプルの細胞の６０％～９９％、７０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％または９５％～９９％を含み、第２の画分は、合計で１００％となる各範囲を含む。
既に記載した通りに各画分の細胞を標識した後に、第１の画分および第２の画分に由来する標識された細胞を、サンプルから除去する。標識された細胞の除去は、検出部分の性質に基づいて達成される。検出部分が蛍光色素である場合には、ＦＡＣＳのような蛍光ベースの方法またはＴＹＴＯ装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を用いて除去が行われる。検出部分が磁性粒子である場合には、当業者に知られているような磁気細胞選別が用いられる。磁気細胞選別を含む好ましい一実施形態については、後述する。
標識された細胞の除去を、ステップｄ）において、第１の画分と第２の画分とを合し、この合された画分から標識された細胞を除去する第１の実施態様において達成することができる。各画分が蛍光色素および磁性粒子のような異なる性質の検出部分を含む場合、または比較的純粋な枯渇が望まれる場合には、この戦略が好ましい。
本発明の第２の実施形態では、ステップｄ）において、標識された細胞を、第１の画分および第２の画分から別々に除去し、各画分の残りの細胞を合する。この第２の戦略は、同様の性質を有する検出部分またはさらには同一の検出部分を使用する場合、および／または比較的迅速な処理が望ましい場合に好ましい。
本発明の方法を、例えば次のようないくつかの変形形態で実施することができる。
変形形態Ａ） サンプルの１０％の細胞からＣＤ４５ＲＡ細胞を枯渇させ、次いでサンプルの９０％からＴＣＲα／β（またはＴＣＲα／βおよびＣＤ１９）を枯渇させ、枯渇させた細胞サンプルの双方を合する。
変形形態Ｂ） サンプルの１０％からＣＤ４５ＲＡ細胞を枯渇させ、次いでサンプルの９０％からＴＣＲα／β（またはＴＣＲα／βおよびＣＤ１９）を枯渇させるが、双方のサンプルを２つの別々の個々の生成物として保持する。
変形形態Ｃ） サンプルの１０％をＣＤ４５ＲＡで標識し、次いでサンプルの９０％をＴＣＲα／β－ビオチンで標識し、得られた画分を合し、次いで生成物全体を抗ビオチン試薬で標識し、磁気により分離する。必要に応じて、各標識ステップの間／後に洗浄ステップを行う。
変形形態Ｄ） サンプルの１０％をＣＤ４５ＲＡで標識し、次いでサンプルの９０％をＴＣＲα／β－ビオチンで標識し、抗ビオチン試薬で標識し、得られた画分を合し、磁気により分離する。必要に応じて、各標識ステップの間／後に洗浄ステップを行う。
変形形態Ｅ） カラムに１回通すかまたはカラムに２回通すことによる、磁気による枯渇ステップ（「バルク枯渇」＋「敏感枯渇」）（これにより、最も高い枯渇効率が得られる）。
変形形態Ｆ） カラムに１回通すことによりＣＤ４５ＲＡ部分を磁気により枯渇させ、２回通すことによりＴＣＲα／β部分を磁気により枯渇させる。
変形形態Ｇ） サンプルを処理し、次いで再度緩衝液で処理して、輸注に適した溶液とする。
変形形態Ｈ） サンプルを、（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液ではなく）輸液で処理する。
標識された細胞の除去を行ういずれの変形形態においても同様に、残りの細胞を合して、ＴＣＲａｂ陽性細胞およびＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の少なくとも一部を欠く細胞集団とする。好ましくは、ＴＣＲａｂおよびＣＤ４５ＲＡ二重陽性細胞の総数は、レシピエントの体重１キログラム当たり２万５千個未満または全有核細胞集団の０．１％未満であり、例えば０．０３％未満またはさらには０．００５％未満である。
例えば、ＴＣＲα／βおよびＣＤ４５ＲＡ二重陽性Ｔ細胞を９９．９９％超枯渇させて（４ ｌｏｇ）、最終細胞量が、患者の体重１ｋｇ当たり２５，０００個未満のＴＣＲａｂ＋／ＣＤ４５ＲＡ＋細胞となるように、すなわち１００ｋｇの患者に対して２５０万個未満の細胞となるようにすることが望ましい。ＴＣＲα／β陽性／ＣＤ４５ＲＡ陰性のメモリーＴ細胞を、安全であるが免疫学的に有効な量に、すなわち１０万～１億個／ｋｇ、または１００ｋｇの患者に対して１０Ｅ６～１０Ｅ９個の細胞となるように保持することが望ましい。ＴＣＲα／β陰性細胞（ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞集団およびＣＤ４５ＲＡ陰性細胞集団の双方）を、１００ｋｇの患者に対して、例えば全細胞量が約２．４Ｅ９個（すなわち５百万～２億５千万個／ｋｇの範囲内）のγ／δＴ細胞となるように、または２千４百万個（すなわち５００Ｅ６～２５Ｅ９個の範囲内）のγ／δＴ細胞となるように維持することが望ましい（可能な限り低度の枯渇）。
自動処理
好ましい一実施形態においては、細胞サンプル、標識複合体、洗浄緩衝液、廃棄物および所望の細胞集団のための保管容器と、１つまたは複数の遠心分離チャンバーと、標識複合体の検出部分に適した検出および分離の手段と、連結目的のチュービングセットとを含む自動化された閉鎖系内で、プロセス全体が行われる。「自動化された閉鎖系」という用語は、無菌状態での使用に適合された系を指し、すなわち、無菌圧力補償のための手段の有無にかかわらず、また手動での対応を必要としない、気密および液密となるように閉鎖された系を指す。そのようなシステムは例えば、国際公開第２００９０７２００３号（ＷＯ２００９０７２００３Ａ２）または国際公開第２００９０７２００６号（ＷＯ２００９０７２００６Ａ２）に記載されており、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨによりＣＬＩＮＩＭＡＣＳ ＰｌｕｓまたはＣＬＩＮＩＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙの商品名で商品化されている。
自動化処理には、第１および第２の画分についての所定の分割比に出発物質を分割すること、サンプル中の細胞数を測定すること、適切な量の抗体または細胞分離試薬を添加すること、該試薬とともに該細胞生成物を適切な温度での適切な撹拌下にインキュベートすること、未結合の試薬を遠心分離により除去して上清を除去すること、低速遠心分離により血小板内容物を除去して上清を除去すること、該細胞を磁場内の磁気分離カラムに通して該細胞生成物を所定の容量および溶液中で構成することが含まれる。
医薬組成物
本発明の方法を用いて、医薬組成物を得ることができる。したがって本発明のもう１つの目的は、骨髄または血液から得られる細胞集団を含み、該細胞集団は、ＴＣＲα／β陽性細胞およびＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が０．１ ｌｏｇ～７．０ ｌｏｇだけ枯渇している医薬組成物である。
好ましくは、該医薬組成物を、開示された本発明の方法により得ることができる。
幹細胞もしくは骨髄の移植後にヒトの造血系を再構築するために；または感染、混合キメリズムもしくは癌再発を養子細胞移植の形態で予防および治療するために、該医薬組成物を使用することができる。
幹細胞および骨髄の移植
骨髄移植の場合には、約１リットルの骨髄－血液混合物が、全身麻酔下でドナーの骨盤から採取される。
この血液から幹細胞を採取するために、自身の体内ホルモン様物質を数日間にわたってドナーに投与して、幹細胞の生成および骨髄から血液循環系へのその移行を刺激する。骨髄または血液幹細胞を採取するためのドナーの前処置のための方法は従来技術であり、当業者に知られている。
血液幹細胞移植の目的は、血液細胞へと分化しうる健康な幹細胞集団をレシピエントに与えることである。それにより、レシピエントの不完全なまたは病的な細胞が置き換えられる。同種異系移植では、組織は、健康なドナーに由来する。このドナーは、一卵性同胞双生児、ＨＬＡ一致同胞、ＨＬＡ不一致血縁者（不適合血縁ドナー）、ハプロイド一致ドナーまたは非血縁ＨＬＡ適合ドナーであることができる。同種異系移植の主な目的は、例えばレシピエントの骨髄のような病気のまたは不完全な造血系を、免疫系を含む健康で機能的な造血系に完全に置き換えることである。しかし、幹細胞移植を、自己由来の、すなわち患者自身の細胞を用いて行うこともできる。
第１に選択されるドナーは、関連する組織適合抗原ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲＢＩおよびＤＱＢ１に関して一致している同胞（Ｉｄｅｎｔｉｃａｌ Ｓｉｂｌｉｎｇ：ＩｄＳｉｂ）である。しかし、このような一致同胞は約３０％の事例でしか見出すことができないため、ＨＬＡ一致非血縁ドナー（適合非血縁ドナー、ＭＵＤ）を探す必要があることが多い。まだすべての組織適合抗原が解明されるには程遠く、限られた数の対立遺伝子しか試験することができないため、一致非血縁ドナーとの適合性は、同胞ドナーとの適合性よりも低いことを想定する必要がある。
非常に多くの大部分の患者集団が、依然としてドナーを得ていないままである。こうした患者には、ＨＬＡ対立遺伝子のうちの１つのハプロタイプのみがレシピエントと合致している、すなわちハプロ一致である血縁ドナーを使用することができる。
造血幹細胞移植に最もよく使用されるのは、非血縁ドナー（ＭＵＤ）の移植片である。ＭＵＤの状況における操作されていない移植片に関しては、ＧｖＨＤが主要な合併症である。ＧｖＨＤの重篤な症状は、生命を脅かすものと考えられるべきであり、これには免疫抑制物質による高度の治療が必要とされるが、これに関しては応答効率が約４０％であることが記載されている。
移植
実際の移植は、２つの段階に分けることがでる。化学療法および／または放射線療法によるコンディショニングによりレシピエントの免疫系が破壊され、そうすることで、移入もしくは移植された骨髄または幹細胞が拒絶されなくなる。すなわち、レシピエントは、移植片の生着の準備が整う。このことが良好に達成されるほど、移植片の非生着または拒絶のリスクが低下する。コンディショニングの強度に応じて、達成すべき目標は、患者の中に残っている白血病細胞または悪性細胞を破壊することである。移植は、０日目に静脈内で行われる。移植片が生着し、直ちに生じる毒性が次第に弱まるまで、患者は通常はこのような症例に適した病室内に留まる。移植片が生着し、直ちに生じる毒性が弱まった後、最初の３カ月間に厳密なモニタリングが必要とされる。モニタリングの強さは、ドナーの種類および合併症に大きく依存し、これは次第に、生涯にわたる定期的なアフターケアとなる。
適応症／使用
本発明のもしくは本発明の方法により得られた細胞集団または医薬組成物は、造血系の先天性および後天性の悪性および非悪性の疾患のような、同種異系幹細胞移植を必要とするすべての医学的適応症の治療に使用されうる。この治療には、同種異系幹細胞移植が含まれうる。特に、本発明によるまたは本発明の方法により得られた医薬組成物を、幹細胞または骨髄の移植後のヒトの造血系の再構築に使用することができる。さらに、本発明によるまたは本発明の方法により得られた医薬組成物を、遺伝子改変またはさらなる細胞操作の有無にかかわらず養子細胞移植の形態での感染、混合キメリズム、癌再発または免疫異常症の予防および治療に使用することができる。さらなる適応症は、化学療法または放射線療法の用量増強に応答する悪性疾患である。
治療の際に、ＧｖＨＤを制御するために、シクロスポリン、コルチコステロイド、代謝拮抗剤およびモノクローナル抗リンパ球抗体のような免疫抑制剤を使用することができる。
該医薬組成物の好ましい一実施形態において、該組成物は、製薬学的に許容される少なくとも１つの担体または添加剤をさらに含む。このような担体または添加剤は、当業者に知られている。
同種異系移植が示されているかまたはＴＣＲα／β、ＣＤ４５が枯渇した細胞調製物の治療効果を期待することができる、癌、例えば白血病と、他の疾患、例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、再生不良性貧血、地中海貧血、先天異常（ＨＨＳ）および固形腫瘍（例えば神経芽細胞腫、肉腫など）の治療のために、該医薬組成物を投与することができる。
さらに、造血系の良好な再構築を達成するためには、同種異系移植の際に、十分な量のＣＤ３４＋細胞を移入する必要がある（レシピエントの体重１ｋｇ当たり少なくとも２百万個、より良好には４百万個を上回る）。細胞分離後に十分なメモリーＴ細胞が維持される場合（例えば、１ｋｇ当たり１００万個を上回るＣＤ４５ＲＡ－Ｔ細胞）には、Ｂ細胞を移植片内で保持してＢ細胞免疫を維持することができる。あるいは、ＣＤ１９の枯渇により移植片から除去されるＢ細胞は、可能な限り少ない数で存在するか、または例えばインビボでの抗ＣＤ２０抗体の投与によってレシピエントにおいて後で除去されることが望ましい。
ヒト患者に投与すべき枯渇された細胞集団の量は典型的には、２×１０Ｅ１０～１×１０Ｅ１１個のリンパ球である。
上記で概説した例示的な実施態様に関連して様々な詳細を説明してきたが、上記の開示を検討することにより、既知のまたは予見されないもしくは現在は予見できない様々な代替形態、変更形態、変形形態、改良形態および／または実質的な等価物が明らかになりうる。したがって、上記の例示的な実施形態は、説明を意図したものであり、これらに限定されるものではない。
実施例
抗原特異的Ｔ細胞は、幹細胞移植後の免疫防御を支援することができるとともに、様々な疾患（例えばＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザ）から患者を守ることができよう。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの発現により、Ｔ細胞を、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ４５ＲＡ－であるメモリーＴ細胞と、ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ４５ＲＯ－であるナイーブＴ細胞とに分けることができる。
ＣＤ４５ＲＯ＋メモリーＴ細胞は、反復的な抗原接触（例えばＣＭＶ、ＥＢＶまたはインフルエンザ由来の抗原）によって再活性化されることができ、いくつかのサイトカイン（例えばＩＦＮγ）を生成して感染に対する免疫応答を引き起こす。ＣＤ４５ＲＡ枯渇血液製剤（例えばＬＰまたは全血）は、主にＣＤ４５ＲＯ＋メモリーＴ細胞を含む。この細胞は、様々な抗原に反応してＩＮＦγを生成しうる。
対照的に、ＴＣＲａｂ枯渇細胞性生成物ではＣＤ４５ＲＯ＋メモリーＴ細胞も枯渇しており、これらの細胞性生成物においては、抗原特異的Ｔ細胞はほとんど期待されない。
本発明の方法では、分離戦略として、ＴＣＲａｂの枯渇とＣＤ４５ＲＡの枯渇との組み合わせを用いる。一例として、標的細胞画分は、ＴＣＲａｂ枯渇生成物９５％およびＣＤ４５ＲＡ枯渇生成物５％を含む。
実験の全般的説明
略称の一覧：ＣＭＶ：サイトメガロウイルス、ＥＢＶ：エプスタイン・バール・ウイルス、ＩＦＮγ：インターフェロンγ、ＬＰ：白血球除去物、ＭＱ：ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０、ＳＥＢ：ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、ＴＣＲａｂ：Ｔ細胞受容体αβ。
以下の実験において、ＴＣＲａｂの枯渇およびＣＤ４５ＲＡの枯渇を、１つのＬＰ（ＴＣＲａｂ枯渇に対して１／２ＬＰおよびＣＤ４５ＲＡに対して１／２ＬＰ）で実施した。ＴＣＲａｂ枯渇画分９５％とＣＤ４５ＲＡ枯渇画分５％とを混ぜ合わせ、様々な抗原で刺激した。インキュベーションを６時間行った後、細胞内染色およびＭＱでの測定によってＩＮＦγ生成を測定した。この９５：５の混合物のＩＮＦγの生成を、未分離のＬＰおよびＴＣＲａｂ枯渇画分と比較した。
実験のステップ毎の説明
Ａ）白血球除去サンプルの分割
半分を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を用いたＬＰ－ＴＣＲａｂの枯渇に用いる。
半分を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を用いたＣＤ４５ＲＡの枯渇に用いる。
Ｂ）枯渇後、ＴＣＲａｂ枯渇画分およびＣＤ４５ＲＡ枯渇画分を、９５：５の細胞比で混合する。
Ｃ）以下の画分を、データシートＲａｐｉｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ（ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌ）Ｋｉｔ， １３０－０９７－３４３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）により行われるＲａｐｉｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｓｓａｙ（抗原特異的Ｔ細胞の検出）に使用する：
・未分離の白血球除去物、
・ＴＣＲａｂ枯渇画分、
・９５：５の混合物（ＴＣＲａｂ枯渇画分：ＣＤ４５ＲＡ枯渇画分）。
Ｄ）すべての画分を、各刺激剤のデータシートにしたがって以下の抗原で刺激する：
・ＣＥＦ－Ｐｏｏｌ→データシート１３０－０９８－４２６（ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標） ＣＥＦ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｐｌｕｓ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）、
・ＣＭＶ（ｐｐ５６およびＩＥ－１ Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ）→データシート１３０－０９３－４９３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）（ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＣＭＶ ＩＥ－１）および１３０－０９３－４３８（ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＣＭＶ ｐｐ６５）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）、
・ＥＢＶ－Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ－Ｐｏｏｌ→データシート１３０－０９９－７６４（ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＥＢＶ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）、
・ＳＥＢ（陽性対照）、
・刺激なし（陰性対照）。
細胞を３７℃で６時間刺激し、２時間後にブレフェルジンＡを添加する（エキソサイトーシスのブロック）。
Ｆ）抗ＩＦＮγ－ＰＥおよびＲａｐｉｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒによる細胞内染色、これは、データシートＲａｐｉｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ（ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌ） Ｋｉｔ， １３０－０９７－３４３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）およびＲａｐｉｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ Ａｎｔｉ－Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， １３０－０９７－６００（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）により行われる。
Ｇ）ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）での、染色された細胞の測定。
実験結果
ＩＦＮγ＋Ｔ細胞（ＩＦＮγ生成）の頻度が高いほど、抗原特異的細胞の反応が高度になり、幹細胞移植に対するプラスの効果が高くなる。この効果は、９５：５の混合物については期待されるが、標的細胞のＴＣＲａｂ枯渇画分については期待されない。
９５：５の混合物（ＴＣＲａｂ枯渇画分：ＣＤ４５ＲＡ枯渇画分）は、ＴＣＲａｂ枯渇画分と比較して、ＣＥＦ－ＰｏｏｌおよびＣＭＶでの刺激後にＩＦＮγが生成されることを示す。このことは、９５：５の混合物がＣＭＶに対する抗原特異的Ｔ細胞およびＣＥＦ－Ｐｏｏｌ（ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザ）由来のペプチドを含むことを示している。このことは、ＴＣＲａｂ枯渇画分と比較して有利である。
図１に、白血球除去物、ＴＣＲａｂ枯渇画分および９５：５の混合物（ＴＣＲａｂ枯渇：ＣＤ４５ＲＡ枯渇）についてのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ生成から、各サンプルについて陰性対照を差し引いたものを示す。ＴＣＲａｂ枯渇画分と比較して、「９５：５の混合物（ＴＣＲａｂ枯渇：ＣＤ４５ＲＡ枯渇）」のカラムから、ＩＦＮγ生成のプラスの効果を見て取ることができる。
図２に、ＴＣＲａｂ枯渇画分および９５：５の混合物（ＴＣＲａｂ枯渇：ＣＤ４５ＲＡ枯渇）についてのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ生成から、各サンプルについて陰性対照を差し引いたものを示す。ＴＣＲａｂ枯渇画分由来の細胞は反応を示さず、すなわちＩＦＮγ生成を示さないが、一方で本発明の方法により得られた細胞は、ＩＦＮγ生成のプラスの効果を示す。
本発明の方法で得られた抗原特異的Ｔ細胞は、幹細胞移植後の免疫防御を支援することができるとともに、様々な疾患（例えばＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザ）から患者を守ることができよう。
同種異系反応性の低下
未処理のアフェレーシス生成物は、同種異系反応性Ｔ細胞を含み、これによって患者への輸注後に重度の副作用が生じる可能性がある。ＴＣＲα／βの枯渇によって、同種異系反応性が除かれる。同種異系反応性細胞がＣＤ４５ＲＡ枯渇生成物に含まれている場合には、ＴＣＲα／β枯渇生成物とＣＤ４５ＲＡ枯渇生成物の組み合わせ物は、これらの同種異系反応性細胞を含みうる。
手法：末梢血単核細胞を、磁気細胞選別によってＣＤ４５ＲＡ陽性細胞とＣＤ４５ＲＡ陰性細胞とに分離した。γ線を照射した第三者のＰＢＭＣを、共培養系においてＣＤ４５ＲＡ陽性または陰性のレスポンダー細胞を活性化するための刺激細胞として使用した。ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞およびＣＤ４５ＲＡ陰性細胞の増殖応答を、ＢｒｄＵカウント数によって評価した。活性化状態を、細胞培養上清中のインターフェロンγの定量によって評価した。独立した３回の実験を行った。
結果：ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞は、ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞と比較して有意に高いＢｒｄＵカウント数を有していた（２０００００対４００００）。このことは、同種異系細胞との相互作用時に、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞では活性増殖が生じるが、ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞では活性増殖が生じないことを示している。同種異系細胞との相互作用時に、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の上清ではインターフェロンγが検出されたが、ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞の上清ではインターフェロンγが検出されなかった。
結論：ＴＣＲα／β枯渇幹細胞生成物にＣＤ４５ＲＡ枯渇細胞を加えても、この幹細胞生成物の、望ましくない同種異系反応性が生じる可能性が高まることはない。
細胞生成物／医薬組成物の製造
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ｐｌｕｓにおいて：分離プログラムＤＥＰＬＥＴＩＯＮ ３．１を設定し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｔｕｂｉｎｇ Ｓｅｔを使用する。ＴＣＲａｂ標識生成物を用いて実行したＤＥＰＬＥＴＩＯＮ ３．１／Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｔｕｂｉｎｇ Ｓｅｔの敏感な枯渇を完了させる直前に、ＣＤ４５ＲＡ標識細胞（５％）を、再適用のバッグに加えた。
枯渇前の組成：
（１．１２Ｅ１０＝２．７４Ｅ９の）ＴＣＲａｂ＋／ＣＤ４５ＲＡ＋細胞２４．５％
枯渇後の組成：
（３．３３Ｅ９＝１Ｅ６の）ＴＣＲａｂ＋／ＣＤ４５ＲＡ＋細胞０．０３％、ＴＣＲａｂ＋／ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の、３．４３ ｌｏｇの枯渇。

Claims (8)

  1. 骨髄または血液に由来するサンプルから細胞集団を調製する方法であって、
    ａ）前記サンプルを、前記サンプルの細胞の５０～９９％を含む第１の画分と、前記サンプルの細胞の５０～１％を含む第２の画分とに分割するステップ、
    ｂ）前記第１の画分の細胞を、ＴＣＲα／βに対する第１のマーカーで標識するステップ、
    ｃ）前記第２の画分の細胞を、ＣＤ４５ＲＡに対する第２のマーカーで標識するステップ、
    ｄ）前記標識された細胞を前記第１および第２の画分から除去し、残りの細胞を合して細胞集団とするステップ
    を含む方法。
  2. 前記第１のマーカーは、ＴＣＲα／βに対する抗体または抗原結合性フラグメントと、検出部分とを含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
  3. 前記第２のマーカーは、ＣＤ４５ＲＡに対する抗体または抗原結合性フラグメントと、検出部分とを含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
  4. 前記第１の画分および／または前記第２の画分および／または前記細胞集団の細胞を、ＣＤ１９に対する第３のマーカーで標識し、前記標識された細胞を除去することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
  5. 前記第３のマーカーは、ＣＤ１９に対する抗体または抗原結合性フラグメントと、検出部分とを含むことを特徴とする、請求項４記載の方法。
  6. 前記第１および／または第２および／または第３のマーカーの前記検出部分は、蛍光色素、磁性粒子または放射性標識であることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
  7. ステップｄ）において、第１の画分と第２の画分とを合し、前記合した画分から前記標識された細胞を除去することを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
  8. ステップｄ）において、標識された細胞を、前記第１の画分および前記第２の画分から別々に除去し、各画分の残りの細胞を合することを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
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