CN101014712B - 细胞制备 - Google Patents

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Abstract

用遗传构建体转导细胞和筛选遗传修饰细胞的方法，该方法包括在封闭系统中进行转导和筛选。

Description

细胞制备
发明领域
本发明涉及在封闭系统中转导和筛选遗传修饰细胞的方法。
发明背景
目前，通常使用开放系统来转导和筛选遗传修饰细胞。然而，此类系统可能费时且可能与重大污染风险有关。当细胞将用于临床环境时及当需要高剂量时尤其如此。此类需求的例子是生产供体T细胞用于同种异体骨髓移植。
同种异体骨髓移植是治疗许多血液恶性肿瘤的选择(Thomas 1983，J Clin Oncol1：517；O′Reilly 1993，Curr Op In Hematol 221)。
在同种异体骨髓移植的情况中，普遍知道供体T淋巴细胞通常完全根除肿瘤的免疫学作用。衍生自供体T淋巴细胞的抗肿瘤作用(移植物抗白血病，GvL)使得该治疗方法优于常规化疗和自体移植。
此外，供体T淋巴细胞的灌注还能介导针对病毒和真菌的免疫反应的重建，这一点通过在未操作移植较之那些T淋巴细胞耗尽移植的情况中有较低的此类感染发生率和严重性而得到论证(Papadopoulos 1994，N Engl J Med 330：1185；Rooney1995，The Lancet 345：9；Heslop 1996，Nature Med 2：551；Rooney 1998，Blood 92：1549；Riddel 1992，Science 257；Walter 1995，N Engl J Med 333：1038)。
面对引入抗肿瘤作用的明确临床益处，供体T淋巴细胞的灌注仍伴随着移植物抗宿主病(GvHD)发展的风险升高。这是因为供体淋巴细胞产生针对宿主组织的凝集，特征在于死亡率和发病率升高，尤其是在接受来自相关半相合(haploidentical)供体的移植物的患者中(Kolb 1995，Blood 86：2041；Collins 1997，JClin Oncol 15：433；Porter 2000，Blood 95：1214)。
疾病的发生率和严重性与灌注淋巴细胞的数量成正比，即剂量越大，疾病越严重。因为临床益处在抗肿瘤和抗病毒活性方面与灌注剂量成正比，故增加剂量将提升抗肿瘤益处，但同时也提高了GvHD的风险。没有针对GvHD的特异治疗，而使用中的基于类固醇和其它免疫抑制剂的那些疗法是非特异性的且伴随着严重感染和疾病复发的发生率升高。
为了获得免疫学重建并在能选择性控制出现的GvHD的同时降低感染事件和疾病复发的发生率，一种有前景的策略是使用转导有含自杀基因和标志基因的逆转录病毒载体的供体淋巴细胞。自杀基因使遗传修饰细胞对稍后将用于在出现GvHD的情况中选择性消除灌注细胞的药物敏感。标志基因的存在允许跟踪遗传修饰细胞的存活、扩增和迁移部位。
例如，可使用SFCMM-3载体，它带有自杀基因HSV-tk和标志基因ΔLNGFR二者(Verzeletti 98，Human Gene Therapy 9：2243)。HSV-tk编码单纯疱疹病毒I的胸苷激酶(HSV-tk)，它一旦插入供体淋巴细胞，使它们对更昔洛韦(ganciclovir)选择性敏感。在施用于患者后，药物更昔洛韦被遗传修饰细胞表达的胸苷激酶磷酸化，接着被细胞激酶继续磷酸化。更昔洛韦的活性形式抑制基因组DNA的合成，从而引起胞死亡(Smee 1983，Antimicrobials Agents and Chemotherapy 4：504)。HSV-tk自杀系统早已在不同的临床研究中得到论证(Bordignon 1995，Hum Gene Ther 2：813；Bonini 1997，Science 276：1719；Tiberghien 1997，Hum Gene Ther 8：615；Tiberghien2001，Blood 97：63；Link 1998，Hum Gene Ther 9：115；Champlin 1999，Blood 94：1448)。
LNGFR基因编码神经生长因子(NGF)的低亲和力受体，它的胞内部分遭到删除以致其不能再传递信号(ΔLNGFR)(Mavilio 1994，Blood 83：1988)。使用单克隆抗体和磁珠，ΔLNGFR蛋白质的存在允许体外免疫筛选遗传修饰细胞。而且，ΔLNGFR蛋白质的表达可用作遗传修饰细胞的标志，一旦灌注到患者体内允许证明此类细胞的存在、扩增或减少，并用于表征它们的淋巴细胞亚型和激活状态方面。
上述临床研究(Bordignon 1995，Hum Gene Ther 2：813；Bonini 1997，Science 276：1719；Tiberghien 1997，Hum Gene Ther 8：615；Tiberghien 2001，Blood 97：63；Link1998，Hum Gene Ther 9：115；Champlin 1999，Blood 94：1448)依赖不同方法来生成遗传修饰淋巴细胞(终产品)。所述方法包括细胞解冻，激活，转导，筛选，扩增和回收终产品用于患者灌注。在患者灌注前测试的终产品的安全性与所述工序每个步骤的细胞操作有关。通常，这些方法在使用摇瓶进行细胞培养和使用层流操作台进行细胞操作诸如转导和筛选的开放系统中建立。目前，使用开放系统来生成转导T细胞用于临床方案。然而，这样的系统可能是费时的，而且可能与重大污染风险有关。
因此，需要一种安全有效的转导和筛选遗传修饰细胞的方法。
发明概述
通过提供在封闭系统中进行细胞操作和培养的方法，本发明克服了上文提到的问题。开放系统到封闭系统的转变，允许扩大产品的规模并提高产品临床使用的安全性。
在本发明的一个方面，提供了用遗传构建体转导细胞并筛选此类遗传修饰细胞的方法，该方法包括在封闭系统中进行转导和筛选。
在本发明的另一个方面，提供了修饰细胞的方法，包括：
(i)任选解冻所述细胞；
(ii)任选刺激所述细胞；
(iii)用遗传构建体转导所述细胞；
(iv)筛选转导细胞；以及
(v)扩增和收获所述转导细胞
其中步骤(i)至(v)在封闭系统中进行。
封闭系统是可防止细胞暴露于系统外环境的隔离系统。细胞仅暴露于构成封闭系统的袋、管和机械部件这些直接环境。
本发明的封闭系统可防止转导细胞的污染。它达到这一点是通过确保细胞与系统外部环境的密封隔绝，防止污染物进入系统。
优选的是，本发明的方法不包括人工转移流体。
优选的是，使用用于细胞操作的自动流体管理设备洗涤、浓缩和重悬细胞。
在一个实施方式中，所述遗传构建体是逆转录病毒载体。
优选的是，所述逆转录病毒载体是鼠白血病病毒(MLV)衍生载体。
优选的是，所述逆转录病毒载体编码能被特异抗体识别的细胞表面标志，诸如例如ΔLNGFR。
在一个实施方式中，所述细胞是供体T细胞。
优选的是，所述方法包括使用纤连蛋白或其变体的转导步骤。先前的研究表明，胞外基质分子的有些胰凝乳蛋白酶消化片段在感染过程中使用时可提高人造血祖细胞的转导(Moritz et al.，(1994)J.Clin.Invest.93，1451；Moritz et al.，(1996)Blood 88，855)。Takara已开发出人纤连蛋白的重组肽CH-296它由三个功能结构域组成(Hanenberg et al.，(1996)Nature Medicine 2，876)，且已证明增强逆转录病毒介导的基因转导(Kimizuka et al.，(1991)J. Biochem.～110，284)。在包被到皮氏培养皿、摇瓶或袋的表面上后，
Figure S05822964520070110D000041
显著增强进入哺乳动物细胞的逆转录病毒介导的基因转导。
优选的是，在本发明中使用
Figure S05822964520070110D000042
转导系统。
优选的是，本发明的方法包括转导细胞的免疫筛选。例如，用标志基因ΔLNGFR转导的细胞，可以根据它们与抗LNGFR抗体的反应性来筛选。
更优选的是，本发明的方法包括免疫磁性筛选。免疫磁性筛选涉及将抗体偶联到能够利用磁性分离抗原性结构的顺磁颗粒上。例如，可将表达ΔLNGFR细胞表面分子的转导细胞的遗传修饰亚群与结合ΔLNGFR阳性细胞的小鼠IgG抗NGF受体抗体一起温育。然后可将所述细胞与包被有绵羊抗小鼠IgG的免疫磁珠一起温育，并使用磁体来分离ΔLNGFR阳性细胞。可通过取走磁体来回收分离的细胞。
封闭系统可以包括执行获得分离的转导细胞所必需的所有步骤的单一设备。
可选的是，封闭系统可包括两种或多种设备。第一设备可用于细胞浓缩、细胞洗涤、转导及培养基更换步骤，而第二设备可执行转导细胞筛选。所述设备之间的细胞转移可使用密封袋和无菌连接来实现，以确保整个过程保持封闭过程。优选的是，使用用于细胞操作的自动流体管理设备洗涤、浓缩、转导和重悬细胞。所述设备可以在允许逐步用户自定义编程的完全封闭系统中包括转膜(spinningmembrane)，它确保细胞针对逆流缓冲液循环过滤且与不同袋连接。细胞洗涤和浓缩可以在一次性无菌装置中进行，该装置由与滤洗袋、缓冲袋及废弃袋连接的转膜组成。可由用户定义期望的洗涤流程。此类设备的实例是CytomateTM细胞处理系统。
前期处理的终产品可浓缩在袋中。然后可将该袋与第二管道装置无菌连接，以开始使用顺磁微球(珠)的筛选步骤。适用于该步骤的装置的实例是IsolexTM300磁性细胞分离系统。
图1所示工艺流程概括了依照本发明制备遗传修饰细胞可能需要的步骤。
根据临床研究，可以操作不同的生物学起始材料。可以省略一个或多个步骤。在一个实施方案中，暗区中的步骤可以省略。
本发明涉及在封闭系统中转导和筛选优选用于临床的遗传修饰细胞的方法。
具体而言，本发明可包括解冻(仅在冷冻细胞用作起始材料的情况中需要)、激活(是否需要基于细胞和载体特性)、转导和筛选(例如使用逆转录病毒载体)、扩增及收获用于临床的患者特异细胞的连续步骤。整个工序可在短时间内进行，例如少于两周。
封闭系统可以用于每一步骤，包括细胞洗涤、培养基更换、为转导和筛选进行的温育、以及最终收获用于将细胞灌注到患者体内。
在一个实施方案中，使用能够进行两类不同操作的一次性塑料材料和设备开发出的封闭系统确保了终产品的安全性：1)细胞浓缩/洗涤/培养基更换；2)磁性筛选。
具体而言，本发明可成功用于生产将用于同种异体骨髓移植临床方案的遗传修饰T细胞。
例如，可以使用以下设备：
1)CytoMateTM细胞处理系统(Nexell Therapeutic公司的商标)(Baxter，codeR4R9860)，用于临床级封闭式一次性试剂盒中的细胞操作(一次性细胞清洗装置，Baxter，code R4R9811)；
2)IsolexTM300磁性细胞分离系统，用于筛选转导细胞。
用于解冻后洗涤细胞的CytoMateTM细胞处理系统的实例及用于临床规模分离细胞的磁性细胞筛选器的实例分别在Calmels 2003，Bone Marrow Transplant 31：823和Suen 2001，Cytotherapy 3：365中有记载。
使用能在临床中心为简易操作细胞标准化的完全封闭系统，本发明在单一方法中集合了不同步骤：细胞的解冻、刺激、转导、筛选、扩增、以及回收终产物用于患者灌注。
本发明的优点包括在单一方法中组合了不同步骤，提高了终产品安全性，以及简化了细胞操作。
现在将通过非限制性实施例的方式并参考附图来描述本发明的更多优选特征和实施方案，其中：
附图简述
图1显示的工艺流程图概括了制备遗传修饰细胞可能需要的步骤。
图2显示了刺激和转导方法对细胞扩增的影响。通过在每个指定时间点对细胞计数并除以第0天接种的细胞数来评估扩增倍数。
图3显示了刺激和转导方法对转导效率的影响。通过流式细胞术评估了第6天的LNGFR阳性细胞百分率。
图4显示了珠∶细胞比率对细胞扩增的影响。通过在每个指定时间点对细胞计数并将存活细胞数除以第0天接种的细胞数来评估扩增倍数。
图5显示了珠∶细胞比率对转导效率的影响。通过流式细胞术评估了第6天的LNGFR阳性细胞百分率。
实施例1
解冻后从供体淋巴细胞洗去DMSO
本发明提供了使用临床级一次性封闭试剂盒中的细胞操作设备在完全封闭系统中进行细胞操作和培养的方法。
在本实施例中，使用CytoMateTM作为细胞操作的自动流体管理设备。它由在允许逐步用户自定义编程的完全封闭系统中确保细胞针对逆流缓冲液循环过滤且与不同袋连接的转膜组成。
细胞洗涤和浓缩在一次性无菌装置中进行，该装置由与滤洗袋、缓冲袋及废弃袋连接的转膜组成。该系统容许在GMP环境中进行细胞处理。由用户定义洗涤流程，将装有(待处理的)样品的袋与无菌装置连接，并通过四种重量标度和探测器监测由所述流程定义的不同袋之间的流体转移。
简单的菜单驱动界面容许为多达100个自定义流程编程。
洗涤效率通过在洗涤程序中设置“残留倍数减少”参数来定义。
用于生成上文定义的遗传修饰细胞的起始材料可以由新鲜或冷冻细胞(来自成分血(apheresis)、血沉棕黄层(buffy-coat)、全外周血、脐带血、骨髓)组成，在使用冷冻细胞时，将它们解冻，且为了刺激细胞以进行细胞培养而在解冻后洗去DMSO，即冷冻培养基的防冻成分(10％)。
将样品袋(一个或多个)与一次性装置(Baxter code R4R9811)的细胞源管道连接后，将细胞用冷的解冻缓冲液(X-Vivo 15，加有1％谷氨酰胺及600IU IL-2)稀释两次，第一次10ml，速率5ml/min，第二次20ml，速率10ml/min。在这些操作过程中，将解冻袋(一个或多个)铺放于冰层或冰袋上，并轻轻摇动以重悬细胞和避免细胞沉降。
然后用转膜洗涤和浓缩细胞，并转移至收集袋中；用130ml缓冲液漂洗来源袋、洗涤袋和管道，以使细胞损失降至最低。简单的说，使细胞悬浮液通过转膜，在那里细胞在膜外浓缩并从顶端出口排出，而含细胞碎片和DMSO的上清液通过膜从底端出口排出。
洗涤步骤的效率和时间长度取决于选择的参数“残留倍数减少”，它定义了洗涤的程度，即洗涤流程中初始流体移除的程度。该参数值可选择1-1000。根据CytoMateTM客户编程指南的Nexell数据，选择数值100；该值将导致来源溶液减少约2个对数(log)。终体积通常在100-250ml之间，这取决于两个可选择的参数：初始细胞数和最大洗涤袋终末重量，根据CytoMateTM客户编程指南的Nexell数据，选择数值250作为默认设置。
在洗涤流程结束时，可采集一份细胞样品并评估细胞存活率和细胞数；然后可根据细胞数以细胞培养所用培养基作为洗涤缓冲液稀释细胞悬浮液；该细胞准备好在培养基中以1×106/ml的浓度接受刺激。
包括最终细胞稀释在内的洗涤流程的时间长度为约1小时。
使用上文所述洗涤流程以单一洗涤步骤进行了两种不同实验。在这些实验中，评估了不同参数：初始和终末体积，以评估具有小体积细胞悬浮液的起始样品的洗涤可行性；初始和终末细胞数，以评估解冻和洗涤步骤中的细胞损失；整个流程的时间长度，以推测该流程与开放系统相比是否耗时较少；所用洗涤缓冲液体积，以评估试剂消耗。
在下文描述的实验中，起始材料是一袋来自健康供体血沉棕黄层的冷冻PBL。
起始材料的体积是15ml，但是可以在一个或多个袋中处理更大范围的细胞体积。
袋中的细胞数总计约1×109个，但是待处理细胞数的范围可以是一个或多个袋中装有的0.1×109-100×109之间。
根据使用CytoMateTM洗去DMSO的文献数据(Calmels B.et al.，Bone MarrowTransplant.2003May；31(9)：823-8)，来源溶液(含DMSO和细胞碎片)减少值选择2个对数(即“残留倍数减少”值100，由用户在洗涤程序中设定)，但是数值50早已足够清除超过96％的DMSO了。
表1显示了在使用来自不同供体血沉棕黄层的细胞的三个独立实验中获得的结果。
表1
  实验1   实验2   实验3
  初始体积   15ml   15ml   20ml
  终末体积   80ml   80ml   87ml
  初始存活细胞数   0.885×109   1×109*   0.97×109
  终末存活细胞数   0.880×109   0.850×109   0.883×109
  初始存活率   89％   86％   -
  终未存活率   91％   87％   100％
  细胞回收率   99％   85％   91％
  时间   1h   1h   1h
  解冻缓冲液   400ml   488ml   350ml
  终末细胞培养体积   880ml   850ml   883ml
存活率＝存活细胞数/总细胞数×100，该测试用锥虫蓝染色进行
回收率＝终末细胞数/初始细胞数×100
*＝细胞冷冻日评估细胞数
用于减少来源溶液的一种可选方法是设置二次洗涤的程序。每个程序由用户逐步自定义。
该流程遵循上文所述相同原理，但是增加了一个二次洗涤步骤。在这种情况中，流程的时间长度延长至1小时20分钟，且解冻缓冲液体积增加至1100ml。
使用增加了二次洗涤的流程进行了三个实验。
在这些实验中，评估了上文所述相同参数：初始体积(样品袋中细胞悬浮液的体积)和终末体积，以评估具有小体积细胞悬浮液的起始样品的洗涤可行性；初始和终末细胞数，以评估解冻和洗涤步骤中的细胞损失；整个流程的时间长度，以推测该流程与开放系统相比是否耗时较少；所用洗涤缓冲液体积，以评估试剂消耗。
在下文描述的实验中，起始材料在实验4中是一袋来自健康供体血沉棕黄层的冷冻PBL，而在实验5中是一袋来自健康供体成分血的冷冻PBL，但是该流程可应用于例如脐带血或骨髓样品。
起始材料的体积是20-100ml，但是待处理细胞体积的范围可以是一个或多个袋中装有的1ml-9999ml之间。
袋中的细胞数是约1×109个，但是待处理细胞数的范围可以是一个或多个袋中装有的0.1×109-100×109之间。
表2显示了使用来自不同供体血沉棕黄层或成分血的细胞的两个独立实验的结果。
表2
实验4 实验5
  初始体积   20ml   100ml*
  终末体积   233ml   295ml
  初始存活细胞数   1×109+  1.2×109+
  终末存活细胞数   0.932×109  1×109
  终末细胞存活率   88％  100％
  细胞回收率   93％  83％
  时间   1h 20’  1h20’
  解冻缓冲液   1100ml  1100ml
  终末细胞培养体积   932ml  1000ml
存活率＝存活细胞数/总细胞数×100，该测试用锥虫蓝染色进行
回收率＝终末细胞数/初始细胞数×100
*＝在该实验中，起始样品事先解冻，并在袋中用解冻缓冲液稀释至100ml
+＝细胞冷冻日评估细胞数
讨论
5个实验中有4个的样品初始体积在15-20ml之间的范围内，只有1个实验的起始样品用解冻缓冲液稀释至总体积100ml。
●这些实验的结果显示，初始体积对解冻后细胞的回收率和存活率没有重大影响。
前4个实验的平均细胞回收率确实是92％，标准偏差5.7％(范围：85-100％)，而第5个实验的数值83％接近该范围。
平均细胞存活率为91.5％，标准偏差5.9％(范围：87-100％)，而第5个实验的数值100％在该范围内。
实验表明，解冻步骤可以以小体积15-20ml及更高体积的起始样品起动进行。
●关于细胞损失，解冻后及用CytoMateTM洗涤细胞前进行了初始细胞数测试的实验1和3显示出最大细胞损失9％。
●在实验2、4、5中，将冷冻前的细胞数看作初始细胞数。这可能表示高估了真实初始数。即使在这种情况中，观察到最大细胞损失15％。
这些细胞损失数值与我们当前用开放系统获得的数据(数据未显示)以及使用CytoMateTM的文献中显示的数据(Calmels B.et al.，Bone MarrowTransplant.2003May；31(9)：823-8)没有显著差别。
●根据文献数据(Calmels B.et al.，Bone Marrow Transplant.2003May；31(9)：823-8)，考虑用设备进行单轮洗涤，整个流程(步骤包括：初始样品解冻，样品洗涤，以及样品稀释用于细胞培养)的时间长度是1小时，考虑二次细胞洗涤，则有20分钟的延迟。
这些数据与我们当前用开放系统获得的约1小时的数据也没有显著差别。
根据这些结果，在封闭系统中进行的解冻和洗涤工序与在开放系统中进行的工序相比并不费时，而且在封闭系统中处理的细胞的安全性可得到很好保持，因为细胞在解冻和洗涤操作中从初始袋至终末培养袋的转移是通过管道装置进行的，培养基是通过袋加入的，且用于细胞测试的样品是通过无菌注射器抽取的。不同袋之间的连接是使用确保无菌连接的无菌管道焊接物(welder)(SterileConnecting Device，Terumo)或使用插入袋口的长针进行的。
该系统避免了样品以及工序试剂与环境的接触。
实施例2
不同淋巴细胞刺激对袋或摇瓶中细胞生长的影响
为了评估封闭系统中的细胞生长，进行了以不同方式刺激淋巴细胞的几个实验：在存在重组IL-2的情况下，使用
Figure S05822964520070110D000101
(Orthoclone，Janssen-Cilag S.p.A.)或用
Figure S05822964520070110D000102
CD3/CD28T细胞扩增器(Dynal Biotech，code n°111.31)。其它刺激也可以考虑，例如用可溶性CD3/CD28抗体或用不同细胞因子混合物。
Figure S05822964520070110D000103
是针对CD3抗原的鼠单克隆抗体的临床用无菌溶液。
Figure S05822964520070110D000104
当前在基因疗法临床研究中用于诱导淋巴细胞增殖，以进行使用逆转录病毒载体的细胞转导。逆转录病毒载体事实上需要细胞增殖以在DNA复制期间自我整合到细胞基因组中。
Figure S05822964520070110D000105
CD3/CD28T细胞扩增器是包被有CD3和CD28抗体的超顺磁聚苯乙烯珠。CD3抗体对T细胞上的人CD3抗原是特异性的，就像而CD28抗体对T细胞上的人CD28共刺激抗原是特异性的。
模拟抗原呈递细胞的体内表现，用两种信号同时刺激T细胞，由此诱导T细胞扩增。
在下面的实验中(图2和图3所总结的)，在6个独立的实验中使用来自9个供体的PBL，以评估
Figure S05822964520070110D000108
刺激较珠刺激对细胞生长的影响。在开放系统中(OKT3旋转接种(spinoculation)样品)或在袋中(其它样品)的10天培养期间测定细胞扩增；每个点代表6-8个数据的平均值。
还评估了不同刺激对转导效率(转导后LNGFR阳性细胞百分率)的影响。
在OKT3旋转接种样品中，用旋转接种法在开放系统中进行转导，而在其它样品中，使用RetroNectin在封闭系统中进行转导。
这些转导方法和用于下文所述所有实验的逆转录病毒载体在实施例3和4中有详细说明。所述载体含有编码截短形式人低亲和力NGF受体的细胞表面标志基因，它容许通过细胞荧光测定分析测试细胞表面上的ΔLNGFR表达来评估转导效率。
图2只显示了初步的细胞增殖结果：比较所有样品直到第6天，只有CD3较3∶1珠比较到第10天。
在这个最后步骤中，几种样品之间的增殖差别更明显。
图3与图2有关，对相同样品测试转导效率，比较开放系统与封闭系统。
由图2的几个实验总结得出的结果证明，在开放系统中用OKT3刺激的细胞比在封闭系统中刺激的细胞有更高的增殖潜力。但是使用CD3/CD28珠获得的刺激增加封闭系统中的细胞生长。细胞增殖的这些差别在细胞培养第6天和第10天之间更明显，而直到第6天，即转导步骤后两天或三天，细胞增殖在所有样品中都非常相似。
在相同实验中，在用不同方法刺激的淋巴细胞转导后，评估了转导效率，如图3所示。结果非常有趣，在封闭系统中用CD3/CD28刺激并用RetroNectin转导比用OKT3进行的其它刺激及或是转瓶培养转导法或是RetroNectin法导致更高的转导效率(LNGFR阳性细胞百分率)。
与开放系统相比，这对封闭系统的效率非常重要，因为尽管增殖少但由于获得较高转导效率，封闭系统的遗传修饰细胞的最终数目仍然较高。
这些初步结果得到了其它实验的证实，代表性的如图3和图4所示。
图4显示了有代表性的细胞增殖实验，它强调了在封闭系统中用OKT3和用两种不同珠∶细胞比率刺激的样品之间的差别。
与之对照的是，图5显示了在相同实验中用旋转接种和RetroNectin获得的转导效率，比较了用OKT3和珠刺激获得的数据。
该结果证实了由图3所总结的实验获得的初步数据，其中使用RetroNectin的转导效率比使用旋转接种高。
图4证实了CD3/CD28刺激与OKT3刺激相比增加封闭系统中的细胞增殖；以及珠∶细胞比率对细胞生长非常重要，即似乎需要至少每个细胞2粒珠。DynalBiotech建议的比率3∶1可能能进一步增加增殖速率。
相反(图5)，该珠：细胞比率不影响转导效率。在比率2：1和1：1，转导后LNGFR阳性细胞的百分率都比OKT3刺激获得的百分率高，证实了在封闭系统中使用RetroNectin进行的转导步骤后的转导效率用CD3/CD28刺激较高。
这些数据表明，为了确保产品的安全性，在封闭系统中生成遗传修饰细胞是非常重要的，而且它也可以是一个非常高效的系统。
实施例3
细饱转导载体
导致用于基因疗法的遗传修饰细胞生成的所有实验都使用逆转录病毒载体进行。
本发明可用于逆转录病毒载体转导的细胞，其中解冻、洗涤、转导、筛选、扩增及最后回收的所有生产步骤可在完全封闭系统中进行，但是它也适用于其它方案，其中只使用了这些步骤中的一些或步骤的顺序改变或颠倒，或是使用不同载体，像慢病毒或腺病毒载体。
为下面的实验选择的逆转录病毒载体是sFCMM-3(Verzeletfi et al．HSV-TKgene transfer for controlled GvHD and GvL：clinical follow-up and improved Flew vectors．Httnnan Gene Therapy,1998)。
△LNGFR基因的转录受早期SV40启动子调节。
该载体可用于生成自杀基因HSV-tk工程化淋巴细胞，用于前述同种异体骨髓移植背景中的临床研究。
可获得关于在开放系统中生成工程化淋巴细胞的工序的许多资料。使用这种背景来比较开放系统与本发明的新封闭系统。
转导方法白勺转换，生产工艺从开放系统变成封闭系统
在生成遗传修饰细胞的临床研究以及我们的开放系统方法中使用旋转接种法进行开放系统中使用逆转录病毒载体的转导步骤。
在本方法中，在通常用OKT3刺激2或3天后在层流箱中用培养瓶回收细胞，例如口淋巴细胞。
在管中用一轮离心洗去培养基，并将细胞悬浮于逆转录病毒上清液培养基中，根据病毒滴度，浓度为1-5x106细胞/ml逆转录病毒上清液。
将细胞置于塑料容器中进行细胞培养，并以1000-1200g离心1-2小时。然后在管中通过细胞离心洗去逆转录病毒上清液。
将细胞沉淀物悬浮于培养基中，并将处理后的细胞置于摇瓶中并培养。通常，在培养24小时后进行第二轮转导。
48小时后，用细胞荧光测定分析对细胞测试ΔLNGFR表达。
在封闭系统中生成遗传修饰细胞的本发明中，改变了转导步骤从而在袋中进行细胞洗涤及转导。
该方法(在实施例4中有详细说明)使用分子(Takara)，重组人纤连蛋白片段，以通过靶细胞和病毒体的共定位来增强逆转录病毒介导的基因转导。在
Figure S05822964520070110D000132
包被的袋中将细胞与逆转录病毒上清液一起培养12-24小时，容许在封闭系统中进行细胞转导。
在几个实验中用OKT3刺激淋巴细胞后，将该转导方法与旋转接种法进行比较，早已总结在实施例2、图3中。
在下面的表3中，总结了两种不同转导方法的特点。
表3：在6个独立实验中使用来自9个供体的PBL
Figure S05822964520070110D000133
使用RetroNectin转导法的优点在于：流向封闭的、更安全的系统，转导轮数从2次减至1次，消除了可能有危险的离心步骤，以及提高了转导效率。
安全性考虑以及改进的效率结果引导我们在封闭系统生产工序的开发中使用
Figure S05822964520070110D000134
转导法。
实施例4
淋巴细胞转导
细胞刺激后的第2步是细胞转导。
在下面的实验中，在使用OKT3(Orthoclone)(但是如前文所述，可使用不同的刺激方案)的刺激步骤后进行淋巴细胞转导，将细胞在
Figure S05822964520070110D000135
(Takara)预包被的袋中与逆转录病毒上清液(载体是上文描述的含有目的基因和细胞表面标志基因的SFCMM-3)一起培养24小时。
Figure S05822964520070110D000136
是重组人纤连蛋白片段，它通过靶细胞和病毒体的共定位而增强逆转录病毒介导的基因转导。
转导通常在刺激后0-7天的范围内进行。在下述实验中，转导在第2天进行。
使用
Figure S05822964520070110D000137
的转导工序牵涉不同步骤：制备
Figure S05822964520070110D000138
包被袋，制备靶细胞，将逆转录病毒载体加载到
Figure S05822964520070110D000141
预包被袋中，将细胞在预加载袋中温育。
将冻干粉溶于无菌注射用水，将合适体积的该溶液分配到各个袋(CellGenix Vuelife袋或Baxter x fold袋)中，并于室温(RT)避光温育2小时。所用
Figure S05822964520070110D000143
浓度通常在1-8μg/cm2袋表面积的范围内。在这些实验中使用1.2μg/cm2。
除去
Figure S05822964520070110D000144
液后，将PBS 2％人血清清蛋白(HSA)的无菌溶液加至各个袋中进行封闭。需要室温温育30分钟，然后通过用PBS洗涤三次以除去HSA溶液。这些袋可直接使用，在4℃或-80℃保存可长达一周。
然后在37℃温育1小时期间，将逆转录病毒上清液预加载到袋中的
Figure S05822964520070110D000145
上。
将用于细胞转导的逆转录病毒上清液的体积与细胞数目有关，而且细胞数目与上清液体积之间的比率可在0.5×106细胞/ml-10×106细胞/ml的范围内。
上清液添加有IL-2(范围：100-600IU/ml)、2mM谷氨酰胺及3％自体血浆。
在这些实验中，使用的比率是1×106细胞/ml逆转录病毒上清液。关于预加载步骤，所用上清液的范围在0到计划总体积之间。在这些实验中，用于预加载步骤的上清液是计划的一半。
恰在感染前收集细胞，然后悬浮于剩余体积的上清液中，如上所述添加试剂。如上所述，所用最终比率是1×106细胞/ml逆转录病毒上清液。
袋中的细胞温育进行24小时，但是可以在例如1-72小时的范围内。
在转导与基因表达之间通常有24-48小时的延迟，在该步骤中事实上尚未检测到ΔLNGFR蛋白质。
表3所示数据总结了转导工序后48小时测试的转导效率的结果。使用CytoMateTM的转导
正如实施例1中详细描述的，本发明的一个方面提供了使用临床级一次性封闭试剂盒中的细胞操作设备在完全封闭系统中进行细胞操作和培养的方法。
在本实施例中，为了恰在感染前收集细胞，使用CytoMateTM作为自动流体管理设备。
根据上述方案，在转导前，将一个或多个袋用
Figure S05822964520070110D000146
预包被，并用计划逆转录病毒上清液体积的一半预加载。
OKT3刺激后第2天，使用CytoMate收集培养淋巴细胞袋(一个或多个)，并在最终预加载袋(一个或多个)中用计划上清液体积的一半悬浮。所用最终比率是1×106细胞/ml逆转录病毒上清液。
袋中的细胞温育进行24小时。
细胞洗涤及浓缩像细胞解冻一样在一次性无菌装置中进行，该装置由与滤洗袋、缓冲袋及废弃袋相连的转膜组成。装有培养淋巴细胞的样品袋及装有预加载上清液的终末袋都与该装置无菌连接。该系统容许在GMP环境中进行细胞处理。
由用户定义洗涤流程，且在遗传修饰细胞的生产工序的不同步骤中是不同的。
简单的说，使用转膜将细胞用冷的缓冲液(X-Vivo 15，加有1％谷氨酰胺及600IU/ml IL-2)洗涤2轮，并转移至收集袋，即洗涤袋。然后将细胞以约40ml的小体积转移至终末袋，用计划上清液的一半漂洗洗涤袋及管道以减少细胞损失。将该上清液转移至终末袋，并将细胞稀释至1×106细胞/ml逆转录病毒上清液。
将终末袋中的逆转录病毒上清液用40ml洗涤缓冲液稀释，这取决于不同的定义参数，但是该稀释不降低逆转录病毒上清液的转导效率(数据未显示)。
洗涤步骤的效率和时间长度取决于选择的参数“残留倍数减少”。根据Nexell数据(CytoMateTM客户编程指南)，选择数值50。数值100将导致来源溶液减少约2个对数。
在洗涤流程结束时，可对一份细胞样品评估存活细胞数，并将细胞最后在温箱中于37℃5％CO2温育24小时。上清液是感染性逆转录病毒颗粒重悬于X-VIVO15即细胞培养基的试剂。如上所述，在转导前与1％谷氨酰胺、600IU/ml IL-2、3％自体血清及鱼精蛋白一起添加上清液。该培养环境容许细胞在24小时温育期与逆转录病毒颗粒一起培养。
包括稀释在内的洗涤流程的长度达到1小时。
使用上文所述洗涤流程进行了三个不同实验。在这些实验中，评估了不同步骤：初始体积(样品袋中细胞悬浮液的体积)和终末体积；初始细胞数，以评估要使用的上清液体积(1×106细胞/ml上清液)，终末细胞数，以评估终末比率“细胞∶上清液”；整个流程的时间长度，以推测该流程与开放系统相比是否耗时较少；所用洗涤缓冲液体积，以评估试剂消耗。
表4总结了使用CytoMateTM进行的三个洗涤实验的数据。
表4
  实验1   实验2   实验3
  初始样品体积   736ml   847ml   997ml
  初始细胞数   0.118×109   0.186×109   0.498×109
  计划上清液   118ml   186ml   498ml
  终末样品体积   158ml   226ml   556ml
  终末细胞悬浮液；细胞浓度   0.75×106/ml   0.9×106/ml   0.9×106/ml
  耗时   40min   40min   1h 41min
  洗涤缓冲液体积   750ml   500ml   1000ml
在以1×106/ml的浓度培养细胞时，初始样品体积取决于刺激当天的细胞数。细胞数取决于刺激和使用OKT3，细胞数通常会在刺激后两天内减少。知道了细胞数，要用的上清液体积就可以用比率1×106细胞/ml上清液来确定。细胞悬浮液的终末体积是洗涤后的悬浮液体积(约40ml洗涤缓冲液，X-Vivo 15)加上添加的上清液体积的结果。在这方面，最终的上清液稀释至最多0.33倍。该稀释不降低上清液的转导效率。将细胞在转导步骤中浓缩至0.75-0.9×106/ml的范围内，而该浓度容许基因较好的转移到细胞中，如下一段所述。
使用CytoMateTM的流程非常短。只有在实验3中超过1小时。在封闭系统中使用该RetroNectin方案容许转导轮数减少至1，而在使用旋转接种的开放系统中是2轮，花费2小时。
根据这些数据，为了制备用于转导的细胞悬浮液在封闭系统中进行的洗涤工序是迅速的，而且处理细胞的安全性得到很好保持。这是因为细胞在洗涤操作过程中从初始袋至终末RetroNectin预加载袋的转移是通过管道装置进行的，上清液是通过袋加入的，且用于细胞测试的样品是通过无菌注射器抽取的(细胞计数)。因此，该系统避免了样品及工序试剂与环境的接触。这与使用在A级层流箱中在摇瓶中操作细胞的旋转接种的转导流程形成了对照。
实施例5
转导后的淋巴细胞培养
与逆转录病毒上清液一起温育24小时后，收获细胞并悬浮于用于细胞培养的袋(一个或多个)中的培养基。该培养基与用于刺激的相同：X-Vivo 15，加有3％自体血清、1％谷氨酰胺及IL-2(范围：100-600IU/ml)。
在本实施例中，使用CytoMateTM作为自动流体管理设备，以在封闭系统中操作细胞。在该步中，细胞用X-Vivo 15洗涤，悬浮于培养基，并弃去逆转录病毒上清液。
现在，一部分培养细胞受到实施例3中所述逆转录病毒载体的遗传修饰，该载体包含目的基因和标志基因，即截短形式的NGF受体(ΔLNGFR)。培养数天后，在该方案中是两天，对细胞群测试ΔLNGFR表达。编码ΔLNGFR的基因在淋巴细胞中没有内源性表达，而仅在转导细胞中表达，且可使用偶联有荧光染料的抗LNGFR抗体通过FACS(荧光激活细胞分选仪)分析在细胞表面上检测到。
简而言之，缀合有荧光染料的细胞通过激光束。它们中断并散射激光，作为前散射和侧散射光检测到。第一个参数涉及细胞大小，而第二个是细胞内部复杂性的指标。除了散射，细胞计数器测量荧光参数。荧光染料吸收激光，并在光谱不同区域发射出该吸收光的一部分。细胞计数器测量各个细胞上每种染料的相对量，加工源自每个细胞的电子信号，并产生每个参数的数值。然后它将信息传输至计算机系统用于显示和分析。荧光强度与细胞表面结合的缀合有荧光染料的抗体的数量成正比。
用CytoMateTM洗去逆转录病毒上清液
在该步中，如实施例4所述，在一次性无菌装置中进行细胞洗涤和浓缩，该装置由与滤洗袋、缓冲袋及废弃袋相连的转膜组成。含转导淋巴细胞的样品袋及用于细胞培养的终末袋与该装置无菌连接。如前所述，该系统容许在GMP环境中进行细胞处理。
洗涤过程由用户定义且与实施例4中所述相同。使用转膜将细胞用缓冲液(X-Vivo 15，加上1％谷氨酰胺及IL-2，范围：100-600IU/ml)洗涤2轮，并转移至收集袋，即洗涤袋，然后将细胞以计划体积转移至终末袋，用固定体积的缓冲液漂洗洗涤袋和管道以使细胞损失降至最低。
然后根据终末细胞数稀释终末袋中的细胞悬浮液，从而以0.2-0.5×106细胞/ml培养基的浓度培养细胞。加入总体积3％的自体血清。
洗涤步骤的效率和时间长短取决于选择的参数“残留倍数减少”。根据CytoMateTM客户编程指南的Nexell数据，选择数值50。数值100将导致来源溶液减少约2个对数。
包括最后稀释在内的洗涤流程的长度约为1小时。
使用上文所述洗涤流程进行了三个独立实验。在这些实验中，考虑了以下参数：初始体积、初始细胞数、整个流程的时间长度以及所用洗涤缓冲液体积以评估试剂消耗。在一个实验中，评估终末细胞数以测试洗涤步骤中的细胞损失。
表5总结了使用CytoMateTM进行的三个洗涤实验的数据。
表5
  实验1   实验2   实验3
  初始样品体积   158ml   225ml   556ml
  初始细胞数   0.24×109   0.225×109   0.445×109
  终末细胞数   -   0.225×109   -
  耗时   40min   40min   37min
  洗涤缓冲液体积   750ml   800ml   1500ml
在以1×106/ml在逆转录病毒上清液中培养细胞时，初始样品体积取决于转导当天的细胞数。根据初始细胞数，要用的培养基体积可以用比率0.5×106细胞/ml培养基来确定。
使用CytoMateTM的流程非常短，这一点在实施例4中也有描述。
使用开放系统时，应当离心细胞以弃去上清液，并在层流箱中必须在用于细胞培养的摇瓶中用培养基稀释。这步引起对细胞的医学压力(physic stress)和操作困难，因为要操作的体积可能非常大。例如在实施例3中，必须除去556ml逆转录病毒上清液，且必须分配1100ml培养基到许多摇瓶中。这些操作提高了产品污染的风险。
这些操作在开放系统中所用的时间，根据我们的数据是约1小时30分钟。
根据该数据，为了制备用于细胞培养的细胞悬浮液在封闭系统中进行的洗涤工序比在开放系统中进行的洗涤工序耗时较少；使用封闭系统处理的细胞的安全性得到很好保持，因为细胞在洗涤操作中从初始袋至终末培养袋的转移是通过管道装置进行的，培养基是通过袋加入的，且用于细胞测试的样品是用无菌注射器抽取的(细胞计数)。
该系统避免了样品及工序试剂与环境的接触，并消除了可影响细胞存活率的离心压力。
实施例6
如前述实施例所述，在转导步骤后的两天培养期间，遗传修饰亚群表达ΔLNGFR细胞表面分子。该分子容许用磁珠系统筛选遗传修饰亚群。
将细胞悬浮液与GMP级小鼠IgG抗NGF受体抗体一起温育，该抗体结合ΔLNGFR阳性细胞，即遗传修饰亚群。两个洗涤步骤后，与包被有绵羊抗小鼠IgG的GMP级免疫磁珠(Baxter，code RAR 9950)一起进行二次温育。
现在，将珠处理细胞悬浮液应用于磁体以分离珠包被的ΔLNGFR阳性细胞。用足够的缓冲液(PBS 0.1％HSA)洗去磁体未俘获的阴性群。
然后通过取走磁体在培养基中回收阳性细胞。培养24小时后，抗原与抗体之间的结合遭到破坏。珠释放到培养基中，并使用磁体除去。在应用磁体的过程中，珠结合磁体，而磁体未俘获的细胞群用足够的缓冲液(PBS 0.1％HSA)洗去。
将回收细胞群，即同质遗传修饰群，培养几天，在1-7天的范围内，并在最小48小时后测试细胞增殖和ΔLNGFR表达。
如关于转导步骤所述，在ΔLNGFR分子下调后，编码ΔLNGFR分子的基因需要24-48小时在细胞表面进行分子表达。
用于测试ΔLNGFR表达的细胞荧光测定分析在前述实施例中有描述。
使用CytoMateTM进行的抗体温育和细胞洗涤
本发明使用CytoMateTM以在封闭系统中进行以下步骤：洗去培养基及将细胞浓缩，将细胞悬浮液与抗NGF受体抗体一起温育，洗去过量的抗体，并浓缩细胞以进行珠温育。
洗涤和浓缩如实施例4所述在一次性无菌装置中进行，该装置由与滤洗袋连接的转膜组成。缓冲袋和废弃袋也与该装置连接。用于温育步骤的缓冲液是PBS0.5％HSA，用于洗涤步骤的缓冲液是PBS 0.1％HSA。
装有悬浮在培养基中的转导细胞的样品袋以及用于细胞回收的终末袋都与该装置无菌连接。在洗涤前对细胞测试细胞数以计划筛选操作。
如先前所讨论的，本系统容许在GMP环境中进行细胞处理。使用转膜用计划好的1轮洗涤在洗涤袋中浓缩细胞，使用先前描述的用于洗去培养基的缓冲液。
将计划抗体微克数(1μg/5×106细胞)的抗体溶液加到洗涤袋中。先前计划的在洗涤步骤之后的“循环洗涤袋”步骤，通过洗涤通道在洗涤袋中循环细胞悬浮液。根据用户设定的程序，该操作将细胞悬浮液与抗体溶液混合20分钟。
温育时间后，用第二轮洗涤洗去过量的未结合抗体，然后将细胞以计划体积转移至终末袋中，用固定体积的缓冲液漂洗洗涤袋和管道以降低细胞损失。
袋中收集的结合有抗体的细胞悬浮液，现在准备好使用装备有磁体的不同设备与珠一起温育。
洗涤步骤的效率和长度取决于选择的参数“残留倍数减少”。根据Nexell数据，选择数值50。数值100将导致来源溶液减少约2个对数。
细胞洗涤及细胞与抗体一起温育的整个流程的时间长度达到1小时30分钟。
使用刚刚描述的流程进行了三个不同实验。在这些实验中，考虑了以下参数：细胞悬浮液的初始体积(样品袋中细胞悬浮液的体积)、终末体积，以用于在后续温育步骤中浓缩细胞；初始细胞数，以计划筛选流程的试剂；整个流程的时间长度，以推测该流程与开放系统相比是否耗时较少；以及所用洗涤缓冲液体积，以评估试剂消耗。在一个实验中，测试了终末细胞数和存活率以评估该流程中的细胞损失。
表6总结了使用CytoMateTM进行的三个实验的数据。
表6
  实验1   实验2   实验3
  初始体积   1060ml   450ml   984ml
  终末体积   25ml   60ml   76ml
  初始细胞数   2,120×109   0.810×109   1.13×109
  终末细胞数   1,872×109    -   -
  时间   1h 45min   1h 15min   1h 30min
  洗涤缓冲液体积   1400ml   1000ml   1000ml
在培养基中以0.5×106/ml培养细胞时，初始样品体积取决于转导步骤后的细胞数(参见实施例5)。
必须检测细胞悬浮液的终末体积，以浓缩细胞用于与珠一起温育的后续步骤。
有了初始细胞数，就能计算要用的温育缓冲液体积(用于制备抗体溶液，20×106细胞/ml缓冲液)和抗体微克数(1μg/5×106细胞)。
在一个实验中测试了终末细胞数和细胞悬浮液存活率，以评估该流程中的细胞损失。存活率为100％，表示该流程对细胞不产生压力。
在实验1中，细胞回收率为88％，表明CytoMateTM流程后有少量细胞损失，这可通过改变程序来减少，例如缩短洗涤步骤。
使用CytoMateTM的流程不费时，约为1小时30分钟。在这段时间进行了许多操作：2次洗涤及20分钟温育。根据我们的经验，这些操作在开放系统中所用时间约为2小时。
根据这些数据，为了使细胞悬浮液与抗体结合及使细胞准备好磁性筛选而在封闭系统中进行的洗涤、浓缩和温育工序与在开放系统中进行的相同工序相比耗时较少，而且在封闭系统中处理的细胞的安全性得到很好保持，因为细胞操作是用管道装置进行的，试剂是通过袋加入的，而用于细胞测试的样品是用无菌注射器抽取的(细胞计数)。
该系统避免了样品及工序试剂与环境的接触，并消除了可能影响细胞存活率的离心压力。
免疫磁性筛选
现在在袋中浓缩前述工序的终产品，即敏化细胞(与抗NGF受体一起温育过的)。该袋与第二管道装置无菌连接，以起动使用顺磁微球(珠)和装备有磁体的设备(磁性细胞分离器)的筛选步骤。无菌、非热原一次性装置由150ml通风圆筒槽构成。该槽在底部通过Y连接器与两个管道系统永久连接：输入管和输出管。这两条管道都有两个长钉连接，用于将装有细胞悬浮液(样品袋)和工作缓冲液的袋通过输入管与槽相连，以及用于将终末细胞收集袋和废弃袋通过输出管与槽相连。
在下文描述的实验中，所用磁性分离器是Baxter International Inc.设计的IsolexTM 300，它利用抗CD34单克隆抗体和顺磁微球，从异质细胞群筛选和分离CD34+细胞。
在IsolexTM 300标准方案中，在开放系统中用抗CD34单克隆抗体使细胞敏化，然后用管道装置将细胞与珠混合，磁性分离CD34+细胞并洗去未结合的阴性细胞。最后，使用对一抗具有高亲和力的肽分子从珠上释放CD34+细胞。抗体/肽复合物可磁性保留在分离槽内，而CD34+细胞释放到收集袋中。
只是为了我们的目的，遵循该工序用于将敏化细胞(与抗NGF受体一起温育过的)与珠(Baxter，如上文所详述的)混合及用于磁性分离玫瑰形(rosetted)ΔLNGFR阳性细胞。通过三轮洗涤将非玫瑰形(unrosetted)阴性细胞从分离槽洗至废弃袋。
简而言之，输入管的两个袋与输出管的两个袋使用确保无菌连接的无菌管道焊接物(Terumo)或者使用插入袋口的管道长针而无菌连接。该系统避免了样品及工序试剂与环境的接触。连接后，固定的装置程序以如下步骤顺序起动：用洗涤缓冲液填充管道，在槽中混合敏化细胞与珠，温育前加到初始细胞袋中，磁性分离玫瑰形物(rosette)，洗去残余的珠及阴性细胞。
洗涤缓冲液是PBS 0.1％HSA。根据初始细胞NGF阳性数，以珠∶NGF阳性细胞比率5∶1加入珠。在筛选前以少量细胞悬浮液检测NGF阳性细胞数，通过FACS分析对细胞计数并测试NGF阳性细胞百分率，正如上文实施例5中所描述的。
体积不超过100ml--90ml起始溶液和10ml预洗涤计划珠。可用该设备处理最多10×109个敏化细胞。混合物于室温的温育时间为30分钟。
混合后，玫瑰形NGF+细胞被磁铁保留在主槽壁中。非玫瑰形细胞洗到废弃袋中，然后将NGF+细胞用缓冲液洗涤三次以除去残留的非玫瑰形细胞。将用于洗涤的工作缓冲液与非玫瑰形细胞收集在一起，最后可对该细胞悬浮液计数以控制筛选流程有良好的结果。
使用上文所述流程进行了两个不同实验。在这些实验中，测定了下列参数：细胞悬浮液的初始体积(管道装置槽中细胞悬浮液的体积)、终末体积，以浓缩ΔLNGFR+细胞用于免疫磁性分离后的培养；通过FACS分析测试NGF+细胞百分率；总ΔLNGFR+细胞数，源自初始细胞数(CytoMateTM洗涤前检测)及ΔLNGFR+细胞百分率；整个工序的时间长度，以推测该工序与开放系统相比是否耗时较少；悬浮在废弃袋中的细胞数；以及所用洗涤缓冲液体积，以评估试剂消耗。
表7总结了使用IsolexTM 300进行的两个实验的数据。
表7
  实验1   实验2
  初始体积   130ml   100ml
  终末体积   80ml   130ml
  NGF阳性细胞百分率   20％   23％
  初始细胞数   0.810×109   1.13×109
  总NGF阳性细胞数   0.162×109   0.260×109
  废弃袋中的终末细胞数   -   0.720×109
  耗时   1h 30min   1h 30min
  洗涤缓冲液体积   500ml   500ml
讨论
初始样品体积取决于使用CytoMateTM进行的洗涤和敏化步骤，洗涤液约80ml加上添加的预洗涤珠体积，总体积约为100ml。体积不应超过130ml，因为管道装置槽的体积为150ml。需要20ml剩余体积以充分混合细胞和珠。
根据总LNGFR阳性细胞数确定细胞悬浮液终末体积。细胞悬浮液体积是细胞培养物的体积，并以2×106个LNGFR阳性细胞/ml培养基的浓度铺涂细胞。洗涤玫瑰形细胞后，用确保无菌连接的无菌管道焊接物(Terumo)无菌连接装有计划体积培养基的袋。
LNGFR+细胞百分率与转导步骤有关，且取决于不同因素，包括：细胞刺激、转导方法、用于转导的上清液的病毒滴度、及转导轮数。
LNGFR阳性细胞百分率高是非常重要的，因为它提高最终遗传修饰细胞的回收率及整个流程的效率。
与初始细胞数及LNGFR阳性细胞百分率有关的总LNGFR阳性细胞数，对准备筛选试剂、要用的珠和工作缓冲液的数量、以及评估筛选后的细胞回收率(即筛选步骤的效率)都是重要的。当ΔLNGFR分子的下调将珠释放到培养基中时，在筛选的下一天评估细胞回收率。使用锥虫蓝染色对细胞测试细胞数。这些结果显示在表8中，正如实施例8所广泛讨论的，在开放系统获得的回收率结果平均值的范围内。
在两个实验之一中对最终的细胞悬浮液计数，以评估筛选流程的结果。该流程了损失了低于10％的总细胞数。
该筛选流程与开放筛选法相比并不费时，后者必须将细胞悬浮液分成至少3管且必须对每管施加磁体。还有，必须在几个管中对玫瑰形细胞进行接下来的洗涤步骤，并对每管施加磁体，这是费时的。此外，在层流箱中操作几个管与在管道装置中操作细胞相比有高污染风险。
免疫磁性微球脱离
Figure S05822964520070110D000231
(Baxter)M-450绵羊抗小鼠IgG是表面共价结合有亲和纯化的绵羊抗小鼠IgG的顺磁性聚苯乙烯珠。无菌、非热原悬浮液仅供回体(ex vivo)使用。为此，必须从细胞悬浮液中除去该珠。如上所述，筛选后那天，玫瑰形细胞将珠释放到培养基中。然后用磁性细胞分离系统处理细胞悬浮液，以从细胞培养物中除去珠。
如先前部分所述，使用带有槽室的管道装置。
简而言之，输入管的两个袋和输出管的两个袋用确保无菌连接的无菌管道焊接物(Terumo)或者用插入袋口的管道长针而无菌连接。输入管的连接袋是：缓冲袋(缓冲液是培养用培养基)和细胞悬浮液袋。输出管的连接袋是：用于细胞回收的终末细胞悬浮液袋和废弃袋。
连接后，按如下步骤顺序起动固定的装置程序：用洗涤缓冲液填充管道，在槽中混合敏化细胞与珠，温育前加到初始细胞袋中，磁性分离玫瑰形物，洗去残余的珠和阴性细胞。
洗涤装置仅用于我们的目的：用磁体将珠保留在槽壁上，而将细胞收集到终末袋中。
使用上文所述方法进行了两个不同实验。这些实验的细胞筛选步骤如上面的部分所述。
在这些实验中，评估了细胞回收率以比较在封闭系统中进行的本发明的筛选和脱离与在开放系统中进行的筛选和脱离。
表8总结了使用IsolexTM300进行的珠脱离后的细胞回收。
表8
  实验1   实验2
  筛选前的总NGF阳性细胞数   0.162×109   0.260×109
  筛选后的总NGF阳性细胞数   0.124×109   0.173×109
  细胞回收率   77％   66％
正如实施例8所广泛讨论的，封闭系统中进行筛选和脱离的实验1和实验2的细胞回收结果在开放系统中进行筛选和脱离所获得的结果的平均值内。
实施例7
筛选后的淋巴细胞培养
珠脱离后，将细胞培养24小时。使用锥虫蓝染色对细胞计数，并通过FACS分析评估ΔLNGFR表达，以测试筛选群的均一性。
然后将袋中培养的细胞在培养基中以0.2-1×106细胞/ml的浓度范围稀释，使用确保各袋之间无菌连接的无菌管道焊接物(Terumo)添加培养基。
通常，ΔLNGFR分子已经在超过90％的群中表达。然而，根据细胞增殖速率，可能并非所有细胞此时表达细胞表面分子，导致非均一群。在任何情况中，在患者灌注或细胞冷冻之前培养的最后一天，重复相同的细胞荧光测定分析，以确认细胞群受到完全的遗传修饰。
筛选后的培养天数在0-6天范围内，这取决于计划在临床研究中对每位患者灌注的细胞数；将细胞群的小样用于质量控制分析，包括无菌测试。
根据欧洲药典(EP)，测试了产品的小样；小样的体积取决于产品的总体积。从统计学考虑，可以假设，如果该小样在无菌测试中没有发生细菌生长，那么可以认为整个产品是无菌的。
然而，不能绝对排除终产品中污染物以极低负荷存在。该风险可通过使用细胞培养系统诸如本发明而降至最低，本发明的主要优点是在完全封闭的系统中操作细胞。
在本例中，终产品的安全性由系统本身保证，因为在每一个生产步骤中，细胞从未接触环境。
总是在无菌管道装置中操作细胞，用无菌袋中制备的试剂处理细胞；因此，无菌环境很容易保证。
使用CytoMate洗涤和回收终产品
在该步中，回收、洗涤终产品以清除培养基，然后浓缩到50-60ml的终体积以灌注患者或冷冻以备将来灌注。
在下面的实验中，用于细胞洗涤的缓冲液是添加0.5％HSA的PBS，但是对于基因疗法的临床方案来说，必须使用含0.5-4％HSA的0.9％氯化钠溶液，以更好保持细胞的生理环境及制备适于患者灌注的生理产品。
洗涤和浓缩步骤如实施例4所述在一次性无菌装置中进行，该装置由与滤洗袋、缓冲袋和废弃袋连接的转膜组成。装有遗传修饰淋巴细胞的样品袋及用于细胞回收的终末袋都与该装置无菌连接。
如前所述，本系统容许在无菌环境中进行细胞处理。
洗涤流程由用户定义，且与实施例4中所述相同。使用转膜将细胞用刚刚描述的缓冲液洗涤两轮，并转移至收集袋，即洗涤袋。然后将细胞以计划的50-60ml体积转移至终末回收袋，用固定体积的缓冲液漂洗洗涤袋和管道以减少细胞损失。
如上所述，终末回收袋中的终产品，即遗传修饰细胞，可悬浮于补充有HSA0.5-4％(用于灌注)或者HSA0.5-4％及DMSO 10％(用于细胞冷冻)的盐水溶液。在灌注或冷冻前，按欧洲条令要求的测试对终产品的小样进行质量控制。洗涤步骤的效率和长度取决于选择的参数“残留倍数减少”；根据Nexell数据选择数值50，数值100将导致来源溶液减少约2个对数。
洗涤和浓宿流程的时间长度为约1小时。
用刚才描述的洗涤流程进行了两个独立实验。在这些实验中，分析了以下参数：初始体积(样品袋中细胞悬浮液的体积)、初始细胞数及终末细胞数，以测试
洗涤步骤中的细胞损失；所用洗涤缓冲液体积，以评估试剂消耗；以及整个流程的时间长度。最后一点在该步中非常重要，其中细胞存活率是基本要素。
表9总结了使用CytoMateTM进行的两个洗涤实验的数据。
表9
 实验1  实验2
  初始体积   320ml   640ml
  终末体积   58ml   58ml
  初始细胞数   0.249×109   0.640×109
  终末细胞数   0.240×109   0.580×109
  回收率   96％   93％
  时间   55min   40min
  洗涤缓冲液体积   800ml   1034ml
在以0.2-1×106细胞/ml培养基培养细胞时，初始样品体积取决于先前拆分步骤的细胞数。
回收袋中的细胞终体积由用户在程序中设置，且优选不超过60ml，以将注入患者的体积降至最低。
初始和终末细胞数是非常有用的数据，以评估该流程中的细胞损失，以及用于临床研究目的，以计划计算患者注射剂量，它在基因疗法临床研究中(Bibliografia)通常以细胞数/Kg患者重量定义。
如实施例4所述，使用CytoMateTM的流程很短。
在最终回收细胞是终产品的该步中，必须将细胞操作总时间降至最低，以保持细胞存活力直至患者注射或细胞冷冻。关于悬浮在含4％HSA的0.9％氯化钠溶液中的终产品的存活率，在我们实验室中进行的稳定性测试表明，该细胞悬浮液维持稳定性达4小时：由此1小时对该工序步骤而言是足够的。
在两个实验中，评估了产品的存活率，发现是96-97％，同时洗涤步骤中的细胞损失为4-7％。该结果确保了用于患者注射或冷冻的终产品的质量。
根据这些数据，为了制备终产品，即用于注射或冷冻的遗传修饰细胞，在封闭系统中进行的洗涤工序是不费时的，而且处理细胞的质量和安全性得到很好保持：细胞在洗涤操作中从初始袋至终末灌注或冷冻袋的转移是通过管道装置进行的，而产品质量的控制是通过用无菌注射器抽取产品小样而进行的。
实施例8
开放和封闭系统之间的比较
如前述实施例所广泛说明的，本发明提供了在用于临床使用的标准化安全封闭系统中转导和筛选遗传修饰细胞的方法。
具体而言，本发明用于生成遗传修饰T细胞(参见前述实施例)以用于同种异体骨髓移植临床方案的环境中。
当前使用开放系统来生成转导T细胞用于临床方案。该系统的步骤在上文中有总结，包括：刺激，转导，筛选，扩增，以及收获。
在每个实施例中，描述了单个步骤以及将该步骤开发到封闭系统中。
从开放系统至封闭系统的转变对提升产品规模是必要的，而且为了提高用于临床使用的产品的安全性也是必要的。
在我们的经验中，如果需要有限数目的细胞(1-1.2×108个终末细胞，患者剂量106细胞/Kg)，那么可使用开放系统，且没有重大污染风险。
但是当临床方案需要高剂量时(107或108细胞/Kg)，那么生成0.8-8×109个终末细胞，而且封闭系统是必要的，以降低污染风险并便利细胞操作。
为此目的，在我们实验室中开发出了一个易实施的封闭系统。如前述每个步骤中所说明的，该系统确保与开放系统相比更高数量细胞的无菌操作。由于没有出现开放步骤，所以可以在常规实验室中进行整个操作。
本方法可在方案设备中进行标准化，以利于广泛实验室操作人员使用。
在下表中总结了前述实施例中广泛讨论的两个实验，并与开放系统中进行的实验逐步比较。
开放系统的每个数值是使用通过成分血回收的5份不同供体细胞进行的5个实验的中值，而封闭系统中进行的两个实验是由血沉棕黄层和成分血开始而进行的。
表10
  第2天/第0天   第3天/第2天 第6天/第3天   筛选前％NGF+   筛选前MFI   回收率％   第10天/第7天   终末％NGFR  终末MFINGFR   第10天/第0天   终末细胞数×106
  开放系统(5名供体)   0.41   1.3   3.7   15   507   34   5   95   580   0.35   568
  封闭系统(血沉棕黄层)   0.2   1.2   3.6   20   622   77   2   95   519   0.26   249
  封闭系统(成分血)   0.49   0.89   2.5   23   364   67   3.6   94   462   0.64   640
-第2天/第0天显示了第2天和第0天测试的细胞数之间的比率。该比率指示直到第2天的细胞增殖率。比率第3天/第2天及第6天/第3天具有相同含义。
-筛选前％NGFR+细胞指示经SFCMM-3载体遗传修饰的转导细胞数，所述载体如实施例2所述，编码TK分子和ΔLNGFR细胞表面表达分子。该值在筛选步骤前通过细胞荧光测定分析来检测。
-MFI是荧光强度平均值，是与细胞表面表达的细胞分子数量有关的细胞荧光测定分析参数。
-回收率％是筛选步骤后收集的细胞总数与筛选步骤前转导细胞细胞总数的比值。
-终末NGFR细胞百分率指示终产品中遗传修饰细胞的数量。
-终末细胞数指患者灌注当天或细胞冷冻当天所收集遗传修饰细胞的数目。
-时间点是：第0天，细胞刺激日；第2天，转导日；第6天，筛选日；第7天，珠脱离日；第10天，终产品回收日。
可以比较这些实验，因为它们是由相似的细胞数开始而进行的：5个开放系统实验平均1622×106个细胞，封闭系统实验则932-1000×106个细胞。
●该表显示，由成分血开始在封闭系统中进行的实验非常高效，且生成的遗传修饰细胞数事实上比同样从成分血开始的开放系统生成的要高。
●该工序的详细分析指出，封闭系统显示主要优势的步骤是转导和筛选，其中细胞回收率很高。
终产品的纯度(最终NGFR阳性细胞百分率)非常相似，且显示最终遗传修饰细胞群的均一性。
●封闭系统只有增殖速率比开放系统低，尤其是在第3天与第6天之间及第10天与第7天之间。然而，用不同袋或不同培养基开发细胞培养，应当能提高细胞增殖。
这些结果表明，本发明提供了在安全有效的标准化封闭系统中转导和筛选遗传修饰细胞的方法。
在同种异体骨髓移植临床方案的环境中测试的本发明，可应用至安全高效是必要的多种基因疗法临床研究中。

Claims (4)

1.用遗传构建体转导T细胞和筛选遗传修饰细胞的方法，该方法包括在封闭系统中进行转导和筛选，其中使用自动流体管理设备洗涤、浓缩、转导和重悬细胞且没有任何流体的人工转移，且其中所述方法包括免疫磁性筛选转导细胞，其中所述方法使用
(a)用于细胞浓缩、细胞洗涤、转导及培养基更换的第一设备；和
(b)用于转导细胞免疫磁性筛选的第二设备。
2.权利要求1的方法，其中在允许逐步用户自定义编程的完全封闭系统中，转膜确保细胞针对逆流缓冲液循环过滤且与不同袋连接。
3.权利要求1的方法，其中(a)使用CytomateTM细胞处理系统进行。
4.权利要求1的方法，其中(b)使用IsolexTM300磁性细胞分离系统进行。
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