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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen, mit
denen vereinzelte biologische Zellen bereitgestellt werden, die
in biologische Assays eingesetzt werden sollen, bei denen hohe Anforderungen
an die Membranqualität
bestehen.
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Für viele
Anwendungen in der Zellbiologie, Medizin und allgemein in der Biotechnologie
sowie für
die eingangs erwähnten
biologische Assays ist es erforderlich, lebende biologische Zellen,
insbesondere Mikroorganismen, eukaryotische Zellen und/oder Zelllinie
nach deren Gewinnung oder Erzeugung über lange Zeiträume zu lagern,
um sie transportieren und/oder zu einem späteren Zeitpunkt verwenden zu
können.
Während
dieser Lagerung sollen die metabolischen Funktionen in der Zelle
abgestoppt sein, um die Zelle nach der Lagerung möglichst
unverändert
vorzufinden und sozusagen so verwenden zu können wie vor der Einlagerung.
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Es
ist seit langem bekannt, dass zu diesen Zwecken biologische Zellen
eingefroren und nach entsprechender Lagerung wieder aufgetaut werden können. Bei
tiefsten Temperaturen von bis zu bspw. –196°C können die eingefrorenen Zellen
dabei viele Wochen, Monate oder Jahre gelagert werden.
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Um
eine hohe Überlebensrate
der eingefrorenen Zellen zu gewährleisten,
sind dabei besondere Anforderungen an das Lagermedium für die Cryo-Konservierung
sowie das Einfrier- und
Auftauverfahren zu stellen. In dem Lagermedium muss bspw. ein sog.
Cryoprotektans, ein cryo protective agent (CPA) wie z. B. Dimethlysulfoxid
(DMSO), vorhanden sein, um die Bildung von Eiskristallen zu verhindern,
die die Zellmembran beschädigen
können. Neben
der Eiskristallbildung stellt Osmolaritätsstress ein weiteres Problem
bei der Cryo-Konservierung dar,
denn durch teilaufgetautes bzw. -eingefrorenes Lagermedium kann
es zu lokal erhöhter
Salz- und/oder CPA-Konzentration
sowie zu einem Auswaschen des CPA aus den Zellen kommen. Ferner
ist zu beachten, dass das CPA toxisch sein kann. DMSO z. B. ist
nur bei geringer Konzentration und niedrigen Temperaturen nicht
toxisch.
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Ein
früher Überblick über Verfahren
zum Einfrieren von lebenden Zellen und damit einhergehende Probleme
findet sich in P. Mazur (1984), Freezing of Living Cells: mechanisms
and implications, Am. J. Physiol. 247, Seiten 125 bis 142. Ge eignete
CPAs finden sich bspw. in K. G. Brockband (1995), Principles of
Autologous, Allogenic and Cryopreserved Venous Transplantation,
Chapter 10, Tabelle 10.1. Der Inhalt dieser Veröffentlichungen ist durch Bezugnahme
ausdrücklich
Bestandteil dieser Anmeldung.
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In
der
US 5,700,632 von
Critser ist ein Verfahren beschrieben, bei dem unter Verwendung
jeweils nach bestimmten Formeln zu berechnender Temperaturprofile
biologische Zellen eingefroren und wieder aufgetaut werden, wobei
das CPA mit Hilfe eines isotonischen Zellkulturmediums und unter
Verwendugn einer speziellen porösen
Membran aus der aufgetauten Zellsuspension herausgewaschen wird.
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Die
WO 2007/009285 A1 beschreibt
ein Verfahren zum Cryokonservieren von in-vitro kultivierten Zellen,
bei dem in Cryo-Röhrchen
Proben von je 2 × 10E6
Zellen von unterschiedlichen Zelllinien in 1 ml eines speziellen
Lagermediums aufgenommen und mit einer kontrollierten Einfrierrate
von 0,5 bis 5°C/min
von Raumtemperatur auf –80°C eingefroren und
dann in flüssigem
Stickstoff gelagert werden. Die Zellen werden wieder aufgetaut,
indem die eingefrorenen Proben zunächst für 3 min in einem Wasserbad
von 37°C
verflüssigt
und dann in ein steriles Röhrchen
mit 10 ml an frischem Medium transferiert werden. Nach 5 min Zentrifugieren
bei 350 g wird der Überstand
entfernt und das Zellpellet in 3 ml an frischem Medium resuspendiert.
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Die
WO 01/78504 A2 beschreibt
ein zweistufiges Verfahren zum Auftauen von cryo-konservierten Zellen,
bei dem die gefrore nen Zellen in ihrem Cryo-Röhrchen zunächst in einem Luftbad von unter 30°C auf eine
Zwischentemperatur von wenigstens –30°C erwärmt und dann in einem Wasserbad
von wenigsten 32°C
weiter erwärmt
werden.
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Die
US 2003/0039952 A1 beschreibt
drei verschiedene Verfahren zum Auftauen von gefrorenen Zellsuspensionen.
Dabei wird zu 25 ml Zellsuspension ein Volumen von 25 ml Auftaupuffer
hinzugegeben, woraufhin die Zellen aufgetaut und in Wachstumsmedium über Nacht
bei bspw. 25°C
inkubiert werden. Danach werden die Zellen expandiert und weiterverwertet.
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Bei
diesen bekannten Verfahren ist insbesondere von Nachteil, dass sie
kompliziert, teuer und zeitaufwändig
sind, wobei die aufgetauten Zellen häufig vor ihrer eigentlichen
Verwendung noch in einem Zelllabor weiter kultiviert werden müssen.
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Ferner
weisen die bekannten Verfahren meist mehrere weitere Nachteile auf,
denn sie lösen die
oben erwähnten,
beim Einfrieren und/oder Auftauen entstehenden Probleme häufig nur
unvollkommen oder gar nicht. So kommt es zu intrazellulärer Kristalleisbildung
durch Umkristallisation, zu Osmolaritätsstress durch teilaufgetaute
Medien mit einhergehender erhöhter
Salzkonzentration, zu Osmolaritätsstress
durch das Auswaschen des CPA aus den Zellen, und zu toxischen Wirkungen
des CPA im aufgetauten Zustand. Dies führt zu einer häufig nicht
zufriedenstellenden Überlebensrate
der eingefrorenen Zellen, was bei den hohen Kosten für die Bereitstellung vieler
Zellen und Zelllinien wirtschaftlich von Nachteil ist.
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Für die eingangs
erwähnten
Anwendungszwecke ist neben der Viabilität der aufgetauten Zellen insbesondere
auch die Qualität
der Zellmembran der aufgetauten Zellen entscheidend.
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Die
bei den bekannten Verfahren erzielbaren Membranqualitäten sind
allgemein für
solche Assays ausreichend, in denen adhärente Zellen oder solche Zellen
verwendet werden, die durch Aussäen
von aufgetauten suspendierten Zellen in einem Zellkulturgefäß erzeugt
werden. Für
Assays mit geringen Anforderungen an die Membranqualität wie Flux-Assay oder
Fluoreszenz-Assay reichen die bekannten Auftauverfahren auch bei
Verwendung von suspendierten Zellen aus.
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Bei
den eingangs erwähnten
Anwendungsbereichen, in denen suspendierte Einzel-Zellen eingesetzt
werden, sind an die Membranqualität jedoch hohe Anforderungen
zu stellen. Hierbei handelt es sich z. B. um automatisiertes und
manuelles Patch-Clamping, wie es bspw. beschrieben ist in
EP 1 218 736 A ,
EP 0 938 674 A oder
EP 1 311 655 A . Die
Qualität
der Zellmembranen der mit der Patch-Clamp Technik kontaktierten
Zellen ist entscheidend dafür,
dass ein Gigaseal realisiert und über hinreichend lange Zeit
erhalten werden kann.
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Weitere
Anwendungsgebiete mit hohen Anforderungen an die Membranqualität sind Durchflusszytometrie
und spannungssensitive Membranfarbstoffe.
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Suspendierte
Zellen für
diese Zwecke werden bisher mittels kontinuierlicher Zellkultur bereitgestellt,
nur so kann mit den bekannten Verfahren die erforderliche Membranqualität zuverlässig gewährleistet
werden. Dies erfordert jedoch ein Zelllabor mit teurer Ausstattung
sowie entsprechendes Know How.
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Schließlich ist
es erforderlich, die aufgetauten Zellen über einen gewissen Zeitraum
in Einzelzell-Suspension bereitzuhalten, damit sie in die Assays
eingesetzt werden können.
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Die
suspendierten Zellen werden dazu im Stand der Technik entweder in
ungerührten
oder in gerührten
Gefäßen gehalten,
was jeweils mit spezifischen Nachteilen verbunden ist.
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Die
gerührten
Gefäßen sind
wegen der verwendeten Magnetrühr-Vorrichtungen nicht
dazu geeignet, aufgetaute Zellen in den kleinen Volumina-Bereichen
mit hoher Vitalität
und Membranqualität in
Einzelzell-Suspension zu halten, die für die durchzuführenden
biologischen Assays sinnvoll sind. Bei Volumen kleiner 20 ml muss
der Magnetrührer
nämlich
auf Grund der laminaren Strömungsverhältnisse mit
hohen Umdrehungsraten betrieben werden muss, was wiederum zu häufigem zellschädlichen Kontakt
zwischen Magnetrührer
und Zellen führt.
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Aber
auch ungerührte
Gefäße sind
nicht geeignet, weil die Einzelzellen an den Gefäßwänden adhärieren, sich absetzen und durch
das sich bildende saure Milieu geschädigt werden.
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Sowohl
bei magnetgerührten
als auch bei ungerührten
Gefäßen kommt
es ferner zu Adhärenz zwischen
den Zellen, so dass unerwünschte
Zellhaufen entstehen.
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Um
biologische Zellen für
Assays mit hoher Anforderung an die Membranqualität vielfältig einsetzen
zu können,
wäre es
daher wünschenswert,
wenn die Zellen nach cryo-konservierter Lagerung und Transport auf
einfache und membranschonende Weise aufgetaut und für einen
gewissen Zeitraum in Einzelzell-Suspension
bereitgehalten werden könnten.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Verfahren
und Vorrichtungen anzugeben, mit denen auf preiswert und technisch
einfache Weise in kleinen Volumina biologische Zellen in Einzelzell-Suspension
und mit hoher Membranqualität
bereitgestellt und für
mehrere Stunden verfügbar gehalten
werden können.
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Erfindungsgemäß wird diese
Aufgabe gelöst durch
ein Verfahren, bei dem in einem Lagermedium mit zumindest einem
CPA eine cryo-konservierte Suspension
von Zellen bereitgestellt werden, die zum Auftauen unmittelbar mit
einem Volumenüberschuss
an Auftaupuffer in Kontakt gebracht wird, der sich etwa auf Raumtemperatur
befindet.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
zum Bereitstellen von suspendierten Zellen für die Durchführung von
biologischen Assays weist die folgenden Schritte auf:
- a) Bereitstellen einer gefrorenen Zellsuspension,
- b) direktes Kontaktieren der gefrorenen Zellsuspension mit einem
Volumenüberschuss
an Auftaupuffer (12), und
- c) Inkubieren der Lösung
aus Schritt b) bei Raumtemperatur, um die Zellsuspension aufzutauen.
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Weitere
Merkmale des neuen Verfahrens sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis
17 weitergebildet.
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Die
der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen
gelöst.
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Mit
dem neuen Verfahren lässt
sich überraschender
Weise schnell, einfach und preiswert aus einer gefrorenen Zellsuspension
unter Vermeidung der oben diskutierten Nachteile und Probleme eine hochqualitative
Einzelzell-Suspension herstellen, ohne dass der Aufwand einer kontinuierlichen
Zellkultur erforderlich ist.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren, um in einem Lagergefäß in Einzelzell-Suspension befindliche
Zellen in einer Vorrichtung zwischenzulagern, bei dem auf die Lösung in
dem Lagergefäß die Einzelzell-Suspension
erhaltende Maßnahmen
ausgeübt
werden, wie sie in dem Ausführungsbeispiel beschrieben
sind.
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Dieses
Verfahren wird vorzugsweise zusammen mit dem neuen Verfahren zum
Auftauen von Zellen verwendet, kann aber auch mit nach einem anderen
Verfahren aufgetauten oder frisch hergestellten, also nicht zuvor
cryo-konservierten Zellen durchgeführt werden.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Durchführung von
biologischen Assays an biologischen Zellen, bei dem die Zellen nach
dem neuen Verfahren bereitgestellt oder zwischengelagert werden.
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Schließlich betrifft
die Erfindung auch eine Vorrichtung, um in einem Lagergefäß in Einzelzell-Suspension
befindliche Zellen zwischenzulagern, die Mittel aufweist, um auf
die Lösung
in dem Lagergefäß die Einzelzell-Suspension
erhaltende Maßnahmen
auszuüben,
und vorzugsweise dazu eingerichtet ist, in dem neuen Verfahren eingesetzt zu
werden, sowie die Verwendung der Vorrichtung in dem neuen Verfahren.
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Ferner
betrifft die Erfindung ein Transportgefäß mit gefrorenen Zellen, das
dazu eingerichtet ist, in dem neuen Verfahren eingesetzt zu werden,
sowie die Verwendung des Transportgefäßes in dem neuen Verfahren.
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Es
versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend
noch zu erläuternden Merkmale
der Erfindung nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination,
sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind,
ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Weitere
Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden
Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele
unter Bezugnahme auf die Zeichnung. Es zeigen:
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1 einen
Auftauvorgang, bei dem ein Pellet mit gefrorenen Zellen in ein Auftaugefäß mit Auftaupuffer
eingetaucht wird;
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2 einen
Auftauvorgang, bei dem ein Transportgefäß mit gefrorenen Zellen an
einem Deckel eines Auftaugefäßes befestigt
ist und durch Kippen mit Auftaupuffer kontaktiert wird;
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3 einen
Auftauvorgang, bei dem ein Transportgefäß mit gefrorenen Zellen frei
beweglich in ein Auftaugefäß mit Auftaupuffer
eingetaucht wird;
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4 in
prinzipieller Darstellung eine Vorrichtung, in der Zellen in Einzelzell-Suspension
gehalten werden;
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5 in
prinzipieller Darstellung ein Lagergefäß mit Deckel zur Verwendung
in der Vorrichtung aus 4; und
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6 zwei
Messkurven, die in der oberen Darstellung den Verlauf der nach der
trypan blue Methode bestimmten Vitalität von nach dem neuen Verfahren
aufgetauten und zwischengelagerten CHO-K1 Zellen, und in der unteren
Darstellung den Verlauf des Prozentsatzes an zusammengelagerten,
nach dem neuen Verfahren aufgetauten und zwischengelagerten CHO-K1
Zellen über
der Zeit zeigen.
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Ausgangspunkt
für das
neue Verfahren sind biologische Zellen, bspw. stabil transfizierte
CHO-K1 Zellen, die den humanen ERG (hERG) Innenkanal exprimieren.
Die Zellen liegen in einem Lagerpuffer mit einem geeigneten CPA
wie DMSO als Zellsuspension vor. Die Zellsuspension wird dann in
Proben von bspw. 0,5 ml mit je 10 × 10E6 Zellen aufgeteilt und
in geeignete Transportgefäße gegeben.
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Diese
Proben werden mit dem jeweiligen Transportgefäß dann nach einem im Stand
der Technik bekannten Verfahren, wie es bspw. in den eingangs zitierten
Dokumenten beschrieben ist, eingefroren und bei tiefer Temperatur,
bspw. bei –80°C oder –196°C gelagert.
In diesem Zustand können
die Proben für
längere
Zeiträume
gelagert und in geeigneten Umgefäßen auch über große Strecken
transportiert werden.
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An
ihrem Bestimmungs- oder Einsatzort werden die Proben dann erfindungsgemäß in noch
zu beschreibender Weise in einem Schritt aufgetaut und danach für einen
Zeitraum von bis zu mehreren Stunden in Einzelzell-Suspension vorrätig gehalten.
Während
dieser Zeit werden die Proben nacheinander oder zu mehreren parallel
unmittelbar in biologische Assays eingesetzt, wie sie bspw. in den
eingangs erwähnten
Druckschriften
EP 1
218 736 A ,
EP
0 938 674 A oder
EP
1 311 655 A beschrieben sind. Mit den Zellen kann dabei
bspw. unter Verwendung der Patch-Clamp Technik Pharma-Screening
durchgeführt
werden.
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Zum
Auftauen werden die gefrorenen Zellsuspension-Proben erfindungsgemäß in einem
Auftaugefäß direkt
mit einem 10 ml Volumen an Auftaupuffer in Kontakt gebracht, der
bis auf das CPA dem Lagerpuffer entsprechen kann.
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Dazu
werden die Pellets von gefrorenen Zellen 10 in einem ersten
Ausführungsbeispiel
aus dem Transportgefäß entnommen
und unmittelbar in den in dem Auftaugefäß 11 vorliegenden
Auftaupuffer 12 eingetaucht, wie dies in 1 gezeigt
ist.
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
ist ein offenes Transportgefäß 14 innen
an einem Deckel 15 für
das Auftaugefäß 11 angeordnet
ist, der auf das Auftaugefäß 11 aufgesetzt
wird, das dann verkippt wird, um den Auftaupuffer 12 in
Kontakt mit dem Zellen 10 zu bringen, wie dies in 2 gezeigt
ist.
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In
einem weiteren Ausführungsbeispiel
wird das offene Transportgefäß 14 frei
beweglich in den Auftaupuffer 12 eingetaucht, wie dies
in 3 gezeigt ist.
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Der
Auftaupuffer 12 und das Auftaugefäß 11 befinden sich
etwa auf Raumtemperatur. Das Auftaugefäß 11 wird dann auf
Raumtemperatur gehalten und – wie
durch den Pfeil A angedeutet – manuell oder
mechanisch vorsichtig geschüttelt.
Nach etwa 3 min Inkubation bei Raumtemperatur ist die gefrorene Zellsuspension
aufgetaut.
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Durch
diesen direkten Kontakt mit dem Auftaupuffer bei Raumtemperatur
wird die eingefrorene Zellsuspension in einem einzigen Schritt membranschonend
aufgetaut, was zu der für
manuelles oder automatisiertes Patch-Clamping gewünschten
Membranqualität
führt.
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Zum
einen wird die eingefrorene Zellsuspension rasch und homogen aufgetaut
ohne starken Erschütterungen
ausgesetzt zu sein. Dies verhindert intrazelluläre Kristalleisbildung durch
Umkristallisation sowie Osmolaritätsstress durch teilaufgetaute
Medien mit erhöhter
Salzkonzentration.
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Zum
anderen wird das CPA bei Raumtemperatur, also niedrigerer Temperatur
als im Stand der Technik, langsam ausgewaschen, was Osmolaritätsstress
beim Auswaschen des CPA verhindert. Schließlich erfolgt sehr schnell
eine starke Verdünnung – im vorliegenden
Beispiel von 1:20 – bei Raumtemperatur,
was zu einem schnellen Auswaschen des CPA aus den Zellen führt, so
dass wegen der sich einstellenden geringen Konzentration des CPA – hier DMSO – und der
geringen Temperatur die Toxizität
des CPA vernachlässigbar
ist.
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Die
aufgetaute Zellsuspension wird dann für 4 min bei 100 g abzentrifugiert,
der Überstand
verworfen und das Zellpellet in einem Lagergefäß 16 in dem Auftaupuffer 12 aufgenommen,
wie dies in 4 gezeigt ist.
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Auf
diese Weise wird schnell, einfach und preiswert aus der gefrorenen
Zellsuspension eine hochqualitative Einzelzell-Suspension hergestellt, ohne dass der
Aufwand einer kontinuierlichen Zellkultur erforderlich ist.
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Die
so erzeugte Lösung
mit Einzelzell-Suspension wird dann mit dem Lagergefäß 16 für mehrere
Stunden in einer in 4 stark schematisiert dargestellten,
Zell-Reservoir genannten Vorrichtung 17 gelagert, in der
auf die Lösung
in dem Lager gefäß 16 die
Einzelzell-Suspension erhaltende Maßnahmen ausgeübt werden,
beispielsweise in dem Lagergefäß 16,
in dem sich die Zellen befinden, eine ständige Strömung erzeugt wird.
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Dadurch
werden die Zellen ständig
bewegt, wodurch verhindert wird, dass sie an der Wandung 18 des
Lagergefäßes 16 adhärieren oder
miteinander verklumpen. Ferner müssen
keine chemischen Mittel wie Enzyme zugegeben oder mechanische Mittel
wie Beads verwendet werden, um die Einzelzell-Suspension zu erhalten. Auch kann die
Suspension im Auftaupuffer gehalten werden, die Zusammensetzung
des Mediums wird also während
der gesamten Prozedur nicht verändert.
All dies führt
zu einer stabilen Suspension mit vitalen Zellen mit intakten Zellmembranen.
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Die
ständige
Strömung
wird dabei vorzugsweise so eingestellt, dass sie einerseits stark
genug ist, um die Verklumpung von Zellen und Adhäsion zu verhindern, die anderseits
aber so sanft ist, dass Zellschädigungen
vermieden werden.
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Diese
ständige
Strömung
kann durch geeignete Innenformgebung für das Lagergefäß 16 und ständiges Agitieren – Bewegen,
Schütteln,
kippen etc. – des
Lagergefäßes 16 und/oder
durch Bestrahlen mit Ultraschall erreicht werden.
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Das
Lagergefäß 16 ist
in einem Ausführungsbeispiel
mit einem vollständig
oder teilweise nach innen gewölbten
Boden 19 versehen, um eine zellschonende Flüssigkeitsströmung im
Inneren des Lagergefäßes 16 zu
ermöglichen.
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Das
Lagergefäß 16 ist
dabei ferner so ausgelegt, dass es verschließbar ist, um zu verhindern, dass
Flüssigkeit
aus dem Lagergefäß verdunstet
und dadurch die Osmolarität
verändert
wird. Anderseits muss das Lagergefäß 16 die Entnahme
von Zellen mittels einer Pipette ermöglichen.
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Zu
diesem Zweck wird in dem Ausführungsbeispiel
gemäß 5 ein
mit Öffnungen 21 versehener
Deckel 22 verwendet, durch die eine Pipette 23 in die
Lösung
eingetaucht werden kann, die aber so klein sind, dass Verdunstung
verhindert wird.
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Das
Lagergefäß 16 ist
schließlich
innen aus einem Material gefertigt oder mit einem Material beschichtet,
auf dem die Zellen 10 nicht oder nur schlecht adhärieren.
Teflon® hat
sich als geeignetes Material erwiesen.
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In
dem Ausführungsbeispiel
gemäß 4 ist das
Zell-Reservoir 17 mit
zumindest einer automatischen Pipettier-Vorrichtung 24 versehen, die
durch zyklisches Ansaugen und Auslassen zumindest eines Teiles der
Lösung
in dem Lagergefäß 16 die Flüssigkeitsströmung erzeugt.
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Die
dabei eingesetzte Pipette 25 ist in einem Ausführungsbeispiel
durch entsprechende Beschichtung mit einer Zellkontaktfläche versehen,
die der Adhäsion
von Zellen entgegenwirkt. Die Pipette 25 ist dabei so ausgerichtet,
dass sie die angesaugte Lösung
auf die gewölbte
Innenfläche 19 des
Lagergefäßes 16 ausbläst, was
zu einer entsprechenden Ver wirbelung der Lösung führt und der Verklumpung sowie
Adhäsion
entgegenwirkt.
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Die
dabei erfolgende Titrierung der Zellen 10 durch die enge Öffnung der
Pipette 25 erzeugt einen mechanischen Stress und verhindert
es, dass sich Zellen zusammenlagern/klustern.
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Zellen,
die sich in schlechtem Zustand befinden, werden dabei durch mechanische
Dissoziation zerstört,
vitale Zellen bleiben jedoch intakt. Über die gesamte Zeit im Zell-Reservoir 17 werden
die Zellen also selektiert.
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Versuche
bei der Anmelderin haben ergeben, dass mit dem obigen Verfahren
cryo-konservierte biologische Zellen in eine sofort in biologische
Assays einsetzbare Einzelzell-Suspension überführt und
für einen
begrenzten Zeitraum bereitgehalten werden können. Die Zellen können dabei
für bis
zu 4 h in Einzellzell-Suspension mit annähernd gleich bleibender Zellzahl
und Membranqualität
gehalten werden. Die Vitalität
im trypan blue Test lag auch nach 3 h noch weit über 90%, die Zahl der verklumpten
Zellen unter 15%; siehe 6.
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An
den gefrorenen und erfindungsgemäß aufgetauten
und zwischengelagerten Zellen
10 wurden die elektrophysiologischen
Eigenschaften mit einer manuellen und einer automatisierten Patch-Clamp
Vorrichtung bestimmt, wie sie in den in den eingangs erwähnten Druckschriften
EP 1 218 736 A ,
EP 0 938 674 A oder
EP 1 311 655 A beschrieben
sind. Die Membranqualität
und Vitalität
der Zellen erlaubten die Etablierung eines hervorragenden Gigaseal
und die messtechnische Erfassung von Strömen der hERG Innenkanäle.