CN111566201A - 使用用于表达嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)的病毒载体转导细胞的方法 - Google Patents

使用用于表达嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)的病毒载体转导细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111566201A
CN111566201A CN201980007785.6A CN201980007785A CN111566201A CN 111566201 A CN111566201 A CN 111566201A CN 201980007785 A CN201980007785 A CN 201980007785A CN 111566201 A CN111566201 A CN 111566201A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
target antigen
cell
express
transduced
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980007785.6A
Other languages
English (en)
Inventor
R.贝斯威克
E.陈
C.佩蒂科尼
J.福克纳
E.科索普劳
M.普勒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Autolus Ltd
Original Assignee
Autolus Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Autolus Ltd filed Critical Autolus Ltd
Publication of CN111566201A publication Critical patent/CN111566201A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464413—CD22, BL-CAM, siglec-2 or sialic acid binding Ig-related lectin 2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C12N5/0087—Purging against subsets of blood cells, e.g. purging alloreactive T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6045—RNA rev transcr viruses
    • C12N2810/6054—Retroviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6072—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses
    • C12N2810/6081—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses rhabdoviridae, e.g. VSV

Abstract

本发明提供了一种用病毒载体转导细胞的方法，该病毒载体包含编码针对靶抗原的嵌合抗原受体(CAR)或转基因T细胞受体(TCR)的核酸，其中细胞包含表达靶抗原的细胞亚群和不表达靶抗原的细胞亚群，该方法包括以感染复数(MOI)转导细胞的步骤，使得与表达靶抗原的细胞亚群相比，不表达靶抗原的细胞亚群以更大的程度被转导。本发明还提供了通过此类方法制备的细胞组合物及其在治疗和/或预防疾病中的用途。

Description

使用用于表达嵌合抗原受体(CAR)或转基因T细胞受体(TCR) 的病毒载体转导细胞的方法
发明领域
本发明涉及用病毒载体转导细胞的方法，该病毒载体包含编码针对靶抗原的嵌合抗原受体(CAR)或转基因T细胞受体(TCR)的核酸序列。待转导的细胞包含一定比例的表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞。该方法包括以感染复数(MOI)转导细胞的步骤，使得与表达靶抗原的细胞相比，不表达靶抗原的细胞以更大的程度被转导。本发明进一步涉及通过本发明的转导方法制备的细胞组合物及其在治疗和/或预防疾病中的用途。
发明背景
过继细胞疗法(ACT)是一种个性化疗法，其涉及向受试者施用具有针对特定疾病相关抗原的活性的免疫细胞。使用天然存在的肿瘤反应性淋巴细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)进行的ACT介导了患黑色素瘤患者的持久、完全消退。然而，黑色素瘤似乎是唯一可重复产生能够特异性抗肿瘤识别和反应性的TIL培养物的癌症。
随后的方法试图通过基因工程细胞表达抗肿瘤受体，将ACT更广泛地应用于治疗其他疾病和癌症。例如，TCR由一条α链和一条β链组成。这些受体识别已由MHC分子加工并呈递的抗原。已经表明用编码识别MART-1黑色素瘤-黑色素细胞抗原的TCR的逆转录病毒转导的正常循环淋巴细胞介导肿瘤消退。
另一种方法是施用经基因表达以表达CAR的淋巴细胞。CAR是人工受体，其可以通过将抗体重链和轻链的可变区连接到单独的细胞内信号传导链或细胞内信号传导链与其他信号传导部分组合而构建。CAR识别在肿瘤细胞表面上呈递的抗原，但不需要受MHC限制。例如，已经表明针对B细胞抗原CD19的CAR介导晚期B细胞淋巴瘤的消退。
经基因修饰的细胞疗法的制造中必不可少的材料是起始材料，即将被基因修饰的细胞。这些细胞可以在自体疗法的情况下从患者获得，或者在同种异体疗法的情况下从不同的供体获得。这些细胞可以从外周血或白细胞采集物(leukapheresate)，例如，从待治疗患者(自体)或不同的供体(同种异体)获得。
可以通过用病毒载体转导含有T细胞的细胞样品如白细胞采集物来制备表达CAR的T细胞。大多数研究方案的目标是实现最大的转导，因此在转导步骤中通常使用饱和(或过量)量的载体。
仍然需要用病毒载体转导细胞的改善方法，其提供可再现的效率和/或增强的安全性，和/或其避免制造不适合施用于患者的细胞群和/或药物组合物，从而防止随后的治疗延迟。
附图说明
图1–显示TRBC1细胞耗竭的荧光激活细胞分选(FACS)图。如所示用未缀合的抗体/抗Ms IgG微珠或生物素化的抗体/抗生物素微珠进行代表性耗竭。图显示未耗竭输入、来自2.1x107上进行的耗竭的TRBC1-输出(耗竭的柱流经)和TRBC1+输出(柱捕获)样品中的TRBC1+细胞含量。
图2–显示TRBC1耗竭效率的图。平均数据显示(A)耗竭前(输入)和耗竭后(TRBC1-输出)TRBC1+细胞含量的比较。(B)从耗竭恢复的输入细胞亚组的百分比(TRBC1-输出)(n＝13)。
图3–显示TRBC1 CAR转导比较的图。数据显示在过程结束时使用retronectin实现的转导的水平(标志物+/CD3+细胞)(未耗竭n＝15；耗竭n＝11；8对匹配。配对t检验n＝8)。
图4–显示转导效率v TRBC1+细胞含量的图。在转导时将未耗竭细胞中的转导与TRBC1+细胞含量相关的数据(n＝11)。指示转导失败的TRBC1+细胞含量。
图5–显示TRBC1 CAR-转导过程比较的图。数据显示(A)具有细胞存活力的最终CD3和TRBC1细胞含量(未耗竭n＝12；耗竭n＝15；12对匹配。配对t检验n＝12)。(B)转导后的培养扩增(未耗竭n＝7；耗竭n＝5；4对匹配。配对t检验n＝4)。
图6–显示转导的(标志物+)CD8+T细胞亚组中耗尽表型的图。平均数据显示表达多个耗尽标志物(Lag3、PD1和Tim3)的细胞的百分比(未耗竭n＝12；耗竭n＝15；12对匹配。配对t检验n＝12)。
图7–显示转导的CD8+T细胞亚组中记忆表型的条形图和图。平均数据显示初始细胞亚组(CCR7+/CD45RA+)增强的表型，以鉴定CD62L+/CD27+细胞并进一步区分未分化的细胞(n＝3)。
图8–显示细胞因子释放测定法结果的图。过程结束数据显示释放到培养物中的(A)颗粒酶B，(B)IL-2，(C)IFN-g和(D)TNF-a的浓度(未耗竭n＝5；耗竭n＝7；5对匹配。配对t检验n＝5)。
图9–显示细胞毒性测定法：靶细胞杀伤的结果的图。数据显示48小时后杀伤的TRBC1+Raji细胞(A)相对于未转导的对照细胞的百分比(针对非特异性杀伤进行标准化)，(B)相对于单独培养的TRBC1+Raji细胞的百分比(针对普通细胞死亡进行标准化)(未耗竭n＝5；耗竭n＝7)。
图10–显示细胞毒性：细胞因子释放测定法的结果的图。数据显示48小时后释放的(A)颗粒酶B，(B)IL-2，(C)IFN-g和(D)TNF-a的浓度(未耗竭n＝5；耗竭n＝7；5对匹配。配对t检验n＝5)。
图11–显示TRBC1+细胞转导的条形图。数据显示以不同MOI对未耗竭、TRBC1+和耗竭细胞进行转导的比较，(A)用TRBC1 CAR，(B)用对照CAR(n＝1；重复孔的平均值)。
图12–显示CD19+细胞耗竭的FACS图。使用CD19+微珠和MACS选择柱进行的代表性耗竭。图显示未耗竭的输入、CD19-(耗竭的柱流经)和CD19+输出(柱捕获)样品。
图13–显示制造过程的第6天(D6)培养的B细胞(即CD20+)的百分比的图。即使在未耗竭培养物中，在培养结束时仍检测到低百分比的活CD20+细胞(即<1％)。N＝2
图14–显示培养期第7天(D7)结束时的转导效率的图。从活的CD3+细胞中测量％CAR+细胞。与未耗竭的对照相比，在CD19耗竭的细胞中观察到更高的转导。N＝4。
图15–显示释放到培养基中的细胞因子的图。这些过程结束数据显示释放到培养物中的(A)颗粒酶B，(B)IFN-γ，(C)IL-2和(D)TNF-α的浓度。对于所有细胞因子，与未耗竭相比在耗竭样品中观察到最低浓度。N＝4。
本发明方面的概述
本发明人提供了一种用于制备包含CAR或转基因TCR的经基因修饰的细胞群的方法。
本发明人已经显示，当转导其中一些细胞表达CAR或TCR的靶抗原的细胞群时，可以调节感染复数(MOI)，使得与表达靶抗原的细胞相比，不表达靶抗原的细胞以更大的程度被转导。
不希望受理论的束缚，本发明人预测这是由于转导过程期间的受体干扰引起的。对于表达靶抗原的细胞亚群，本发明人预测病毒载体经由结合靶抗原的CAR或TCR与细胞结合而不是(或同时)经由病毒包膜蛋白与细胞结合。在低MOI时，这意味着优先转导不表达靶抗原的细胞。在高MOI时，由于所有受体均饱和，因此克服了这种影响。
大多数病毒转导方案的目的是实现细胞的最大转导。因此，大多数转导方案都使用过量的载体。因此，现有方案教导远离本发明的方法，本发明的方法涉及故意使用低MOI，使得优先转导不表达靶抗原的细胞。
因此，在第一方面，本发明提供了用病毒载体转导细胞的方法，该病毒载体包含编码针对靶抗原的嵌合抗原受体(CAR)或转基因T细胞受体(TCR)的核酸，其中细胞包含表达靶抗原的细胞亚群和不表达靶抗原的细胞亚群，
该方法包括以感染复数(MOI)转导细胞的步骤，使得与表达靶抗原的细胞亚群相比，不表达靶抗原的细胞亚群以更大的程度被转导。
与转导之前的细胞群相比，经基因修饰的细胞群将具有更高比率的不表达靶抗原的细胞:表达靶抗原的细胞。
可以以MOI用病毒载体转导细胞群，使得不表达靶抗原的细胞被转导，而表达靶抗原的细胞不被转导。在通过流式细胞术不可检测到亚群中的转导细胞的情况下，则可以认为该细胞亚群“不被转导”。
在本发明的方法中，至少5％、10％、20％或30％的不表达靶抗原的细胞亚群可以被转导，且少于1％的表达靶抗原的细胞亚群可以被转导。
在本发明的方法中，至少20％的不表达靶抗原的细胞亚群可以被转导，且表达靶抗原的细胞亚群不被显著转导。在通过流式细胞术不可检测到亚群中的转导细胞的情况下，则可以认为该细胞亚群“不被转导”或“不被显著转导”。
可以选择MOI以实现不表达靶抗原的细胞亚群的约10-50％转导。
在本发明的方法中，可以用RD114-假型病毒载体以0.2至1.0的范围的MOI转导细胞。
在本发明的方法中，可以用GALV-假型病毒载体以1.0至2.0的范围的MOI转导细胞。
在本发明的方法中，可以用VSVG-假型病毒载体以5.0至10.0的范围的MOI转导细胞。
CAR或TCR的靶抗原可以是TCR beta恒定区1(TRBC1)。
CAR或TCR的靶抗原可以是TCR beta恒定区2(TRBC2)。
方法可以包括以下步骤：
(i)提供细胞的起始群；
(ii)对所述起始群耗竭表达靶抗原的细胞；和
(iii)用表达CAR或TCR的病毒载体以感染复数(MOI)转导靶抗原耗竭的细胞，使得与表达靶抗原的残留细胞相比，不表达靶抗原的细胞以更大的程度被转导。
少于10％、5％或1％的经基因修饰的细胞可以表达CAR或转基因TCR的靶抗原。
在第二方面，本发明提供了细胞组合物，其通过根据本发明的第一方面的方法转导细胞而制备。
在第三方面，本发明提供了药物组合物，其包含通过根据本发明的第一方面的方法转导的细胞。
在第四方面，本发明提供了根据本发明的第二或第三方面的组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
在第五方面，本发明提供了用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据本发明的第二或第三方面的组合物施用于有此需要的受试者的步骤。
方法可以包括以下步骤：
(i)提供包含细胞的起始群的样品；
(ii)对所述起始群耗竭表达靶抗原的细胞；
(iii)用表达CAR或TCR的病毒载体以感染复数(MOI)转导靶抗原耗竭的细胞，使得与表达靶抗原的残留细胞相比，不表达靶抗原的细胞以更大的程度被转导；和
(iv)将来自(iii)的细胞施用于受试者。
疾病可以是癌症，如T细胞白血病或淋巴瘤。
在第六方面，提供了根据本发明的第三方面的药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
本发明的方法提供了几个优点。具有低或可忽略比例的表达靶抗原的经转导细胞的经转导细胞群意味着杀伤行为(fratricide)减少，并且细胞分化和/或耗尽的可能性较低。这意味着细胞应具有施用后改善的体内持久性和/或施用后改善的细胞溶解活性。
本发明的另一个优点是通过该方法产生的经基因修饰的细胞得以更均匀地经基因修饰。在对来自不同供体的细胞群进行的方法之间以及在细胞制备物和/或药物组合物之间存在较小的差异。
有利地，根据本发明的方法产生了经基因修饰的细胞群，其更纯且含有低水平或不可检测水平的表达靶抗原的细胞。根据本发明的方法最小化或消除了基因修饰表达靶抗原的细胞的风险。在靶细胞(即表达靶抗原的细胞)是癌细胞的情况下，这可以提供附加的安全性益处。
此外，当在细胞的来源(例如细胞的起始群)中存在高比例的表达靶抗原的细胞时，根据本发明的方法减少了转导或转染的失败。
另外的方面
在以下编号的段落中呈现了本发明的另外的方面：
1.制备包含嵌合抗原受体(CAR)或转基因T细胞受体(TCR)的经基因修饰的细胞群的方法，其包括：
(i)提供细胞的起始群；
(ii)对所述起始群耗竭表达靶抗原的细胞；和
(iii)将编码针对靶抗原的CAR或转基因TCR的核酸序列引入到耗竭的起始群的细胞中。
2.根据段落1的方法，其中将CAR或转基因TCR引入到细胞溶解性免疫细胞。
3.根据段落1的方法，其中细胞的起始群包含白细胞采集物(leukapheresate)。
4.根据前述段落中任一项的方法，其中细胞的起始群包含外周血单核细胞(PBMC)。
5.根据前述段落中任一项的方法，其中耗竭的起始群包含PBMC。
6.根据前述段落中任一项的方法，其中耗竭的起始群包含细胞溶解性免疫细胞。
7.根据前述段落中任一项的方法，其中耗竭的起始群包含T细胞。
8.根据前述段落中任一项的方法，其中靶抗原是TCR beta恒定区1(TRBC1)。
9.根据段落1至7中任一项的方法，其中靶抗原是TCR beta恒定区2(TRBC2)。
10.根据前述段落中任一项的方法，其中在经基因修饰的细胞群中CAR或转基因TCR靶抗原阳性细胞的百分比低于在起始群中。
11.根据前述段落中任一项的方法，其中少于10％的经基因修饰细胞表达CAR或转基因TCR的靶抗原。
12.根据前述段落中任一项的方法，其中少于5％的经基因修饰细胞表达CAR或转基因TCR的靶抗原。
13.根据前述段落中任一项的方法，其中少于1％的经基因修饰细胞表达CAR或转基因TCR的靶抗原。
14.根据前述段落中任一项的方法，其中将经基因修饰的细胞制备为药物组合物。
15.可通过前述段落中任一项获得的经基因修饰的细胞，其包含CAR或转基因TCR。
16.根据段落15的经基因修饰的细胞群。
17.根据段落16的经基因修饰的细胞群，其中细胞是细胞溶解性免疫细胞。
18.根据段落16或17的经基因修饰的细胞群，其中细胞是T细胞。
19.根据段落16至18中任一项的经基因修饰的细胞群，其中与不耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞而制备的经基因修饰的细胞相比，所述经基因修饰的细胞的分化程度较低。
20.根据段落16至19中任一项的经基因修饰的细胞群，其中与不耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞而制备的经基因修饰的细胞相比，所述经基因修饰的细胞具有增加的CD27和/或CD62L的表达。
21.根据段落16至20中任一项的经基因修饰的细胞群，其中与不耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞而制备的经基因修饰的细胞相比，所述经基因修饰的细胞较初始。
22.根据段落16-21中任一项的经基因修饰的细胞群，其中与不耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞而制备的经基因修饰的细胞相比，所述经基因修饰的细胞耗尽较少。
23.根据段落16-22中任一项的经基因修饰的细胞群，其中与不耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞而制备的经基因修饰的细胞相比，所述经基因修饰的细胞具有降低的一种或多种耗尽标志物的表达。
24.根据段落23的经基因修饰的细胞群，其中一种或多种耗尽标志物选自下组：PD1、Lag3和Tim3。
25.药物组合物，其包含根据段落16至24中任一项的经基因修饰的细胞群。
26.根据段落25的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
27.用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据段落25的药物组合物施用于有此需要的受试者的步骤。
28.根据段落27的方法，其包括以下步骤：
(i)提供包含细胞的起始群的样品；
(ii)对所述起始群耗竭表达靶抗原的细胞；
(iii)将编码针对靶抗原的CAR或转基因TCR的核酸序列引入到耗竭的起始群中的细胞中；和
(iv)将来自(iii)的细胞施用于受试者。
29.根据段落28的方法，其中细胞是自体的。
30.根据段落28的方法，其中细胞是同种异体的。
31.根据段落25的药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
32.根据段落26使用的药物组合物，根据段落27至30中任一项的方法或根据段落31的用途，其中疾病是癌症。
33.根据段落31或段落32使用的药物组合物、方法或用途，其中疾病是血液学恶性肿瘤。
34.根据段落32或段落33使用的药物组合物、方法或用途，其中疾病是白血病或淋巴瘤。
35.试剂盒，其包含：
(i)编码CAR或转基因TCR的第一核酸序列；和
(ii)用于耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞的手段。
36.减少药物组合物中表达靶抗原并表达针对靶抗原的CAR或转基因TCR的细胞数的方法，其包括：
提供细胞的起始群；
对所述起始群耗竭表达靶抗原的细胞；
将编码针对靶抗原的CAR或转基因TCR的核酸引入到耗竭的起始群的细胞中；和
将细胞掺入到药物组合物中。
37.根据段落36的方法，其中与在不耗竭表达靶抗原的细胞的起始群而生产的药物组合物相比，表达靶抗原并表达针对靶抗原的CAR或转基因TCR的细胞数减少。
38.根据段落36或37的方法，其中在掺入到药物组合物中之前使细胞扩增。
39.根据段落36至38中任一段的方法，其中在引入编码针对靶抗原的CAR或转基因TCR的核酸之前使细胞活化。
40.根据段落36至39中任一项的方法，其中细胞的起始群先前已被冷冻并在耗竭表达靶抗原的细胞之前融化。
41.根据段落36至40中任一项的方法，其中通过转导将CAR或转基因TCR引入到细胞中，并且感染复数足以转导不表达靶抗原的细胞而不足以转导表达靶抗原的细胞。
40.根据段落36至41中任一项的方法，其中在药物组合物中表达靶抗原的细胞的百分比低于在细胞的起始群中。
41.根据段落36至40中任一项的方法，其中药物组合物中少于10％的细胞表达靶抗原。
42.根据段落36至41中任一项的方法，其中药物组合物中少于5％的细胞表达靶抗原。
43.根据段落36至42中任一项的方法，其中药物组合物中少于1％的细胞表达靶抗原。
44.根据段落36至43中任一项的方法，其中药物组合物中少于5％的细胞表达针对靶抗原的CAR或转基因TCR和靶抗原。
45.根据段落36至43中任一项的方法，其中药物组合物中少于1％的细胞表达针对靶抗原的CAR或转基因TCR和靶抗原。
发明详述
本发明提供了用病毒载体转导细胞的方法，该病毒载体包含编码嵌合抗原受体或转基因T细胞受体的核酸序列。待转导的细胞包含一定比例的表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞。该方法包括以感染复数(MOI)转导细胞的步骤，使得与表达靶抗原的细胞相比，不表达靶抗原的细胞以更大的程度被转导。所得的细胞组合物可用于治疗和/或预防疾病的方法中。通过将经基因修饰的细胞施用于受试者，经基因修饰的细胞引起表达靶抗原的细胞的耗竭。
嵌合抗原受体(CAR)
经典嵌合抗原受体(CAR)是嵌合I型跨膜蛋白质，其将细胞外抗原识别结构域(结合物)连接至细胞内信号传导结构域(胞内域)。结合物通常是衍生自单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)，但其可以基于包含抗体样抗原结合位点的其他形式。通常需要间隔区结构域以将结合物与膜分离并允许其呈合适的定向。使用的常见间隔区结构域是IgG1的Fc。取决于抗原，更紧凑的间隔区可以满足，例如来自CD8α的茎部和甚至仅仅是IgG1铰链。跨膜结构域将蛋白质锚定在细胞膜中并将间隔区连接至胞内域。
早期的CAR设计具有衍生自FcεR1或CD3ζ的γ链的细胞内部分的胞内域。结果，这些第一代受体传输免疫信号1，其足够触发T细胞对关联靶细胞的杀伤，但不能完全活化T细胞以增殖或存活。为了克服这一限制，构建了复合胞内域：将T细胞共刺激分子的细胞内部分融合至CD3ζ的细胞内部分，产生了第二代受体，其能够在抗原识别后同时传输活化和共刺激信号。最通常使用的共刺激结构域是CD28的共刺激结构域。这提供了最强力的共刺激信号-即免疫信号2，其触发T细胞增殖。还已经描述了一些受体，其包括TNF受体家族胞内域，例如紧密相关的OX40和41BB，其传输存活信号。现在已经描述甚至更强力的第三代CAR，其具有能够传输活化、增殖和存活信号的胞内域。
可以使用例如逆转录病毒载体将编码CAR的核酸转移至T细胞。可以采用慢病毒载体。以这种方式，可以生成大量的抗原特异性细胞用于过继细胞转移。当CAR结合靶抗原时，这导致活化信号传输至上面有其表达的T细胞。因此CAR将T细胞的特异性和细胞毒性引向表达靶向抗原的肿瘤细胞。
因此，CAR通常包含：(i)抗原结合结构域；(ii)间隔区；(iii)跨膜结构域；和(iii)包含信号传导结构域或者与信号传导结构域缔合的细胞内结构域。
抗原结合结构域
抗原结合结构域是CAR的识别抗原的部分。
本领域已知许多抗原结合结构域，包括基于抗体，抗体模拟物和T细胞受体的抗原结合位点的那些。例如，抗原结合结构域可以包含：衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)；靶抗原的天然配体；对靶标具有足够亲和力的肽；单结构域抗体；人工单结合物如Darpin(设计的锚蛋白重复蛋白)；或衍生自T细胞受体的单链。
抗原结合结构域可以包含不基于抗体的抗原结合位点的结构域。例如，抗原结合结构域可以包含基于作为肿瘤细胞表面受体的可溶性配体(例如可溶性肽，如细胞因子或趋化因子)的蛋白质/肽的结构域；或膜锚定配体的细胞外结构域或在肿瘤细胞上表达的结合对对应物的受体。
抗原结合结构域可以基于抗原的天然配体。
抗原结合结构域可以包含来自组合文库的亲和肽或从头设计的亲和蛋白/肽。
间隔区结构域
CAR可以包含间隔区序列以连接抗原结合结构域和跨膜结构域，并且在空间上将抗原结合结构域与胞内域分开。柔性间隔区允许抗原结合结构域在不同方向上定向以促进抗原结合。
间隔区序列可以例如包含IgG1 Fc区、IgG1铰链或人CD8茎部或小鼠CD8茎部。或者，间隔区可以包含备选接头序列，其具有与IgG1 Fc区、IgG1铰链或CD8茎部相似的长度和/或结构域间隔特性。可以改变人IgG1间隔区以去除Fc结合基序。
跨膜结构域
跨膜结构域是跨越膜的CAR的序列。
跨膜结构域可以是在膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。这通常是包含几个疏水残基的alpha螺旋。任何跨膜蛋白的跨膜结构域可以用于供应本发明的跨膜部分。
蛋白质的跨膜结构域的存在和跨度可以由本领域技术人员使用生物信息学工具如TMHMM算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测。此外，鉴于蛋白质的跨膜结构域是相对简单的结构，即预测形成具有足以跨越膜的足够长度的疏水性alpha螺旋的多肽序列，也可以使用人工设计的TM结构域(例如，如US 7052906B1中所述，其通过引用并入本文)。
跨膜结构域可以衍生自CD28，其提供良好的受体稳定性。
激活胞内域
胞内域是CAR的信号传输部分。它可以是CAR的细胞内结构域的一部分或与其缔合。在抗原识别后，受体簇、天然CD45和CD148被排除在突触之外，并且信号被传输至细胞。最普遍使用的胞内域组分是含有3个ITAM的CD3-zeta的胞内域组分。这在抗原结合后传输激活信号至T细胞。CD3-zeta可以不提供完全有能力的激活信号，且可以需要另外的共刺激信号传导。例如，嵌合CD28和OX40可以与CD3-Zeta一同使用以传输增殖/存活信号，或可以全部三个一起使用。
在CAR包含激活胞内域的情况下，其可以包含单独的CD3-Zeta胞内域，CD3-Zeta胞内域与CD28或OX40的胞内域，或CD28胞内域和OX40和CD3-Zeta胞内域。
含有ITAM基序的任何胞内域均可以充当激活胞内域。
转基因T细胞受体(TCR)
T细胞受体(TCR)是存在于T细胞的表面上的分子，其负责识别作为与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的肽的靶抗原的片段。
TCR是由两个不同的蛋白质链组成的异二聚体。在人类中，95％的T细胞中，TCR由alpha(α)链和beta(β)链组成(分别由TRA和TRB编码)，而在5％的T细胞中，TCR由gamma和delta(γ/δ)链组成(分别由TRG和TRD编码)。
每条链由两个细胞外结构域组成：可变(V)区和恒定(C)区。恒定区靠近细胞膜，随后是跨膜区和短的细胞质尾，而可变区则与肽/MHC复合物结合。TCRα链和β链的可变结构域各自具有三个高变或互补决定区(CDR)。CDR3是负责识别经加工的抗原的主要CDR。TCR的恒定结构域由短连接序列组成，其中半胱氨酸残基形成二硫键，该二硫键形成两条链之间的连接。
当TCR与抗原肽和MHC(肽/MHC)衔接时，T淋巴细胞通过信号转导活化。
与常规的抗体针对的靶抗原不同，TCR识别的抗原可以包括潜在的细胞内蛋白质的整个阵列，所述蛋白质作为肽/MHC复合物得以加工并递送到细胞表面。
通过使用载体人工将TRA和TRB基因；或TRG和TRD基因引入到细胞中，可以工程化改造细胞以表达异源(即非天然)TCR分子。此类“异源”TCR在本文中也可以称为“转基因TCR”。例如，可以将经基因修饰的TCR的基因重新引入到自体T细胞中，并转移回患者中进行T细胞过继疗法。
靶抗原
如本文所用，“靶抗原”是指CAR或转基因TCR对其具有特异性的抗原，即，CAR或转基因TCR的抗原结合结构域经工程化改造而对其具有特异性的抗原。
靶抗原可以是疾病相关抗原。
合适地，靶抗原可以与慢性感染相关。
合适地，靶抗原可以与自身免疫相关。
靶抗原可以是肿瘤相关抗原，例如癌症相关抗原。
各种靶抗原是已知的，如下表中所示。本发明中使用的抗原结合结构域可以是能够结合其中所示的抗原的结构域。
Figure BDA0002576641850000141
细胞
本发明还涉及通过本发明的方法可获得的(或获得的)包含CAR或转基因TCR的经基因修饰的细胞。
如本文所用，“细胞的起始群”是指将用于产生包含CAR或转基因TCR的经基因修饰的细胞的细胞样品。
细胞的起始群可以从任何血细胞或外周血单核细胞(PBMC)的来源获得。可以新鲜提供源细胞，或者可以在使用前将其冷冻保存。细胞的起始群可以不经任何进一步处理而使用，或者可以在分离或富集步骤之后使用。用于分离或富集白细胞的方法是本领域已知的。例如，可以通过各种方法例如密度梯度分开，如使用Ficoll-Paque密度梯度介质；通过磁珠分开，如MACS Milteyni Biotec CD3、CD4或CD8珠；通过淘析或任何其他方法从全血获得白细胞或PBMC。细胞的分开或分离可以是自动化的或可以手动进行。
细胞的起始群可以来自血液，例如来自外周血样本或来自活检。细胞的起始群可以是外周血单核细胞。细胞的起始群可以是白细胞采集物(leukapheresate)。
合适地，可以从受试者(第一方)获得细胞的起始群。合适地，可以从供体(第二方)获得细胞的起始群。合适地，可以从作为不相关供体的供体(第三方)获得细胞的起始群。
或者，细胞可以衍生自可诱导祖细胞或胚胎祖细胞离体分化为例如T细胞。或者，可以使用保留其裂解功能并可以充当治疗剂的永生细胞系。
合适地，起始群可以是从受试者获得的全血。合适地，起始群可以是从受试者获得的PBMC。合适地，起始群可以是从受试者获得的白细胞采集物。
合适地，起始群可以是从供体获得的全血。合适地，起始群可以是从供体获得的PBMC。合适地，起始群可以是从供体获得的白细胞采集物。
如本文所用，“耗竭的起始群”是指从起始群已耗竭表达靶抗原的细胞后剩余的细胞群。换句话说，起始群中已耗竭了表达靶抗原的细胞，即，耗竭的起始群是靶抗原耗竭的。
如本文所用，“耗竭的”意指特定类型的细胞(例如表达CAR或转基因TCR靶抗原的细胞)已在数目上选择性减少或已从细胞群中消除。
如本文所用，“转导的细胞”是指已经经历转导过程的细胞群。该细胞群可以含有已成功进行基因修饰的细胞和未成功进行基因修饰的细胞的混合物。
如本文所用，“经基因修饰的细胞”意指已经经修饰以包含或表达CAR或转基因TCR的细胞。用于工程化改造细胞的方法是本领域已知的，并且包括通过转导如逆转录病毒或慢病毒转导对细胞进行基因修饰。
合适地，经基因修饰的细胞是其基因组已通过转导进行修饰的细胞。合适地，经基因修饰的细胞是其基因组已通过逆转录病毒转导进行修饰的细胞。合适地，经基因修饰的细胞是其基因组已通过慢病毒转导进行修饰的细胞。
如本文所用，术语“引入”是指用于例如通过转导将外来DNA或RNA插入到细胞中的方法。转导是经由病毒载体将外来DNA或RNA引入细胞的过程。
可以通过用病毒载体转导引入编码CAR或转基因TCR的DNA或RNA来生成根据本发明的经基因修饰的细胞。
在引入编码CAR或转基因TCR的核酸序列之前，可以例如通过用抗CD3单克隆抗体或抗CD3和抗CD28单克隆抗体两者处理来活化和/或扩增细胞。
细胞可以是细胞溶解性免疫细胞。
如本文所用，“细胞溶解性免疫细胞”是直接杀伤其他细胞的细胞。细胞溶解性细胞可以杀死癌细胞；病毒感染的细胞或其他受损细胞。细胞溶解性免疫细胞包括T细胞和自然杀伤(NK)细胞。
细胞溶解性免疫细胞可以是T细胞或T淋巴细胞，其是在细胞介导的免疫中发挥中心作用的淋巴细胞类型。通过细胞表面上TCR的存在，它们可以与其他淋巴细胞如B细胞和NK细胞区分开来。存在多种类型的T细胞，如下文所总结。
辅助性T细胞(TH细胞)在免疫学过程中辅助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞。TH细胞在其表面上表达CD4。当TH细胞通过抗原呈递细胞(APC)的表面上的MHC II类分子呈递肽抗原时，TH细胞被激活。这些细胞可以分化成几种亚型之一，包括TH1、TH2、TH3、TH17、Th9或TFH，其分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。
细胞溶解性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也涉及移植排斥。CTL在其表面处表达CD8。CTL可以称为CD8+T细胞。这些细胞通过与存在于所有有核细胞的表面上的MHC I类缔合的抗原结合而识别其靶标。通过调节性T细胞分泌的IL-10、腺苷和其他分子，可以使CD8+细胞失活至无反应性(anergic)状态，其阻止自身免疫性疾病，如实验性自身免疫性脑脊髓炎。
记忆T细胞是在感染已经消退之后长期持续的抗原特异性T细胞的亚组。它们在再次暴露于其关联抗原后迅速扩增为大量效应T细胞，从而为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包含三种亚型：中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。
调节性T细胞(Treg细胞)，以前称为抑制性T细胞，对于维持免疫耐受性至关重要。它们的主要作用是关闭T细胞介导的免疫以朝向免疫反应的结束，以及阻抑逃脱胸腺中阴性选择的过程的自身反应性T细胞。
已经描述了两种主要类型的CD4+Treg细胞，即天然存在的Treg细胞和适应性或诱导性Treg细胞。
天然存在的Treg细胞(也称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)出现在胸腺中，并已经与发育中的T细胞和已经用TSLP激活的髓样(CD11c+)和浆细胞样(CD123+)树突状细胞之间的相互作用相关。天然存在的Treg细胞可以通过称为FoxP3的细胞内分子的存在与其他T细胞区分开来。FOXP3基因的突变可以阻止调节性T细胞发育，导致致命的自身免疫性疾病IPEX。
如本文所用，术语“天然Treg”意指胸腺衍生的Treg。天然Treg是CD4+CD25+FOXP3+Helios+神经纤毛蛋白1+。与iTreg相比，nTreg具有增加的PD-1(程序性细胞死亡1，pdcd1)、神经纤维蛋白1(Nrp1)、Helios(Ikzf2)和CD73表达。单独基于Helios蛋白或神经纤维蛋白1(Nrp1)的表达，nTreg可以与iTreg区分开来。
适应性Treg细胞(也称为Tr1细胞或Th3细胞)可以在正常免疫应答期间产生。
外周生成的Treg可以称为诱导性Treg(iTreg)细胞。
如本文所用，术语“诱导性调节性T细胞”(iTreg)意指从胸腺外部的成熟CD4+常规T细胞发育而来的CD4+CD25+FOXP3+Helios-神经纤维蛋白1-T细胞。例如，可以在存在IL-2和TGF-β的情况下从CD4+CD25-FOXP3-细胞体外诱导iTreg。
细胞可以是T细胞，如辅助性T细胞、细胞溶解性T细胞、记忆T细胞或调节性T细胞(Treg)。
细胞可以是自然杀伤细胞(NK细胞)，其是形成先天免疫系统的一部分的一类细胞溶解性细胞。NK细胞以MHC非依赖性方式对来自病毒感染细胞的先天信号提供快速应答。
NK细胞(属于先天性淋巴样细胞群)被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，并构成从产生B和T淋巴细胞的共同淋巴样祖细胞分化的第三种细胞。已知NK细胞在骨髓、淋巴结、脾、扁桃体和胸腺中分化和成熟，在那里它们进入到循环中。
细胞可以是干细胞或祖细胞。
如本文所用，术语“干细胞”意指未分化的细胞，其能够无限地产生更多相同类型的干细胞，并且通过分化可以从中产生其他特化的细胞。干细胞是多能的。干细胞可以是例如胚胎干细胞或成年干细胞。
如本文所用，术语“祖细胞”意指能够分化以形成一种或多种类型的细胞但在体外具有有限的自我更新的细胞。
合适地，细胞可以是能够分化为细胞溶解性免疫细胞的任何细胞。
合适地，细胞可以能够分化为T细胞或NK细胞。
合适地，细胞可以是胚胎干细胞(ESC)。合适地，细胞可以是造血干细胞或造血祖细胞。合适地，细胞可以是诱导性多能干细胞(iPSC)。合适地，细胞可以从脐带血获得。合适地，细胞可以从成人外周血获得。
在一些方面，可以从脐带血获得造血干细胞和祖细胞(HSPC)。脐带血可以根据本领域已知的技术(例如，美国专利号7,147,626和7,131,958，其通过引用并入本文)来收获。
一方面，HSPC可以从多能干细胞来源获得，例如，诱导性多能干细胞(iPSC)和胚胎干细胞(ESC)。
如本文所用，术语“造血干细胞和祖细胞”或“HSPC”是指表达抗原标志物CD34(CD34+)的细胞和此类细胞的群体。在特定实施方案中，术语“HSPC”是指通过抗原标志物CD34的存在(CD34+)和谱系(lin)标志物的不存在来鉴定的细胞。包含CD34+和/或Lin(-)细胞的细胞群包括造血干细胞和造血祖细胞。
HSPC可以从成人的骨髓中获得或分离，其包括股骨、髋、肋骨、胸骨和其他骨骼。可以使用针头和注射器直接从髋获得或分离出含有HSPC的骨髓抽吸物。HSPC的其他来源包括脐带血、胎盘血、动员的外周血、华通氏胶、胎盘、胎儿血、胎儿肝或胎儿脾。在特定的实施方案中，收获足够量的HSPC用于治疗性应用可能需要动员受试者中的干细胞和祖细胞。
如本文所用，术语“诱导性多能干细胞”或“iPSC”是指已经经重编程为多能状态的非多能细胞。一旦将受试者的细胞重编程为多能状态，就可以随后将细胞编程为所期望的细胞类型，如造血干细胞或祖细胞(分别为HSC和HPC)。
如本文所用，术语“重编程”是指将细胞的效力增加至分化程度较低的状态的方法。
如本文所用，术语“编程”是指降低细胞效力或将细胞分化至分化程度更高的状态的方法。
本发明提供了通过以感染复数(MOI)用病毒载体转导细胞起始群(包含表达靶抗原的细胞亚群和不表达靶抗原的细胞亚群)，使得不表达靶抗原的细胞亚群比表达靶抗原的细胞亚群以更大的程度被转导来制备的细胞组合物。
本发明还提供了如下制备的细胞组合物：
(i)提供细胞起始群；
(ii)对所述起始群耗竭表达靶抗原的细胞；和
用表达CAR或TCR的病毒载体以感染复数(MOI)转导靶抗原耗竭的细胞，使得与表达靶抗原的残留细胞相比，不表达靶抗原的细胞以更大的程度被转导。
在转导步骤之前，细胞群可以经活化或可以不经活化。
在一个实施方案中，(iii)将编码针对靶抗原的CAR或转基因TCR的核酸序列引入到耗竭的起始群的细胞中与(ii)对所述起始群耗竭表达靶抗原的细胞同时进行。
在一个实施方案中，(iii)将编码针对靶抗原的CAR或转基因TCR的核酸序列引入到耗竭的起始群的细胞中在(ii)对所述起始群耗竭表达靶抗原的细胞之后进行。
任选地，该方法可以包括在(ii)(对所述起始群耗竭表达靶抗原的细胞)之前进行(iii)(将编码针对靶抗原的CAR或转基因TCR的核酸序列引入到耗竭的起始群的细胞中)，即可以在细胞中耗竭表达靶抗原的细胞之前将编码针对靶抗原的CAR或转基因TCR的核酸序列引入到细胞中。
任选地，该方法可以另外包括从受试者分离含有细胞的样品。该含有细胞的样品可以用作细胞的起始群。
任选地，在引入编码CAR或转基因TCR的核酸序列之前，可以活化和/或扩增本发明中使用的细胞。
本领域已知的用于活化和/或扩增细胞的任何方法均可以用于本发明的方法中。例如，可以例如通过用抗CD3单克隆抗体或抗CD3和抗CD28单克隆抗体两者处理来活化和/或扩增本发明中使用的细胞例如T细胞。
合适地，白细胞介素7(IL-7)和/或白介素15(IL-15)可以用于体外扩增细胞，例如T细胞。合适地，白介素2(IL-2)可以用于体外细胞扩增。
可以通过用细胞因子如白介素2(IL-2)和/或白介素15(IL-15)处理来活化和/或扩增本发明中使用的NK细胞。与辅助细胞如单核细胞、B-类淋巴母细胞或表达刺激性分子的细胞系一起温育可以用于提供用于NK细胞扩增的另外的信号。
如本文所用，“活化”意指细胞已经经刺激，从而导致细胞增殖、分化或启动效应功能。
用于测量细胞活化的方法是本领域已知的，并且包括例如通过流式细胞术测量活化标志物的表达，如CD69、CD25、CD38或HLA-DR的表达或测量细胞内细胞因子。
如本文所用，“扩增”意指已经诱导细胞或细胞群增殖。
细胞群的扩增可以例如通过计数群体中存在的细胞数来测量。可以通过本领域已知的方法如流式细胞术来确定细胞的表型。
一方面，根据本发明的方法产生了包含嵌合抗原受体或转基因T细胞受体的经工程化的细胞(例如，经基因修饰的细胞)的群体。
合适地，可以通过根据本发明的方法制备根据本发明的经基因修饰的细胞或经基因修饰的细胞的群体。
一方面，与未根据本发明的方法制备(即未耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞而制备)的经基因修饰的细胞相比，根据本发明的经基因修饰的细胞群或通过根据本发明的方法可获得(例如获得)的经基因修饰的细胞群的分化程度较低。
如本文所用，“分化的”是指特定细胞在该细胞类型的分化的线性进展内的发育阶段。例如，可以基于CD4+和CD8+T细胞的分化状态将其分类为不同的记忆亚组。CD4+和CD8+T细胞遵循从初始T细胞分化为中央记忆和效应记忆细胞群的进展途径。CD8+T细胞的分化状态与其增殖和持久能力负相关。
临床前研究表明，当经基因修饰的T细胞处于分化的早期阶段(如初始或中央记忆细胞)时，获得了改善的抗肿瘤应答。与效应记忆细胞相比，中央记忆细胞具有改善的体内持久性。
一方面，与未根据本发明的方法制备(即未耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞而制备)的经基因修饰的细胞相比，根据本发明的经基因修饰的细胞群或通过根据本发明的方法可获得的经基因修饰的细胞群更初始。
如本文所用，“初始”意指未完全分化的细胞。初始T细胞可以未遇到抗原。
初始T细胞的特征可以在于L选择(CD62L)的表面表达，活化标志物CD25、CD44或CD69的不存在以及记忆CD45RO同等型的不存在，例如初始T细胞可以是CD62LHiCD25LoCD44LoCD69Lo。初始T细胞还表达功能性IL-7受体，其由亚基IL-7受体-α，CD127和共同γ链，CD132组成。
一方面，可以将初始细胞亚组定义为CCR7+/CD45RA+细胞。合适地，可以将初始细胞亚组进一步定义为CCR7+/CD45RA+/CD62L+/CD27+细胞。
合适地，与未根据本发明的方法制备(即用高MOI的病毒载体和/或未耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞而制备)的经基因修饰的细胞相比，根据本发明的经基因修饰的细胞或通过根据本发明的方法可获得(例如获得)的经基因修饰的细胞可以具有增加的CD27和/或CD62L的表达。
不希望受理论的束缚，较初始或不成熟的经基因修饰的细胞群有利于在疗法中使用，因为当与具有更高分化表型的细胞相比，初始细胞表现出增强的体内持久性和增强的细胞溶解活性。
合适地，与使用高MOI和/或不耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞的方法相比，根据本发明的方法可以产生更多的初始或中央记忆细胞。合适地，至少75％的经基因修饰的细胞可以是初始或中央记忆细胞。合适地，至少80％的经基因修饰的细胞可以是初始或中央记忆细胞。合适地，至少85％的经基因修饰的细胞可以是初始或中央记忆细胞。
合适地，与使用高MOI和/或不耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞的方法相比，根据本发明的方法可以产生更少的效应和效应记忆细胞。合适地，少于25％的经基因修饰的细胞可以是效应或效应记忆细胞。合适地，少于20％的经基因修饰的细胞可以是效应或效应记忆细胞。合适地，少于15％的经基因修饰的细胞可以是效应或效应记忆细胞。
一方面，与未根据本发明的方法制备(即用高MOI的病毒载体和/或未耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞而制备)的经基因修饰的细胞相比，根据本发明的经基因修饰的细胞群或通过根据本发明的方法可获得(或获得)的经基因修饰的细胞群得以较少的耗尽。
如本文所用，“耗尽”或“耗尽的”意指细胞表现出降低的效应功能和/或改变的表型。免疫细胞耗尽描述了免疫细胞的功能障碍的状态，通常在肿瘤或慢性感染的情况下。耗尽可以伴随着表型变化、表观遗传修饰和转录谱改变。
效应功能可以包括效应细胞因子的产生和直接的细胞毒活性。
合适地，与未根据本发明的方法制备(即用高MOI的病毒载体和/或未耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原而制备)的经基因修饰的细胞相比，根据本发明的经基因修饰的细胞群或通过根据本发明的方法可获得(或获得)的经基因修饰的细胞群可以具有一种或多种耗尽标志物的表达降低。
例如，在NK细胞的情况下，效应功能可以包括产生干扰素gamma(IFN-γ)。NK细胞的其他效应功能包括直接的细胞毒活性，如取决于穿孔素和颗粒酶的活性，或通过肿瘤坏死因子alpha(TNF-α)、Fas配体(FasL)和TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)诱导靶细胞凋亡。
合适地，与未耗尽的NK细胞相比，耗尽的NK细胞可以产生减少量的效应细胞因子，例如IFN-γ。合适地，与未耗尽的NK细胞相比，耗尽的NK细胞可以具有降低的细胞溶解活性，并且可以例如产生减少量的CD107a和/或颗粒酶B和/或穿孔素。
合适地，一种或多种耗尽标志物可以选自下组：IFN-γ、TNF-α、FasL、TRAIL、CD107a、颗粒酶B和穿孔素。合适地，一种或多种耗尽标志物可以选自下组：IFN-γ、TNF-α、FasL、TRAIL、CD107a、颗粒酶B和穿孔素，其中经基因修饰的细胞是NK细胞。
合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含降低的IFN-γ产生。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含降低的TNF-α产生。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含降低的FASL表达。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含降低的TRAIL表达。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含降低的CD107a表达。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含降低的颗粒酶B的产生。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含降低的穿孔素的产生。
例如，在T细胞的情况下，耗尽可以通过不良的效应功能、抑制性受体的持续表达和/或不同于功能性效应或记忆T细胞的转录状态来定义。例如，耗尽的T细胞可以表达高水平的PD1、Tim3、Lag3、CD43(1B11)、CD69和抑制性受体，但低水平的CD62L和CD127以及降低的白介素2(IL-2)、TNF-α和IFN-γ产生。
合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含增加的(例如高)PD1的表达。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含增加的(例如高)Tim3的表达。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含增加的(例如高)Lag3的表达。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含增加的(例如高)CD43(1B11)的表达。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含增加的(例如高)CD69的表达。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含增加的(例如高)抑制性受体的表达。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含降低的(例如低)CD62L的表达。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含降低的(例如低)CD127的表达。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含在遇到靶标时降低的(例如低)IL-2产生。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含在遇到靶标时降低的(例如低)TNF-α产生。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含在遇到靶标时降低的(例如低)IFN-γ产生。
合适地，一种或多种耗尽标志物可以选自下组：PD1、Lag3和Tim3。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含PD1。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含Lag3。合适地，一种或多种耗尽标志物可以包含Tim3。合适地，一种或多种耗尽标志物可以选自下组：PD1、Lag3和Tim3，其中经基因修饰的细胞是T细胞。
一方面，超过10％、超过15％、超过20％、超过25％、超过30％或超过35％的根据本发明的经基因修饰的细胞群或通过根据本发明的方法可获得(或获得)的经基因修饰的细胞群可以是初始的(CCCR7+/CD45RA+)和CD62L+/CD27+。合适地，超过10％的根据本发明的经基因修饰的细胞可以是初始的(CCCR7+/CD45RA+)和CD62L+/CD27+。合适地，超过15％的根据本发明的经基因修饰的细胞可以是初始的(CCCR7+/CD45RA+)和CD62L+/CD27+。合适地，超过20％的根据本发明的经基因修饰的细胞可以是初始的(CCCR7+/CD45RA+)和CD62L+/CD27+。合适地，超过30％的根据本发明的经基因修饰的细胞可以是初始的(CCCR7+/CD45RA+)和CD62L+/CD27+。合适地，超过40％的根据本发明的经基因修饰的细胞可以是初始的(CCCR7+/CD45RA+)和CD62L+/CD27+。
合适地，可以在CD8+T细胞亚组中测量初始细胞的比例。
一方面，少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％的根据本发明的经基因修饰的细胞群或通过根据本发明的方法可获得(或获得)的经基因修饰的细胞群可以表达多种耗尽标志物。合适地，少于30％的根据本发明的经基因修饰的细胞可以表现出多种耗尽标志物。合适地，少于25％的根据本发明的经基因修饰的细胞可以表现出多种耗尽标志物。合适地，少于20％的根据本发明的经基因修饰的细胞可以表现出多种耗尽标志物。合适地，少于15％的根据本发明的经基因修饰的细胞可以表现出多种耗尽标志物。
合适地，多种耗尽标志物可以选自增加的(例如高水平)PD1、Tim3、Lag3、CD43(1B11)、CD69和抑制性受体的表达以及降低的(例如低水平)CD62L和CD127的表达和降低的(例如低)白介素2(IL-2)、TNF-α和IFN-γ的产生。合适地，多种耗尽标志物可以选自增加的(例如高水平)Lag3、PD1和Tim3的表达。
一方面，与未根据本发明的方法制备(即用高MOI的病毒载体和/或未耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞而制备)的经基因修饰的细胞相比，根据本发明的经基因修饰的细胞群或通过根据本发明的方法可获得(或获得)的经基因修饰的细胞群具有增加的CAR或转基因TCR转导效率的水平。
合适地，与未根据本发明的方法制备(即用高MOI的病毒载体和/或未耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞而制备)的经基因修饰的细胞的转导效率相比，根据本发明的经基因修饰的细胞群或通过根据本发明的方法可获得(或获得)的经基因修饰的细胞群的转导效率的水平可以至少高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。
合适地，与未根据本发明的方法制备(即用高MOI的病毒载体和/或未耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞而制备)的经基因修饰的细胞的转导效率相比，根据本发明的经基因修饰的细胞群或通过根据本发明的方法可获得(或获得)的经基因修饰的细胞群的转导效率的水平可以至少高50％。合适地，与未根据本发明的方法制备(即用高MOI的病毒载体和/或未耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞而制备)的经基因修饰的细胞的转导效率相比，根据本发明的经基因修饰的细胞群或通过根据本发明的方法可获得(或获得)的经基因修饰的细胞群的转导效率的水平可以至少高60％。合适地，与未根据本发明的方法制备(即用高MOI的病毒载体和/或未耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞而制备)的经基因修饰的细胞的转导效率相比，根据本发明的经基因修饰的细胞群或通过根据本发明的方法可获得(或获得)的经基因修饰的细胞群的转导效率的水平可以至少高70％。合适地，与未根据本发明的方法制备(即用高MOI的病毒载体和/或未耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞而制备)的经基因修饰的细胞的转导效率相比，根据本发明的经基因修饰的细胞群或通过根据本发明的方法可获得(或获得)的经基因修饰的细胞群的转导效率的水平可以至少高80％。合适地，与未根据本发明的方法制备(即用高MOI的病毒载体和/或未耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞而制备)的经基因修饰的细胞的转导效率相比，根据本发明的经基因修饰的细胞群或通过根据本发明的方法可获得(或获得)的经基因修饰的细胞群的转导效率的水平可以至少高90％。
一方面、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的经转导或转染的细胞群包含CAR或转基因TCR。合适地，至少40％的经转导或转染的细胞群包含CAR或转基因TCR。合适地，至少50％的经转导或转染的细胞群包含CAR或转基因TCR。合适地，至少60％的经转导或转染的细胞群包含CAR或转基因TCR。
合适地，表达靶抗原并且已经经转导或转染以表达CAR或转基因CAR的细胞的百分比小于5％。合适地，表达靶抗原并且已经经转导或转染以表达CAR或转基因CAR的细胞的百分比小于3％。合适地，表达靶抗原并且已经经转导或转染以表达CAR或转基因CAR的细胞的百分比小于2％。合适地，表达靶抗原并且已经经转导或转染以表达CAR或转基因CAR的细胞的百分比小于1％。合适地，表达靶抗原并且已经经转导或转染以表达CAR或转基因CAR的细胞的百分比是不可检测的。
病毒载体
逆转录病毒和慢病毒可以用作载体或递送系统，用于将感兴趣的核苷酸(NOI)或多个NOI转移到靶细胞中。转移可以在体外、离体或体内发生。当以这种方式使用时，病毒通常称为病毒载体。
Gamma逆转录病毒载体是1990年在基因疗法临床试验中采用的第一种病毒载体，并且至今仍然常用。最近，对衍生自复杂逆转录病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)的慢病毒载体的兴趣日益浓厚，这是由于它们转导非分裂细胞的能力。逆转录病毒和慢病毒载体作为基因转移工具的最吸引人的特征包括大的遗传有效载荷(高达约9kb)、最小的患者免疫应答、体内和体外高转导效率以及永久修饰靶细胞的遗传组分从而维持递送的基因的长期表达的能力。
本发明的方法中使用的逆转录病毒或慢病毒载体可以基于能够将遗传信息递送至真核细胞的任何合适的逆转录病毒或慢病毒。例如，逆转录病毒载体可以是alpha逆转录病毒载体、gamma逆转录病毒载体或泡沫逆转录病毒(spumaretroviral)载体。慢病毒载体可以基于人免疫缺陷病毒(HIV)或非灵长类慢病毒如马传染性贫血病毒(EIAV)。
病毒载体可以包含提供假型病毒载体的异源病毒包膜糖蛋白。例如，病毒包膜糖蛋白可以衍生自猫科内源性病毒(RD114)、水泡性口炎病毒(VSV-G)或长臂猿白血病病毒(GALV)。
方法
提供了用病毒载体转导细胞的方法，该病毒载体包含编码嵌合抗原受体(CAR)或转基因T细胞受体(TCR)的核酸序列。
制备用于细胞疗法的经基因修饰的细胞群的方法是本领域通常已知的。制备用于细胞疗法的经基因修饰的细胞的方法可以包括以下步骤的一些或全部：
起始材料可以首先得以冷冻，例如一旦从供体(例如细胞的来源)获得，细胞的起始群可以得以冷冻。如果使用冷冻的材料，则在进行下一个步骤之前，可以发生解冻和任选的静止期。或者，可以使用新鲜的起始材料。起始材料可以针对白细胞(例如Ficoll梯度)或针对T细胞进行初始纯化/富集。
然后可以激活起始材料，例如可以激活T细胞。这可以通过本领域已知的任何方法来进行，例如使用可溶性CD3/CD28抗体，CD3/CD28珠(例如Dynabeads)或CD3/28纳米基质(例如TransAct)。如本领域中所理解的，在进行下一个步骤之前的激活步骤的长度可以变化，例如从不到一个小时到超过72小时。
然后可以用病毒载体(例如逆转录病毒或慢病毒)转导活化的细胞。这可以在存在转导增强物(例如retronectin或凝聚胺(polybrene))的情况下，或通过旋转接种(spinoculation)或通过简单的温育来完成。非病毒载体也可以用于基因修饰步骤(例如，使用RNA电穿孔或使用DNA的转座)。
然后，根据所需细胞的最终剂量，细胞可以经历持续数小时至几天的扩增步骤。通常，所需的细胞越多，扩增步骤越长。
在制造过程结束时，细胞可以新鲜使用，或者优选在使用前冷冻。
因此，整个过程可以需要2至18天。通常，整个过程需要6至10天。
在该过程期间，可以在细胞生长培养基中培养细胞，该培养基可以含有另外的补充物。此类补充物可以是人血清、胎牛血清、人血清白蛋白和/或细胞因子(例如IL2、IL7和/或IL15、IL21)。
如本文所用，“MOI”/“感染复数”表示转导中使用的每细胞的感染性载体颗粒的数目。例如，1的MOI意味着向104个细胞中添加了104个感染性载体颗粒。通过在容许的细胞系上滴定病毒载体获得感染性颗粒的数目。
合适地，转导的细胞类型可以与滴定所用的细胞类型相同。在这种情况下，通过定量PCR或其他合适的方法估计，1的MOI导致每细胞的平均载体整合数为1。
可以以低感染复数(MOI)转导细胞。例如，与转导通过不耗竭靶抗原阳性细胞的方法制备的细胞所需的MOI相比，可以在本发明的方法中使用较低的MOI以实现特定水平的细胞转导。
有利的是，以较低的MOI转导细胞群防止表达靶抗原的细胞的转导，同时允许不表达靶抗原的细胞的转导。
合适地，选择MOI使得不表达靶抗原的细胞被转导，且表达靶抗原的细胞不被转导。合适地，选择MOI使得不表达靶抗原的细胞比表达靶抗原的细胞以更大的程度转导。与转导之前的细胞相比，经基因修饰的细胞群可以具有更高比率的不表达靶抗原的细胞:表达靶抗原的细胞。
合适地，选择MOI使得至少5％的不表达靶抗原的细胞被转导，且表达靶抗原的细胞不被转导。
合适地，选择MOI使得至少10％的不表达靶抗原的细胞被转导，且表达靶抗原的细胞不被转导。合适地，选择MOI使得至少15％的不表达靶抗原的细胞被转导，且表达靶抗原的细胞不被转导。
合适地，选择MOI使得至少20％的不表达靶抗原的细胞被转导，且表达靶抗原的细胞不被转导。
表达靶抗原的细胞可以“不被转导”，因为此类细胞是不可检测的，或者以最小或非常低的水平，如1％或更小被转导。
合适地，本发明的方法可以有利地使得能够使用低MOI进行转导。合适地，与不耗竭靶抗原阳性细胞的相应方法相比，在本发明的方法中实现靶抗原阴性细胞的20-30％转导所需的MOI可以更低。
不希望受理论的束缚，因为转导所需的MOI较低，本发明的方法可以为制造经基因修饰的细胞提供安全性益处。有利地，通过本发明的方法，表达靶抗原的细胞可以不被转导或以最小/非常低的水平转导。
合适地，可以选择MOI以实现不表达靶抗原的细胞的约10-50％的转导。合适地，可以选择MOI以实现不表达靶抗原的细胞的约15-40％的转导。合适地，可以选择MOI以实现不表达靶抗原的细胞的约20-30％的转导。
阻止表达靶抗原的细胞的转导同时允许不表达靶抗原的细胞转导的MOI范围将取决于病毒载体的包膜蛋白。
对于用RD114包膜蛋白假型化的病毒载体，合适地，MOI可以为约0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1或约1.2。合适地，MOI的范围可以为约0.1-1.2。合适地，MOI的范围可以为约0.2-1.0。合适地，MOI的范围可以为约0.3-0.8。合适地，MOI的范围可以为约0.4-0.6。
对于用RD114包膜蛋白假型化的病毒载体,合适地，实现约20-30％转导的MOI可以为约0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1或约1.2。合适地，实现约20-30％转导的MOI的范围可以为约0.1-1.2。合适地，实现约20-30％转导的MOI的范围可以为约0.2-1.0。合适地，实现约20-30％转导的MOI的范围可以为约0.3-0.8。合适地，实现约20-30％转导的MOI的范围可以为约0.4-0.6。
对于用GALV包膜蛋白假型化的病毒载体，合适地，MOI可以为约0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75或约2。合适地，MOI的范围可以为约0.5-2。合适地，MOI的范围可以为约0.8-1.8。合适地，MOI的范围可以为约1-2。合适地，MOI的范围可以为约1.4-1.6。
对于用GALV包膜蛋白假型化的病毒载体，合适地，实现约20-30％转导的MOI可以为约0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75或约2。合适地，实现约20-30％转导的MOI的范围可以为约0.5-2。合适地，实现约20-30％转导的MOI的范围可以为约0.8-1.8。合适地，实现约20-30％转导的MOI的范围可以为约1-2。合适地，实现约20-30％转导的MOI的范围可以为约1.4-1.6。
对于用VSV-G假型化的病毒载体，合适地，MOI可以为约3、4、5、6、7、8、9或约10。合适地，MOI的范围可以为约3-10。合适地，MOI的范围可以为约4-10。合适地，MOI的范围可以为约5-10。合适地，MOI的范围可以为约6-8。
对于用VSV-G假型化的病毒载体，合适地，实现约20-30％转导的MOI可以为约3、4、5、6、7、8、9或约10。合适地，实现约20-30％转导的MOI的范围可以为约3-10。合适地，实现约20-30％转导的MOI的范围可以为约4-10。合适地，实现约20-30％转导的MOI的范围可以为约5-10。合适地，实现约20-30％转导的MOI的范围可以为约6-8。
合适地，在耗竭的起始群或经基因修饰的细胞群中CAR或转基因TCR靶抗原阳性细胞的百分比可以低于在起始群中。
合适地，当与起始群中靶抗原阳性细胞的百分比相比时，在耗竭的起始群或经基因修饰的细胞群中靶抗原阳性细胞的百分比可以减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。合适地，靶抗原阳性细胞的百分比可以减少至少90％。合适地，靶抗原阳性细胞的百分比可以减少至少95％。合适地，抗原阳性细胞的百分比可以减少至少98％。合适地，当与起始群中靶抗原阳性细胞的百分比相比时，在耗竭的起始群中或在经基因修饰的细胞群中抗原阳性细胞的百分比可以减少至少99％。
合适地，少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％的耗竭的起始群可以表达CAR或转基因TCR的靶抗原。
合适地，少于10％的耗竭的起始群可以表达CAR或转基因TCR的靶抗原。
合适地，少于5％的耗竭的起始群可以表达CAR或转基因TCR的靶抗原。
合适地，少于3％的耗竭的起始群可以表达CAR或转基因TCR的靶抗原。
合适地，少于2％的耗竭的起始群可以表达CAR或转基因TCR的靶抗原。
合适地，少于1％的耗竭的起始群可以表达CAR或转基因TCR的靶抗原。
合适地，少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％的经基因修饰的细胞可以表达CAR或转基因TCR的靶抗原。
合适地，少于10％的经基因修饰的细胞可以表达CAR或转基因TCR的靶抗原。
合适地，少于5％的经基因修饰的细胞可以表达CAR或转基因TCR的靶抗原。
合适地，少于1％的经基因修饰的细胞可以表达CAR或转基因TCR的靶抗原。
药物组合物
本发明还涉及药物组合物，其包含本发明的经基因修饰的细胞或根据本发明的经基因修饰的细胞群。
一方面，提供了药物组合物，其包含根据本发明的经基因修饰的细胞群或通过根据本发明的方法可获得的经基因修饰的细胞群。
合适地，药物组合物可以包含冷冻保存的根据本发明的经基因修饰的细胞或通过根据本发明的方法可获得的经基因修饰的细胞。
药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的药物活性多肽和/或化合物。此类配制剂可以例如是以适合于静脉内输注的形式。
合适地，细胞的起始群可以先前已经经冷冻。如果使用冷冻细胞，则可以将细胞解冻，并且任选地可以允许其在加工之前在培养物中恢复。
方法可以另外包括富集白细胞的起始群的步骤。可以使用本领域已知的任何分离或富集白细胞的方法。例如，可以通过各种方法例如密度梯度分开，如使用Ficoll-Paque密度梯度介质；通过磁珠分开，如MACS Milteyni Biotec CD3、CD4或CD8珠；通过淘析或任何其他方法从全血获得白细胞或PBMC。细胞的分开或分离可以是自动化的或可以手动进行。
治疗方法
本发明的经基因修饰的细胞可以能够杀伤靶细胞，如癌细胞、病毒感染的细胞或其他受损的细胞。
本发明的经基因修饰的细胞可以用于疗法中。本发明的经基因修饰的细胞可以用于治疗和/或预防疾病。合适地，包含根据本发明的经基因修饰的细胞的药物组合物可以用于疗法中。合适地，包含根据本发明的经基因修饰的细胞的药物组合物可以用于治疗和/或预防疾病。
应当理解，将基于所需的疗法选择CAR或转基因TCR的靶抗原。例如，如果CAR或转基因TCR用于治疗癌症，则CAR或转基因TCR的靶抗原可以是与癌症相关的抗原。
本发明的经基因修饰细胞可以用于治疗感染，如病毒感染。
本发明的经基因修饰的细胞还可以用于控制病原性免疫应答，例如在自身免疫性疾病、变态反应和移植物抗宿主排斥中。
本发明提供了用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括将通过本发明的方法制备的细胞组合物施用于受试者的步骤。
本发明提供了用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括将本发明的药物组合物施用于受试者的步骤。
本发明还提供了通过本发明的方法制备的细胞组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
本发明还提供了本发明的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
本发明还涉及根据本发明的经基因修饰的细胞或细胞组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
合适地，本发明的治疗方法可以涉及将本发明的药物组合物施用于受试者。
合适地，本发明提供了治疗的方法，其包括：
(i)提供包含细胞的起始群的样品；
(ii)对所述起始群耗竭表达靶抗原的细胞；
(iii)用表达CAR或TCR的病毒载体以感染复数(MOI)转导靶抗原耗竭的细胞，使得与表达靶抗原的残留细胞相比，不表达靶抗原的细胞以更大的程度被转导；和
(iv)将来自(iii)的细胞施用于受试者。
合适地，方法在施用于患者之前可以另外包括细胞扩增步骤，例如可以在施用于患者之前培养细胞。
本发明的经基因修饰细胞或药物组合物可以用于治疗和/或预防癌性疾病，如血液学恶性肿瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌、口腔和咽的癌症，其包括舌、口和咽的癌症；消化系统的癌症，其包括食道癌、胃癌和结肠直肠癌；肝和胆系(biliary tree)的癌症，其包括肝细胞癌和胆管癌；呼吸系统的癌症，其包括支气管癌和喉癌；骨和关节的癌症，其包括骨肉瘤；皮肤的癌症，其包括黑色素瘤；乳腺癌；生殖道的癌症，其包括女性的子宫、卵巢和宫颈癌，男性的前列腺和睾丸癌；肾道(renal tract)的癌症，其包括肾细胞癌和尿道(utterers)或膀胱的移行细胞癌；脑癌，其包括胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤；内分泌系统的癌症，包括甲状腺癌、肾上腺癌和多种内分泌新生物综合征相关的癌症；以及其他和未指明的部位的癌症，包括神经母细胞瘤。
合适地，本发明的经基因修饰的细胞或药物组合物可以用于治疗和/或预防血液学恶性肿瘤。
如本文所用，“血液学恶性肿瘤”是指影响血液和淋巴系统的癌症，并且包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和相关的血液病症。
合适地，本发明的经基因修饰的细胞或药物组合物可以用于治疗和/或预防血液学恶性肿瘤。
合适地，本发明的经基因修饰的细胞或药物组合物可以用于治疗和/或预防急性和慢性髓样或淋巴样白血病，其包括：急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、B细胞或T细胞急性淋巴母细胞性白血病(分别为B-ALL或T-ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓样白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、毛细胞白血病(HCL)和大颗粒淋巴细胞性白血病(LGLL)；淋巴瘤，其包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(NHL)，低度NHL和高度NHL两者；骨髓瘤(多发性骨髓瘤(MM))，其包括：闷烧或无症状的骨髓瘤和有症状的骨髓瘤以及其他与血液癌相关的状况，如意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、骨髓增生异常综合征(MDS)、孤立性浆细胞瘤和骨髓增生性新生物(MPN)，其包括原发性血小板增多症(ET)、骨髓纤维化(MF)和真性红细胞增多症(PV)。
合适地，本发明的经基因修饰的细胞或药物组合物可以用于治疗和/或预防T细胞淋巴瘤。合适地，本发明的经基因修饰的细胞或药物组合物可以用于治疗和/或预防T细胞白血病。
用于治疗T细胞淋巴瘤和/或白血病的方法涉及本发明的经基因修饰的细胞的治疗性用途。可以将经基因修饰的细胞施用于患有T细胞淋巴瘤和/或白血病的现有疾病的受试者，以减轻、减少或改善与疾病有关的至少一种症状和/或减慢、减少或阻断疾病的进展。
合适地，本发明的方法可以用于治疗与表达包含β恒定区的T细胞受体(TCR)的细胞的克隆扩增相关的任何淋巴瘤和/或白血病。因此，本发明可以涉及用于治疗涉及恶性T细胞的疾病的方法，所述恶性T细胞表达包含TRBC(如TRBC1或TRBC2)的TCR。
合适地，本发明的方法可以用于治疗T细胞淋巴瘤，其中恶性T细胞表达包含TRBC的TCR。本文中根据其标准含义使用“淋巴瘤”以指通常在淋巴结中发展但也可以影响脾、骨髓、血液和其他器官的癌症。淋巴瘤通常表现为淋巴样细胞的实体瘤。与淋巴瘤相关的主要症状是淋巴结病，尽管继发性(B)症状可以包括发烧、盗汗、体重减轻、食欲不振、疲劳、呼吸窘迫和瘙痒。
本发明的方法可以用于治疗T细胞白血病，其中恶性T细胞表达包含TRBC的TCR。本文中根据其标准含义使用“白血病”以指血液或骨髓的癌症。
以下是可以通过本发明的方法治疗的疾病的说明性、非详尽性清单。
合适地，T细胞淋巴瘤或白血病可以是外周T细胞淋巴瘤非特指型(PTCL-NOS)。合适地，T细胞淋巴瘤或白血病可以是血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)。合适地，T细胞淋巴瘤或白血病可以是间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。合适地，T细胞淋巴瘤或白血病可以是与肠病相关的T细胞淋巴瘤(EATL)。合适地，T细胞淋巴瘤或白血病可以是肝脾性T细胞淋巴瘤(HSTL)。合适地，T细胞淋巴瘤或白血病可以是结外性NK/T细胞淋巴瘤鼻型。合适地，T细胞淋巴瘤或白血病可以是皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。合适地，T细胞淋巴瘤或白血病可以是原发性皮肤(ALCL)。合适地，T细胞淋巴瘤或白血病可以是T细胞幼淋巴细胞性白血病。合适地，T细胞淋巴瘤或白血病可以是T细胞急性淋巴母细胞性白血病。
用本发明的经基因修饰的细胞或根据本发明的药物组合物进行治疗可以帮助防止通常伴随标准方法发生的肿瘤细胞的逃逸或释放。
术语“治疗”是指将根据本发明的经基因修饰的细胞、经基因修饰的细胞群或药物组合物施用于患有现有疾病或状况的受试者，以减轻、减少或改善至少一种与疾病有关的症状和/或减慢、减少或阻断疾病的进展。
如本文所用，对“预防”(或防病性)的提及是指延迟或预防疾病症状的发作。预防可以是绝对的(使得无疾病发生)，或者可以仅在一些个体中或在有限的时间内有效。
在本发明的一个优选实施方案中，本文所述的任何方法的受试者是哺乳动物，优选猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠。优选地，受试者是人。
施用
可以使用多种途径的任一种来完成药物组合物的施用，所述途径使药物组合物中包含的经基因修饰的细胞可被受试者生物利用。例如，组合物可以通过口服和肠胃外途径，腹膜内、静脉内、皮下、经皮、肌内施用，例如通过导管或支架经由局部递送。
合适地，根据本发明的经基因修饰的细胞或根据本发明的药物组合物静脉内施用。
本领域技术人员将理解，例如，递送的途径(例如口服比静脉内相比于皮下等)可以影响剂量和/或所需的剂量可以影响递送的途径。例如，当对特定部位或位置内特别高浓度的试剂感兴趣的情况下，集中递送可能是期望的和/或有用的。在优化给定治疗方案的途径和/或给药方案时要考虑的其他因素可以包括，例如，正在治疗的疾病(例如，类型或阶段等)、受试者的临床状况(例如，年龄、整体健康等)、组合疗法的存在或不存在以及执业医师已知的其他因素。
剂量为使得足以稳定或改善疾病症状。
通常，医师将确定最适合个体受试者的实际剂量，并且该实际剂量将随特定患者的年龄、体重和反应而变化。剂量为使得足以减少或耗竭表达靶抗原的细胞数。
用途
本发明还提供了根据本发明的药物组合物或经基因修饰的细胞群，其用于治疗疾病。药物组合物或经基因修饰的细胞群可以是任何如以上定义的。
本发明还涉及如上定义的本发明的经基因修饰的细胞群在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
试剂盒
本发明还提供了试剂盒，其包含：
(i)病毒载体，其包含编码CAR或转基因TCR的核酸序列；和
(ii)用于耗竭表达CAR或转基因TCR的靶抗原的细胞的手段。
如本文所用，“用于耗竭表达靶抗原的细胞的手段”是指本领域已知的适合从混合的细胞群中去除或分开特定细胞的任何产品。
合适地，试剂盒可以包含对靶抗原具有特异性的抗体。
合适地，试剂盒可以包含耗竭抗体。“耗竭抗体”是与靶细胞上存在的抗原结合并介导靶细胞死亡的抗体。因此，向细胞群施用耗竭抗体导致群体中表达靶抗原的细胞数减少/降低。
合适地，试剂盒可以包含抗体包被的固体基质。表达靶抗原的细胞可以通过吸附到抗体包被的固体基质中而耗竭。
合适地，试剂盒可以包含对靶抗原具有特异性的荧光抗体。可以通过流式细胞术分离包含靶抗原的细胞。
合适地，试剂盒可以包含免疫磁性产品，即对附着于磁性纳米颗粒或磁珠的靶抗原具有特异性的抗体。
现在将通过实施例的方式进一步描述本发明，所述实施例旨在帮助本领域的普通技术人员实施本发明，而无意于以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1–用于治疗T细胞淋巴瘤的经基因修饰的自体细胞基因疗法药物产品的制造
标准的CAR-T细胞制造过程可以通过以下五个阶段进行总结。已经评估了在激活步骤之前引入TRBC1+细胞耗竭步骤。
1.从白细胞采集物中分离PBMC以提供制造过程的起始材料。
2.在存在细胞因子的情况下，使用抗CD3和抗CD28单克隆抗体激活患者来源的T细胞。
3.用逆转录病毒上清液转导患者来源的T细胞。
4.使用细胞因子(药物物质[DS])扩增转导的T细胞。
5.将细胞配制并填充到袋中并冷冻保存(DP)。
利用MACS微珠和柱(Miltenyi)捕获用抗TRBC1抗体标记的TRBC1+细胞的原理证明(PoP)开发实验证明了TRBC1+和TRBC1-细胞的有效分选以及制造的可行性。另一个令人惊讶的结果是，证明了以所用的低感染复数(MOI)TRBC1+细胞难以进行转导(可能由于受体干扰，因为病毒粒子可以经由TCR而不是RD114受体结合细胞)。总而言之，整合耗竭步骤导致更稳健的过程(DP中更高的可再现转导效率和残留TRBC1+T细胞水平)与增强的安全性(DS/DP中最小/不可检测的转导TRBC1+T细胞水平)。
实验方法
使用结合MACS微珠(抗Ms和抗生物素)和柱(未在此报告中讨论但在图1中示例)的Ms(小鼠)抗TRBC1(JOVI-1)抗体(未缀合的和生物素化的)建立最佳TRBC1+细胞标记和耗竭/分选条件。进行了在不同规模的健康供体白细胞采集物上进行的一系列PoP开发实验以评价将耗竭步骤纳入CAR-T细胞制造过程，包括适应自动化的CliniMACS Prodigy CAR-T细胞制造方案用于GMP认证。在过程结束时，收集数据以确定耗竭的效率，并评估转导效率、细胞生长和存活力以及记忆和耗尽表型。此外，在培养基上进行的细胞因子分析提供了与T细胞活化和细胞毒性有关的关于IL-2、TNFα、IFNγ和颗粒酶B释放的信息。最后，细胞毒性/细胞因子释放测定法能够对产生的CAR-T细胞进行功能评价。这涉及将CAR-T细胞与TRBC1+Raji细胞(经转导以表达TRBC1肿瘤抗原的淋巴母细胞样肿瘤细胞系)共同培养。在48h后确定靶细胞的杀伤的FACS和细胞因子释放分析提供了CAR-T细胞细胞毒性和效力的测量。
方案概述
小规模和大规模实验从1.5x107至7x108个细胞中耗竭TRBC1+细胞，并转导0.3x106至1.4x108个T细胞。另外，从第0天开始，在CliniMACS Prodigy上进行了一些大规模实验的自动化。所有实验均遵循相同的基本方案。在第1天，将冷冻的供体白细胞单采术(leukapheresis)样品解冻，并在补充有血清的细胞培养基中温育过夜以进行恢复。
在第0天，用每106个细胞0.125μg抗TRBC1抗体(未缀合的或生物素化的)，以及随后的每107个细胞10μl MACS微珠(抗Ms或抗生物素)标记后，在MACS LS柱上耗竭/分选TRBC1+细胞。确定耗竭/分选前后样品中TRBC1+细胞含量的FACS提供了分选效率的评价。将来自分选和未分选亚组的细胞以1x106个细胞/ml接种在补充有血清和IL-7和IL-15的细胞培养基中，并加入TransAct试剂(Miltenyi)以活化T细胞。
表达靶抗原的细胞的耗竭
图1中的图显示来自2.1x107个细胞上进行的耗竭的未耗竭输入、TRBC1-输出(耗竭的柱流经)和TRBC1+输出(柱捕获)样品中的TRBC1+细胞含量。图2中显示的数据证明了初始耗竭步骤的有效性，其中耗竭后T细胞群中测量的TRBC1+细胞<1.2％，且>60％的TRBC1-T细胞输入得以恢复(TRBC1-/CD3+细胞)。
CAR转导
在第2天(激活后48小时)，使用Retronectin(Takara)或Vectofusin(Miltenyi)转导增强物，用抗TRBC1 CAR载体、对照CAR1载体或对照CAR2载体以指定的MOI转导细胞。允许细胞转导过夜，然后洗涤，重新接种在补充有血清和IL-7和IL-15的新鲜细胞培养基中，然后培养至第6-10天。
出乎意料的是，与未耗竭的细胞相比，使用耗竭的细胞进行CAR-T细胞生产导致抗TRBC1 CAR转导水平的显著改善(24.5％比39.8％)(图3)。尽管使用耗竭的细胞或对照CAR成功进行了平行转导，但使用未耗竭细胞的三个实验实际上未能用抗TRBC1 CAR进行转导(表1)。有趣的是，在所有三个中，起始材料中TRBC1+细胞的百分比很高(>40％)，表明进行耗竭具有出乎意料的优势。当绘制未耗竭样品的与TRBC1含量相比的转导效率的图时，确实观察到转导时转导效率与TRBC1+细胞含量之间存在弱相关性(图4)。
表1.抗TRBC1 CAR转导失败的实验。
Figure BDA0002576641850000381
细胞纯度
在制造过程结束时进行的分析由确定TRBC1+细胞含量和％转导效率的FACS以及CD3+和CD8+细胞亚组中耗尽(PD1、Lag3和Tim3表达)和记忆表型(针对CD45RA表达的CCR7)组成。还使用SimplePlex测定法测量了培养基中IL-2、TNFα、IFNγ和颗粒酶B的释放。还进行了细胞计数以评估培养物的扩增。
使用耗竭的细胞时，生产过程结束时的细胞纯度与未耗竭的细胞相比变化较小，并且显著改善(94.5％比87.4％CD3+)(图5A)。在这一点上，培养物扩增和存活力对于耗竭和未耗竭的细胞两者是相当的，但是使用耗竭的细胞的扩增变化也较小(分别为图5B和5A)。当使用未耗竭的细胞时，过程结束时保留的TRBC1+细胞含量与耗竭的细胞相比平均显著更高(>12％比<1％)(图5A)。出乎意料的是，期望的是来自抗TRBC1 CAR+细胞的杀伤将有效地耗竭TRBC1+细胞，并且该数据突显了如果不进行初始耗竭，最终药物产品中转导的恶性细胞的潜在风险。
表型分析
表型分析还鉴定出，在使用未耗竭细胞时，PD1、Lag3和Tim3耗尽标志物在转导的T细胞中的显著更高的共表达(图6)。基于CCR7、CD45RA、CD27和CD62L表达的相应记忆表型表明，当使用未耗竭细胞时分化程度更高的表型(图7)。
此外，在CAR-T细胞产生期间对最终培养物进行的细胞因子分析显示，使用耗竭的细胞，IL-2、TNFα、IFNγ和颗粒酶B的水平始终较低，但证明了用未耗竭的细胞变化很大，并且平均而言对于颗粒酶B和IL-2显著更高(图8)。细胞毒性数据(细胞杀伤和细胞因子释放)数据也表明，衍生自耗竭细胞的CAR-T细胞平均而言更加一致，并显示出如总体趋势所支持的改善的细胞杀伤和释放IL-2和TNF-α中统计上的显著差异(图9和10)。
还研究了从耗竭过程中保留下来的TRBC1+选择细胞的转导和扩增。出乎意料的是，当以低MOI转导用于我们的CAR-T细胞制造时，TRBC1+细胞无法成功地用抗TRBC1 CAR(<2％)转导，用通常不靶向TRBC1或T细胞的对照CAR(>30％)对这些细胞的有效转导表明是CAR特异性的(如图11中示例)。专门针对这种现象的一项小规模实验表明，尽管对耗竭细胞的效率相对较低，但通过显著增加MOI(>10倍)可以在这些细胞中实现抗TRBC1 CAR转导(27.7％比70％)(图11)。受体干扰可能是可能的原因，因为病毒粒子可能经由TCR以及RD114受体以通过使所有受体饱和来克服的高MOI与细胞结合。
总结和结论
这项工作确立了将耗竭表达靶抗原的细胞作为经基因修饰的细胞制造过程的一部分而不损害激活、转导和扩增培养物中耗竭的细胞的能力的可行性。
取而代之的是，本文所述的分析表明，耗竭TRBC1+细胞为细胞基因疗法药物产品的生产提供了独特的优势，该产品包含经逆转录病毒转导以表达抗TRBC1特异性CAR的T细胞；改善的转导和细胞纯度，以及比从未耗竭细胞产生的潜在分化程度更低的较少耗尽的CAR-T细胞。
此外，功能分析表明，当从耗竭的细胞中产生时，抗TRBC1 CAR-T细胞细胞毒性中改善的一致性和效力。
出人意料的是，制造细胞基因疗法药物产品的额外的安全性益处来自以下观察：当使用低MOI进行转导时，TRBC1+细胞无法用抗TRBC1 CAR进行转导。期望的是即使在白细胞采集物中存在TRBC1+肿瘤细胞，在以针对CAR-T细胞制造进行了优化的MOI用抗TRBC1CAR逆转录病毒进行转导的情况下，其也将不被有效地转导。
实施例2–用于治疗B细胞恶性肿瘤的经基因修饰的细胞基因疗法药物产品的制造
在健康的供体中，通常在起始白细胞采集物材料中观察到小百分比的B细胞，并且该群体通常在转导后接近CAR T细胞制造过程结束时消失。
使用四个健康的供体进行了一系列实验。对于每个供体，使用CD19+微珠和MACS选择柱耗竭B细胞。然后按照下面描述的标准制造过程培养CD19-(耗竭)白细胞采集物。对于每个供体，将未耗竭条件用作对照。
B细胞耗竭的一个实例如图12中所示。用PE缀合的CD20抗体对B细胞进行染色。用CD19抗体染色是不可行的，因为在用CD19微珠选择后观察到了CD19结合位点的封闭。
在制造过程结束时收集数据以评估转导效率。此外，在培养基上进行的细胞因子分析提供了与T细胞活化和细胞毒性有关的关于IL-2、TNFα、IFNγ和颗粒酶B释放的信息。
方案概述
实验在24孔板中进行。在第1天，将冷冻的供体白细胞采集物样品解冻，并在补充有血清的细胞培养基中温育过夜以进行恢复。在第0天，用抗CD19微珠标记后，在MACS LS柱上耗竭CD19+细胞。在一项实验中，在实验开始前一周耗竭B细胞，并将CD19耗竭和未耗竭的白细胞采集物样品冷冻并保存在液氮中，然后解冻用于实验。使用抗CD20抗体进行FACS，以确定耗竭/分选前后样品中的B细胞含量。将来自两种条件的细胞以1x106个细胞/ml接种在补充有血清和IL-7和IL-15的细胞培养基中，并加入TransAct试剂(Miltenyi)以活化T细胞。
然后在第2天，使用Retronectin(Takara)转导增强物用抗CD19/22CAR(也称为CD19/22CAR)以MOI 0.2转导所有条件下的细胞(0.3x 106个细胞/孔)。允许细胞转导过夜，然后洗涤，重新接种在补充有血清和IL-7和IL-15的新鲜细胞培养基中，然后培养至第7天。
结果
在培养的最后一天(第7天)测量了耗竭和未耗竭培养物两者的转导效率。如图14中所示，当在制造过程开始时进行B细胞耗竭步骤，观察到更高的转导。
在培养的7天结束时，针对每种条件收获上清液并分析细胞因子的存在。如图15中所示，在耗竭的培养物中观察到低浓度的IL-2、TNFα、IFNγ和颗粒酶B，而在未耗竭的培养物中发现其值变化更大且始终较高，表明在制造过程期间发生了B细胞杀伤。
总结和结论
靶向B细胞的细胞疗法的起始材料中B细胞的存在可以负面影响制造过程期间的转导效率。此外，在未耗竭的样品中观察到培养上清液中较高浓度的细胞因子，表明B细胞存在时制造过程期间发生杀伤。一旦体内输注，这可能潜在影响CAR T细胞的性能和持久性。
因此，在制造过程开始时增加B细胞耗竭步骤可以显著改善最终产品的质量和过程的稳健性，并且如果患者患有血液学恶性肿瘤，则确保安全性以最小化恶性B细胞转导的风险。
以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明不应不适当地限制于此类具体的实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员来说显而易见的是描述的用于实施本发明的方式的各种修改都在所附权利要求的范围内。

Claims (25)

1.用病毒载体转导细胞的方法，所述病毒载体包含编码针对靶抗原的嵌合抗原受体(CAR)或转基因T细胞受体(TCR)的核酸，其中所述细胞包含表达所述靶抗原的细胞亚群和不表达所述靶抗原的细胞亚群，
所述方法包括以感染复数(MOI)转导所述细胞的步骤，使得与所述表达靶抗原的细胞亚群相比，所述不表达靶抗原的细胞亚群以更大的程度被转导。
2.根据权利要求1的方法，其中至少5％的所述不表达靶抗原的细胞亚群被转导，且少于1％的所述表达靶抗原的细胞亚群被转导。
3.根据权利要求1的方法，其中至少10％的所述不表达靶抗原的细胞亚群被转导，且少于1％的所述表达靶抗原的细胞亚群被转导。
4.根据权利要求1的方法，其中至少15％的所述不表达靶抗原的细胞亚群被转导，且少于1％的所述表达靶抗原的细胞亚群被转导。
5.根据权利要求1的方法，其中至少20％的所述不表达靶抗原的细胞亚群被转导，且少于1％的所述表达靶抗原的细胞亚群被转导。
6.根据权利要求1的方法，其中至少30％的所述不表达靶抗原的细胞亚群被转导，且少于1％的所述表达靶抗原的细胞亚群被转导。
7.根据权利要求1的方法，其中至少20％的所述不表达靶抗原的细胞亚群被转导，且所述表达靶抗原的细胞亚群不被显著转导。
8.根据权利要求1的方法，其中选择所述MOI以实现所述不表达靶抗原的细胞亚群的约10-50％转导。
9.根据权利要求1的方法，其中用RD114-假型病毒载体以0.2至1.0的范围的MOI转导所述细胞。
10.根据权利要求1的方法，其中用GALV-假型病毒载体以1.0至2.0的范围的MOI转导所述细胞。
11.根据权利要求1的方法，其中用VSVG-假型病毒载体以5.0至10.0的范围的MOI转导所述细胞。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述靶抗原是TCR beta恒定区1(TRBC1)。
13.根据权利要求1至11中任一项的方法，其中所述靶抗原是TCR beta恒定区2(TRBC2)。
14.根据前述权利要求中任一项的方法，其包括以下步骤：
(i)提供细胞的起始群；
(ii)对所述细胞的起始群耗竭表达所述靶抗原的细胞；和
(iii)用表达所述CAR或TCR的病毒载体以感染复数(MOI)转导所述靶抗原耗竭的细胞，使得与表达所述靶抗原的残留细胞相比，不表达所述靶抗原的细胞以更大的程度被转导。
15.根据权利要求14的方法，其中少于10％的经基因修饰的细胞表达所述CAR或转基因TCR的靶抗原。
16.根据权利要求14的方法，其中少于5％的经基因修饰的细胞表达所述CAR或转基因TCR的靶抗原。
17.根据权利要求14的方法，其中少于1％的经基因修饰的细胞表达所述CAR或转基因TCR的靶抗原。
18.细胞组合物，其通过根据前述权利要求中任一项的方法转导细胞而制备。
19.药物组合物，其包含通过根据权利要求1至17中任一项的方法转导的细胞。
20.根据权利要求18或19的组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
21.用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据权利要求18或19的组合物施用于有此需要的受试者的步骤。
22.根据权利要求21的方法，其包括以下步骤：
(i)提供包含细胞的起始群的样品；
(ii)对所述细胞的起始群耗竭表达靶抗原的细胞；
(iii)用表达所述CAR或TCR的病毒载体以感染复数(MOI)转导所述靶抗原耗竭的细胞，使得与表达所述靶抗原的残留细胞相比，不表达所述靶抗原的细胞以更大的程度被转导；和
(iv)将来自(iii)的细胞施用于受试者。
23.根据权利要求21或22的方法，其中所述疾病是癌症。
24.根据权利要求23的方法，其中所述疾病是T细胞白血病或淋巴瘤。
25.根据权利要求18或19的组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
CN201980007785.6A 2018-01-09 2019-01-08 使用用于表达嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)的病毒载体转导细胞的方法 Pending CN111566201A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1800298.0A GB201800298D0 (en) 2018-01-09 2018-01-09 Method
GB1800298.0 2018-01-09
PCT/GB2019/050043 WO2019138217A1 (en) 2018-01-09 2019-01-08 Method for transducing cells with a viral vector for the expression of a chimeric antigen receptor (car) or transgenic t-cell receptor (tcr)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111566201A true CN111566201A (zh) 2020-08-21

Family

ID=61190493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980007785.6A Pending CN111566201A (zh) 2018-01-09 2019-01-08 使用用于表达嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)的病毒载体转导细胞的方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11903967B2 (zh)
EP (1) EP3737741A1 (zh)
JP (1) JP2021509287A (zh)
CN (1) CN111566201A (zh)
AU (1) AU2019207949A1 (zh)
CA (1) CA3023752A1 (zh)
GB (1) GB201800298D0 (zh)
WO (1) WO2019138217A1 (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230027993A1 (en) * 2014-03-05 2023-01-26 Autolus Limited Methods
US11385233B2 (en) 2015-03-05 2022-07-12 Autolus Limited Methods of depleting malignant T-cells
FI3298033T4 (fi) 2015-05-18 2023-09-22 Tcr2 Therapeutics Inc Koostumuksia ja lääkinnällisiä käyttöjä fuusioproteiineja käyttävälle tcr:n uudelleenohjelmoinnille
GB201709203D0 (en) 2017-06-09 2017-07-26 Autolus Ltd Antigen-binding domain
JP2020530993A (ja) * 2017-08-02 2020-11-05 オートラス リミテッド キメラ抗原受容体または改変ｔｃｒを発現し、選択的に発現されるヌクレオチド配列を含む細胞
GB201817172D0 (en) 2018-10-22 2018-12-05 Autolus Ltd Antibody
WO2021047804A1 (en) 2019-09-11 2021-03-18 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG In vitro method for transduction of t cells in the presence of malignant cells
CA3167308A1 (en) * 2020-01-10 2021-07-15 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for autoimmunity regulation
AU2021217373A1 (en) 2020-02-05 2022-08-04 Neoimmunetech, Inc. Method of treating a solid tumor with a combination of an IL-7 protein and CAR-bearing immune cells
AR122590A1 (es) * 2020-06-10 2022-09-21 Takeda Pharmaceuticals Co Sistema semiautomatizado de fibra hueca para transducción viral
CN111909277A (zh) * 2020-08-13 2020-11-10 上海市第一人民医院 一种靶向trbc1的人源化嵌合抗原受体、t细胞及用途
EP4200401A1 (en) * 2020-08-18 2023-06-28 Medigene Immunotherapies GmbH Enrichment of t cells using an anti-css antibody
GB202105686D0 (en) * 2021-04-21 2021-06-02 Imperial College Innovations Ltd Chimeric antigen receptor (CAR)-T cells

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106068276A (zh) * 2014-03-05 2016-11-02 Ucl商务股份有限公司 具有针对T细胞受体beta恒定区的抗原结合域的嵌合抗原受体(CAR)
WO2017117112A1 (en) * 2015-12-28 2017-07-06 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor -expressing cells

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4418900A (en) 1999-04-16 2000-11-02 Celltech Therapeutics Limited Synthetic transmembrane components
FR2825261B1 (fr) 2001-06-01 2003-09-12 Maco Pharma Sa Ligne de prelevement du sang placentaire comprenant une poche de rincage
CA2484182A1 (en) 2002-04-29 2003-11-13 Genpat77 Pharmacogenetics Ag Novel antibody binding tcr and tirc7 and its use in therapy and diagnosis
US7147626B2 (en) 2004-09-23 2006-12-12 Celgene Corporation Cord blood and placenta collection kit
US10391126B2 (en) 2011-11-18 2019-08-27 Board Of Regents, The University Of Texas System CAR+ T cells genetically modified to eliminate expression of T-cell receptor and/or HLA
BR102014010216B1 (pt) 2014-04-28 2020-05-05 Marchesan Implementos E Maqu Agricolas Tatu S A esteira alimentadora para uma colheitadeira de cana-de-açúcar
WO2016154628A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Xiuli Wang Bi-specific targeted chimeric antigen receptor t cells
CA2992989A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 City Of Hope T cells for expression of chimeric antigen receptors and other receptors
GB201709203D0 (en) 2017-06-09 2017-07-26 Autolus Ltd Antigen-binding domain

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106068276A (zh) * 2014-03-05 2016-11-02 Ucl商务股份有限公司 具有针对T细胞受体beta恒定区的抗原结合域的嵌合抗原受体(CAR)
WO2017117112A1 (en) * 2015-12-28 2017-07-06 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor -expressing cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAMES N KOCHENDERFER 等: "Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor" *
吴凤麟 等: "肿瘤特异性TCRαβ基因转染诱导记忆性T细胞分化及其免疫功能的研究" *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021509287A (ja) 2021-03-25
US11903967B2 (en) 2024-02-20
AU2019207949A1 (en) 2020-07-23
US20190209612A1 (en) 2019-07-11
GB201800298D0 (en) 2018-02-21
WO2019138217A1 (en) 2019-07-18
CA3023752A1 (en) 2019-07-09
EP3737741A1 (en) 2020-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11903967B2 (en) Method of preparing T cells with increased activity
Sivori et al. NK cells and ILCs in tumor immunotherapy
AU2018204208B2 (en) Method and compositions for cellular immunotherapy
ES2871349T3 (es) Expansión selectiva y controlada de células NK educadas
KR102447958B1 (ko) 입양 치료용 면역 세포 집단의 단리, 배양 및 유전자 조작 방법
US11266689B2 (en) NKT-cell subset for in vivo persistence and therapeutic activity and propagation of same
CA3090793A1 (en) Modified pluripotent stem cells and methods of making and use
JP7450892B2 (ja) Ｎｋ細胞のための人工ｈｌａ陽性フィーダー細胞株及びその使用
US20210147800A1 (en) Methods for producing regulatory immune cells and uses thereof
EP3786287A1 (en) Cd3-negative cell population expressing chemokine receptor and cell adhesion molecule, use thereof, and method for producing same
Grzywacz et al. Use of natural killer cells as immunotherapy for leukaemia
Cochlovius et al. Human melanoma therapy in the SCID mouse: In vivo targeting and reactivation of melanoma‐specific cytotoxic T cells by bi‐specific antibody fragments
WO2023227900A1 (en) Method
US20220233596A1 (en) Modified NK-92 cells, and therapeutic and diagnostic uses thereof
EP3342855B1 (en) Cell composition depleted from tcrab and cd45ra positive cells
US20100215629A1 (en) Treatment of tumors using t lymphocyte preparations
Recktenwald CELLS RELEASED FROM THE IMMUNOAFFINITY DEVICE: NO RESIDUAL MOUSE IMMUNOGLOBULIN
NZ726346B2 (en) Methods for isolating, culturing, and genetically engineering immune cell populations for adoptive therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200821

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication