WO2022195124A1 - Zellkulturkammer und verfahren zur kultivierung von zellen und zur in vitro-herstellung von zellschichten und organmodellen - Google Patents

Zellkulturkammer und verfahren zur kultivierung von zellen und zur in vitro-herstellung von zellschichten und organmodellen Download PDF

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cells
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cell culture
culture chamber
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Knut Rennert
Martin RAASCH
Nancy BLAUROCK-MOELLER
Katja Graf
Nader ABDO
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Definitions

  • the invention relates to a cell culture chamber for cultivating cells and for the in vitro production of cell layers and organ models as well as a method for cultivating and for improved functional maintenance, in particular of liver sinusoidal endothelial cells (LSEC) alone and in co-culture with liver-specific cell types.
  • LSEC liver sinusoidal endothelial cells
  • Devices in particular cell culture chambers, are known from the prior art which allow in vitro culture and examination of cell cultures under perfusing conditions.
  • the respective cell cultures can be flushed or incubated with liquids or gas and aerosol mixtures and thus conditions can be simulated that come very close to the physiological conditions in vivo.
  • cell culture chambers are suitable for investigating the effects and any interactions that may occur between one or more cell cultures and a medium or more media and test substances contained in the medium (e.g. in the areas of pharmacokinetics (PK) and pharmacodynamics (PD), absorption -, distribution, metabolism, excretion and toxicology (ADMET) studies, substance sensitivity tests and substance safety tests).
  • PK pharmacokinetics
  • PD pharmacodynamics
  • ADMET absorption -, distribution, metabolism, excretion and toxicology
  • Cell culture chambers are described, for example, in WO 2015/169287 A1. These consist of two channels separated by a porous membrane.
  • Plastics are often used as the material for such cell culture chambers, which are biocompatible and can also be easily brought into complex shapes in terms of production technology. In particular, such materials are suitable for processing using various injection molding techniques. Examples of such plastics are polyurethane (PU), polyimide, styrene (SEBS), polypropylene (PP), polystyrene (PS), polycarbonate (PC) and cyclic polyolefins (COP and COC).
  • PU polyurethane
  • SEBS polyimide
  • PP polypropylene
  • PS polystyrene
  • PC polycarbonate
  • COC cyclic polyolefins
  • cell culture chambers are made of polydimethylsiloxanes (PDMS) and z. B. used for the culture of complex cell / organ models (z. B.
  • the use of PDMS-based chips for complex cell/organ models is complex, since the PDMS, in contrast to biocompatible, injection-mouldable plastics, must be activated beforehand in order to be suitable for cell cultures at all. This is done, for example, by introducing activation solutions in connection with UV irradiation and several washing steps. These preliminary procedures are not in everyone laboratory at the end user's without any problems and harbor a certain potential for error before the start of the actual cell culture.
  • the materials of the cell culture chambers should be inert in order to have as little influence as possible on the cell culture and media systems to be examined.
  • the frequently used material PDMS has high binding capacities for some chemical compounds (Auner et al. , (2019): Chemical-PDMS-binding kinetics and implications for bioavailability in microfluidic devices; Lab Chip 19: 864- 874).
  • Such binding capacities can have an impact on investigations carried out with cell culture chambers made of PDMS that is difficult to assess. So adsorb z. B.
  • Substances with a logP greater than 1.8 and a hydrogen donor count of 0 have a high PDMS content, which makes active substance testing and the interpretation of the data obtained considerably more difficult.
  • the substance propiconazole has a logP of 3.72 and a so-called hydrogen donor count of 0. It is very hydrophobic and can only be detected in PDMS chips after 24 hours with less than 30% of the initial concentration in the culture medium, since it is irreversible binds to PDMS (Auner et al. 2019).
  • the invention presented here is based on the object of proposing an improved cell culture chamber and its use, by means of which the disadvantages known from the prior art are reduced.
  • the task is solved with a cell culture chamber for the cultivation of cells and in vitro production of cell layers and organ models.
  • the cell culture chamber according to the invention has at least two channels which are arranged one above the other and are separated from one another by a porous membrane with two side surfaces and through which flow can take place, with a cell substrate being formed in each case by the side surfaces of the membrane.
  • the device is characterized in that at least the inner walls of the first and second channels are made of polybutylene terephthalate (PBT).
  • PBT polybutylene terephthalate
  • PBT is a polymer used to manufacture products that are subject to high mechanical stress and/or are in repeated contact with hot media.
  • Typical uses of PBT are, for example, plain bearings, valve parts, screws, parts for household appliances such as coffee machines, egg cookers, toasters or hair dryers.
  • PBT is very well suited for injection molding processing. In tests, this material, which is unusual for use in cell culture chambers, showed very low binding capacities for a number of components of the media used, so that the influence of the material of the cell culture chamber on the investigations carried out in such a cell culture chamber can be advantageously reduced.
  • the cell culture chamber according to the invention can be used for cultivating cell cultures and organ models and for examining them (e.g. real-time observation via optical solutions such as microscopy).
  • the cell cultures/organ models can be supplied with media of a defined composition under environmental conditions that are also known and can be controlled if necessary (e.g. temperature, air pressure, flow rate and shear stress, relative orientation of the cell culture chamber, oxygen, pH value).
  • the cell culture chamber can advantageously also be used for the cultivation of at least two different cell types.
  • the cultivation of at least two different cell types is also referred to herein as co-culture or co-cultivation.
  • Such a co-culture can provide a further approximation of the model environment to in wVo conditions.
  • Such a co-culture of at least two different cell types in the cell culture chamber establishes an organ model within the meaning of the invention.
  • a specific use of the cell culture chamber according to the invention consists in cultivating so-called liver sinusoidal endothelial cells (LSEC) and examining them if necessary.
  • the LSEC can advantageously also be cultured in the cell culture chamber in co-culture with other liver cells, such as in particular hepatocytes, Kupffer cells/macrophages and/or stellate cells.
  • LSEC alone and in co-culture with other liver cells, are an important test system for investigating a variety of functions and interactions of the liver as one of the central metabolic organs of the body, especially in mammals.
  • the cultivation of this LSEC alone or in co-culture with other liver cells is very demanding. A brief overview is given below.
  • Hepatic sinusoidal endothelial cells are specialized hepatic endothelial cells characterized by the absence of a distinct basement membrane and the presence of small open pores called fenestrae.
  • the unique permeable structure of the LSEC allows blood plasma free access to the space between the LSEC and the Disse space located in hepatocytes.
  • hepatocytes can produce small molecules, e.g. B. nutrients exchange without direct contact with the blood stream.
  • LSEC assume specific functions in the body, such as the so-called clearance of macromolecules, the production of coagulation factors and the adhesion of immune cells, e.g. B. liver damage.
  • these are characterized by specific markers such as factor VIII, Stabilin-2, LSECtin and CD32b (see Table 1).
  • LSEC are thought to be directly involved in drug-induced liver toxicity, making them interesting for more in-depth drug testing.
  • the LSEC As a model system are due to the fact that the LSEC generally lose their functionality and specific markers (see Table 1) within a few hours to days after isolation. You are then, for example, no longer or only to a limited extent to check the toxicity of active substances, e.g. B. in examining the contribution of immune cells to hepatotoxicity.
  • the invention proposes solutions by means of which the functionalities of LSEC alone and in co-culture with other liver-specific cell types can be maintained for considerably longer.
  • the channels can be designed in such a way that in the first channel, vascular conditions of a blood vessel with the aid of LSEC can be replicated.
  • the LSEC can be cultivated alone or in co-culture with other cells, in particular Kupffer cells.
  • Kupffer cells the liver's resident macrophages, are localized in the hepatic sinusoid in vivo, performing a surveillance function by enabling the liver to respond to pathogens and damage.
  • Kupffer cells are able to precisely regulate drug-induced inflammation or phenotypic changes, resulting in differential expression and secretion of pro- or anti-inflammatory mediators (e.g., IL-1ß, TNF, IL -6, IL-10). This critical regulation of the inflammatory response makes them an important component of in wfro models of liver disease, as well as in wro screening models for drug toxicity arising from inflammatory downregulation of drug-metabolizing enzymes and/or drug transporters.
  • pro- or anti-inflammatory mediators e.g., IL-1ß, TNF, IL -6, IL-10
  • Kupffer cells/macrophages thus play an essential role in the development of side effects from substances/active ingredients.
  • Kupffer cells/macrophages together with LSEC regulate the immune response. They play e.g. B. an important role in the development of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and non-alcoholic steatohepatitis (NASH).
  • NAFLD non-alcoholic fatty liver disease
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • Kupffer cells protect the liver from drug-induced liver injury (DILI) by releasing hepatoprotective cytokines, including IL-10 and IL-6.
  • DILI drug-induced liver injury
  • Kupffer cells have been shown to contribute significantly to DILI by releasing pro-inflammatory cytokines, including TNF, IL-1ß and IL-6, which can be either protective or damaging depending on the context.
  • pro-inflammatory cytokines including TNF, IL-1ß and IL-6
  • a drug's propensity to induce DILI can only be revealed in vitro when Kupffer cells are present and targeted for one per inflammatory response.
  • the cell culture chamber according to the invention offers the great advantage that Kupffer cells can be co-cultivated together with LSEC under physiological conditions. Targeted in vitro DILI tests under conditions close to the body are thus made possible.
  • hepatic conditions can be simulated.
  • the hepatic conditions can be generated with the help of hepatocytes, for example.
  • LSEC and hepatocytes in co-culture can form an organ model of a mammalian liver.
  • the hepatocytes can be cultivated alone or in co-culture with other cells, in particular stellate cells.
  • Stellate cells have been described in the “quiescent” state as vitamin A stores and as antigen-presenting cells in the liver. Activation of stellate cells is the critical step in developing liver fibrosis. It goes hand in hand with the loss of Vitamin A stores and leads to transdifferentiation under the stimulation of cellular mediators, cytokines and chemokines from injured or inflammatory cells. In the initial stage of fibrogenesis, HSCs transform into proliferative and contractile myofibroblasts. These accelerate the secretion of extracellular matrix and reduce the degradation of the extracellular matrix elements, which ultimately leads to fibrogenesis. Together with the Kupffer cells, they make a significant contribution to the development of NAFLD, NASH and liver fibrosis.
  • the co-culture of stellate cells using the cell culture chamber according to the invention can, for example, make it possible to study the mechanisms of fibrogenesis, in particular by testing potentially involved mediators or signaling molecules.
  • the porous membrane between the first and the second channel is advantageously selected with a thickness from a range from 10 to 20 ⁇ m, in particular from a range from 10 to 13 ⁇ m.
  • the membrane has a thickness of 12 ⁇ m.
  • a membrane thickness above 20-50 pm complicates the exchange of substances and soluble factors between the vascular and hepatic chambers.
  • migration of immune cells into the liver tissue is made more difficult by thick membranes and has a negative impact on the results of drug testing.
  • the membrane can preferably consist of a rigid material such as polyethylene terephthalate (PET).
  • PET polyethylene terephthalate
  • the membrane can also consist of a flexible material such as a thermoplastic elastomer (TPE) or an elastic polyurethane (TPU).
  • the membrane can be designed with a thickness of 10 to 75 ⁇ m, preferably 10 to 50 ⁇ m.
  • the pore size of the membrane is advantageously in a range from 0.4 ⁇ m to 8 ⁇ m. It has been shown that pore sizes of more than 3 ⁇ m, for example 5 ⁇ m, 6 ⁇ m, 7 ⁇ m or 8 ⁇ m, facilitate the exchange of soluble factors and the migration of immune cells into the hepatic canal.
  • the membrane can have additional surface structuring, which can be produced, for example, by laser structuring. Such a structuring can advantageously be adjusted for the manipulation of cell growth and/or for the manipulation of the flow-mechanical properties of the membrane (for example in order to establish predetermined flow profiles).
  • the membrane and/or the channels can be plasma-treated with oxygen plasma, for example.
  • Non-polar materials especially plastics with long polymer chains, have a very low surface energy (usually 20-40 mN/m; for comparison PDMS only 20 mN/m), which cannot be compared with the high surface tension of aqueous liquids as they normally occur in cell cultures , agrees.
  • Polar materials such as PET (44 mN/m) and PBT (48 mN/m) are slightly higher.
  • the surface energy of plastics consists of a disperse and a polar part. Especially that one polar part of the surface energy is very low.
  • the plasma treatment significantly increases the surface energy (total up to 80-90 mN/m), especially its polar part.
  • the surfaces are freed from any existing release agents and functionalized.
  • treatment with oxygen plasma creates reactive oxygen species, which break polymer bonds and make them vulnerable to chemical-biological interactions or introduce additional hydroxy groups into the PBT polymer.
  • the plasma treatment can be preceded by a cleaning step by incubating the cell culture chamber in isopropanol or ethanol for 10 minutes, for example.
  • the actual plasma treatment of the dried chambers can take place in particular using the low-pressure plasma process.
  • the (cleaned) cell culture chambers are placed in a vacuum chamber made of e.g. B. Borosilicate glass and treated with oxygen plasma at low pressure of ⁇ 100 Pa ( ⁇ 1 mbar) for up to 20 min.
  • the oxygen plasma can be generated by short-wave excitation with a high-frequency generator at 13.56 MHz and up to 200 W power.
  • the first and the second channel are arranged one above the other.
  • Such an arrangement makes it easier, for example, to observe the cells using an inverted microscope, so that the free space required for manipulating the cell culture chamber is maintained above the cell culture chamber.
  • This understanding also includes configurations of the cell culture chamber in which the first channel is arranged above the second channel at an angle of up to 60° relative to the effective direction of gravity, which can be achieved, for example, by an inclined arrangement of the membrane between the first and second channel, as well as operating positions of the cell culture chamber that are inclined by up to 60° with respect to the effective direction of gravity.
  • the invention provides a model system in which, under specific, body-like culture conditions, human LSEC in particular, alone and in co-culture with other liver-specific cell types, receive both their markers and their functional properties for at least 4 days, in particular for up to 14 days stay.
  • the expression of the following LSEC markers can be detected in the model system for up to 14 days: CD31, CD206, vWf, Factor VIII, LSECtin, L-SIGN, LYVE-1, Stabilin-2, VAP-1, FcRn, MHC I and MHC II.
  • this advance is achieved through other optional improvements.
  • At least one side surface of the membrane can be coated with a mixture containing fibronectin and/or collagen I and/or collagen IV.
  • coated includes that the fibronectin and/or collagen I and/or collagen IV is/are chemically bound (covalently or non-covalently) to the membrane.
  • the fibronectin is present in a concentration of 0.5 to 5 pg/ml, the collagen I in a concentration of 100 to 300 pg/ml and the collagen IV in a concentration of 100 to 300 pg/ml.
  • the coating can be present on both side surfaces of the membrane. For certain uses it can be advantageous if no collagen I is present, since this is formed to an increased extent in the liver, for example in the case of fibrosis, and therefore does not represent a typical physiological state.
  • dextran chains may be coupled to at least one of the side surfaces of the membrane, to which fibronectin peptides or RGD peptides or vitronectin peptides or bone sialoprotein peptides with an RGD sequence (arginine-glycine -aspartic acid) are bound.
  • RGD sequence serves in particular to mediate cell adhesion.
  • heparin chains are coupled to at least one of the side surfaces of the membrane, to which fibronectin peptides or FGF peptides with an RGD sequence or RGD peptides alone or vitronectin peptides with an RGD sequence or bone sialoprotein Peptides with RGD sequence are bound.
  • FGF peptides are fibroblast growth factor peptides.
  • the LSEC can show the following markers in the model system for up to 14 days: CD32b, CD31, vWf, Factor VIII, LSECtin, L-SIGN, Stabilin-2, VAP-1, LYVE-1, FcRn , MHC I and MHC II.
  • the cell culture chamber according to the invention can be used in a method for cultivating human or animal cells, such as mouse, rat, pig or dog cells, etc.
  • a culture medium is conveyed permanently or temporarily through at least one of the channels.
  • the cells are preferably cultivated on an apical side of the membrane.
  • apical means that the cell culture is bathed by the culture medium on the side facing the membrane. In particular, this is the upward direction, i.e. against the force of gravity side surface of the membrane. Apically cultivated cells grow on the side of the membrane that is washed by the culture medium.
  • the culture medium can also be brought into contact with the cell culture basolaterally.
  • a basolateral contact with apically cultivated cells is therefore present when there is contact via the porous membrane.
  • the cell culture chamber according to the invention can particularly preferably be used in a method for the cultivation of LSEC.
  • the LSEC can be cultivated alone or in co-culture with other liver-specific cell types; a co-culture with other liver-specific cell types is referred to herein as a liver model.
  • a vascular culture medium (LSEC medium; ECM) that is preferably located apically in the first channel.
  • ECM vascular culture medium
  • This may comprise a basal endothelial cell medium such as M199 or MCDB in which 0-20% human serum and/or 0-20% FCS (fetal calf serum), 0-10 ng/ml HGF (hepatocyte growth factor), 0-10 ng/ml EGF (epidermal growth factor), 0-10 ng/ml bFGF (basic fibroblast growth factor), 0-20 ng/ml IGF-I, 0-5 ng/ml VEGF (vascular endothelial growth factor) , 0-50 mM hydrocortisone, 0-5 mM ascorbic acid and/or 0-4% ITS (insulin/transferrin/selenium) and heparin (0-5U/ml).
  • a basal endothelial cell medium such as M199 or MCDB
  • a hepatic basal medium preferably basolaterally adjacent to the second channel, such as Williams E medium, can be used in which 0-20% FCS (fetal calf serum) and/or 0- 20% human serum, 0-5 mM -glutamine or glutamax, 0-10 pg/ml insulin, 0-4% MCB, 0-5 pM dexamethasone, 0-50 pM hydrocortisone and 0-5% DMSO are included.
  • FCS fetal calf serum
  • the hepatic culture medium can be seeded with hepatocytes and/or stellate cells.
  • the culture medium can advantageously be produced free of additives of animal origin. Of course, it is equivalent and also possible to proceed in reverse and to apply the vascular culture medium to the second channel for the culture of the LSEC and the hepatic basal medium in the first channel.
  • an LSEC cell culture can be extended if it is cultivated in co-culture with other cells (again both apically and basolaterally).
  • co-cultivated cells such as hepatocytes, stellate cells and immune cells such.
  • B. Kupffer cells / macrophages compared to cell cultures without co-culture advantageous for the preservation of functionalities. It is advantageous here if the cells used to construct the liver model have the identical HLA (human leukocyte antigen) status.
  • the shear rate or flow rate of the culture medium in at least one of the channels is advantageously selected in such a way that it is comparable to the shear rates occurring in the body.
  • vascular conditions of a blood vessel
  • hepatic conditions can be simulated. This is achieved, for example, by passing through the first channel an apical culture medium with a shear rate applied to the liver sinusoid selected from a range of >0.2 to 1 dyne/cm 2 , preferably between 0.5 and 0.8 dyne/cm 2 and through conveying a basolateral culture medium through the second channel at a shear rate selected from a range from greater than zero to 0.2 dynes/cm 2 .
  • the shear rate in the first channel is particularly preferably set to about 0.7 dyn/cm 2 , which corresponds to the physiological vascular conditions in the liver.
  • the shear rate set in the second channel largely avoids unwanted deposition of z. B. transmigrated immune cells in the direction of gravity away from the membrane and the accumulation of metabolic waste products of the hepatocytes.
  • the dimensions of the channels can be adapted in this regard and can therefore be different.
  • the second channel can have a smaller width and/or a greater height than the first channel.
  • the oxygen content in the culture medium is advantageously adjusted to a value of 15% at the channel inlet and 3 to 5% at the channel outlet.
  • the cell culture chamber according to the invention can be used in other applications, for example for cultivating intestinal cells, lung cells and/or alveoli cells and in v/yro production of cell layers or organ models of these cell types.
  • the membrane can be coated with proteins from the extracellular matrix in a preceding step and colonized apically with LSEC, preferably in co-culture with Kupffer cells.
  • the membrane can alternatively or additionally be populated with hepatocytes, advantageously in co-culture with stellate cells.
  • immune cells such as monocytes, macrophages, T cells, B cells, neutrophils can be added to the apical culture medium or culture media and flushed into the cell culture chamber. This makes it possible to perfuse defined immune cell populations via the apical side and to examine the influence of these immune cells on the liver model.
  • the term "flush” includes that flushed Cells can circulate through the vascular chamber and adhere to surfaces, ie, colonize on the endothelial cell layer or membrane, particularly on or near LSEC cells.
  • the membrane can be coated with proteins of the extracellular matrix in a preceding step and colonized preferably apically with intestinal endothelial cells, preferably in co-culture with immune cells.
  • the membrane can alternatively or additionally be populated with intestinal epithelial cells and/or smooth muscle cells and/or immune cells.
  • immune cells such as monocytes, macrophages, T cells, B cells, neutrophils can be added to the culture medium or media.
  • the gut models can be cultivated apically and basolaterally with shear rates of 0-3 dyn/cm 2 .
  • microorganisms e.g. parts of the microbiome
  • the membrane can be coated with proteins of the extracellular matrix in a preceding step and preferably apically populated with pulmonary epithelial cells (e.g. small airway epithelial cells, alveolar epithelial cells), preferably in co-culture with immune cells.
  • pulmonary epithelial cells e.g. small airway epithelial cells, alveolar epithelial cells
  • the membrane can be populated with pulmonary endothelial cells as well as in an apical/basolateral reversed arrangement.
  • immune cells such as monocytes, macrophages, T cells, B cells, neutrophils can be added to the culture medium or media.
  • the lung models can be cultivated apically and basolaterally with shear rates of 0-2 dyn/cm 2 .
  • the epithelial cells can be cultivated without medium in order to form an air-liquid interphase, as in the body.
  • the cultivated cells, cell layers or organ models can be mixed with active substances or molecules or microorganisms by flushing them into the cell culture chamber .
  • one or more active substances to be examined can be added to the culture medium or another liquid carrier medium in the desired doses apically or basolaterally and the cell culture can be perfused with it.
  • properties of the culture medium emerging from the respective channel can be recorded as measured values.
  • a great advantage of the invention is the possibility of simulating different conditions in the channels.
  • the conditions of a blood vessel can be simulated in one of the two channels, which can be referred to as vascular conditions. In relation to the membrane, this channel can be called the vascular side.
  • the conditions in liver tissue can be simulated, which can be referred to as hepatic conditions or, in relation to the membrane, as the hepatic side.
  • the culture medium On the hepatic side, which is given in particular by the lower channel, the culture medium generates a shear rate that is small but sufficiently high, which considerably reduces unwanted settling of cells away from the membrane. Due to their material properties, the channels of the cell culture chamber according to the invention also have a low adsorption of compounds contained in a culture medium. Advantageously, this has little influence on the results of experiments.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of a cell culture chamber according to the invention with two channels and a membrane populated in co-culture;
  • FIG. 2 shows a schematic illustration of a second exemplary embodiment of a cell culture chamber according to the invention with four channels in an exploded illustration
  • 3a shows a graphical representation of the results of an experiment on the adsorption effect of PBT in two cell culture chambers according to the invention
  • 3b shows a graphical representation of the results of a further test on the adsorption effect of PBT in two cell culture chambers according to the invention
  • LDH lactate dehydrogenase
  • 5 shows a graphical representation of the results of an experiment on the release of ASAT (aspartate aminotransferase) over a period of 10 or 14 days in comparison with a cell culture chamber according to the invention and the conditions of cell lysis
  • 6 shows a graphical representation of the results of an experiment to detect the synthesis and release of albumin over a period of 10 and 14 days, respectively, in comparison with a cell culture chamber according to the invention and the conditions of cell lysis
  • FIG. 7 shows a graphical representation of the results of an experiment to detect the synthesis and release of urea over a period of 10 and 14 days, respectively, in comparison with a cell culture chamber according to the invention and the conditions of cell lysis;
  • FIG. 8 shows a graphical representation of the results of an experiment to detect interleukin-1 beta over a period of 10 or 14 days in comparison with a cultivation in a cell culture chamber according to the invention and with the addition of LPS;
  • FIG. 10 shows a graphical representation of the results of an experiment to detect interleukin-6 over a period of 10 or 14 days in comparison with a cultivation in a cell culture chamber according to the invention and with the addition of LPS.
  • a cell culture chamber 1 according to the invention as shown in FIG. 1 comprises a housing 2 which consists of polybutylene terephthalate (PBT) at least in the areas of a first channel 3 and a second channel 4 .
  • Each of the channels 3, 4 has an inlet 5 and an outlet 6, which are used for the inflow or the discharge of a culture medium 7 into or out of the respective channels 3, 4.
  • the first channel 3 and the second channel 4 are separated from each other by a porous membrane 8 .
  • a cell culture 9 for example from liver sinusoidal endothelial cells, is located on a side surface of the membrane 8 facing the first channel 3, which is referred to as the apical side 8.1 of the membrane.
  • an optionally present co-culture 10 containing hepatocytes is settled.
  • the membrane 8 is 12 ⁇ m thick, for example, and consists of PET.
  • the channels 3, 4 each have a width B, a height H transversely thereto and a depth (not designated) perpendicular to the plane of the drawing.
  • vascular conditions for example of a blood vessel, are simulated in the first channel 3 arranged at the top relative to the effect of gravity, while hepatic conditions are simulated in the second channel 4 .
  • the shear rate in the model is adjusted for the vascular side and the hepatic side by passing through the first channel 3 an apical culture medium 7a with a shear rate of 0.7 dyn/cm 2 and through the second channel 4 a basolateral culture medium 7b with a shear rate of >0 to 0.2 dynes/cm 2 is promoted.
  • the coating of the membrane 8 consists of a mixture of fibronectin/collagen I and collagen IV (fibronectin 5 ⁇ g/ml, collagen I 0.3 mg/ml, collagen IV 100 ⁇ g/ml).
  • the cell cultures 9, 10 are cultivated in cell-type and species-specific media with specific formulations.
  • the apical culture medium 7a of the first channel 4 (ECM) contains 10% human serum and growth factors, antioxidants and ITS in concentrations that are suitable and familiar to a person skilled in the art.
  • the basolateral medium 7b of the second channel 4 contains growth factors, a collagen IV/1 mixture and ITS in suitable concentrations familiar to a person skilled in the art.
  • the addition of specific media from the basolateral side can be replaced in the second channel 4 by cultivating hepatocytes and, if necessary, stellate cells in cell-specific medium 7b.
  • macrophages on the apical side (first channel 3) have a positive influence on the properties/functionality of the cell culture 9.
  • a pump unit for each channel 3, 4 for the controlled delivery of the respective culture medium 7, 7a, 7b and a controller for controlling the pump units are not shown in detail.
  • various sensors e.g. for oxygen, pH value, lactate, TEER
  • the sensors can be connected to the control unit in order to regulate, for example, the composition and/or the shear rate or flow rate of the respective culture medium 7, 7a, 7b as a function of the measured values recorded.
  • FIG. 2 A second exemplary embodiment of a cell culture chamber 1 according to the invention with two first channels 3 and two second channels 4 (not visible) is shown in FIG. 2 in an exploded view.
  • the housing 2 is formed from an upper cover 2.1, a lower cover 2.2 and a middle piece 2.3 in the form of an injection molded piece.
  • the center piece 2.3 contains the formations of the channels 3 and 4, which are each separated from one another by an inserted membrane 8.
  • FIGS. 3a and 3b show the results of tests on the adsorption effect of PBT in two cell culture chambers 1 according to the invention of different designs.
  • Designation “Chip PBT-BC1” is a first version of the cell culture chamber 1 and "Chip PBT-BC2" designates a second version.
  • the first embodiment has a width B of 34.6 mm, a depth T of 6.56 mm and a height H of 0.7 mm.
  • the second channel 4 has the dimensions 44.8 mm, 3.6 mm and 0.8 mm (W/D/H).
  • the corresponding dimensions for the second version "Chip PBT-BC2" of the cell culture chamber 1 are 34.6 mm, 8.06 mm and 0.7 mm (W/D/H) for the first channel 3 and 49.4 mm, 5 .61 mm and 1.0 mm (W/D/H) for the second channel 4.
  • the graph in FIG. 3a shows the percentage (RTC—ratio to control) of propiconazole remaining and detectable in the culture medium 7 (logP 3.72) after an incubation time of 4 hours and after 24 hours.
  • a control in the form of a stock solution (100mM) with propiconazole is given for comparison.
  • the graph of Figure 3b shows the percentage of troglitazone remaining in culture medium 7 (logP 3.60).
  • samples were taken after 4 hours and after 24 hours of incubation, which were compared with a control in the form of a troglitazone stock solution (64 mM).
  • the two graphics show that in both versions of the cell culture chamber 1 according to the invention more than 85% of the propiconazole (FIG. 3a) or more than 80% of the troglitazone (FIG. 3b) are still detected in the culture medium 7 even after 24 hours could.
  • Figures 4 and 5 show the time courses of the release of LDH (lactate dehydrogenase; Fig. 4) and ASAT (aspartate aminotransferase; Fig. 5) from liver sinusoidal endothelial cells cultivated in a cell culture chamber 1 according to the invention over a period of 10 or 14 days Co-culture with macrophages and hepatocytes versus cell lysis.
  • LDH and ASAT are enzymes that are released when cells are damaged and are therefore suitable for assessing the vitality of an organ or of tissues and cells. A significantly lower release of LDH or ASAT by the cultured cells compared to cell lysis can be seen even after 14 days.
  • FIG. 6 the concentrations of albumin (Fig. 6) and urea (Fig. 7) of liver sinusoidal endothelial cells cultivated in a cell culture chamber 1 according to the invention over a period of 10 or 14 days in co-culture with macrophages and hepatocytes are compared shown for cell lysis.
  • Albumin and urea can be viewed as an expression of existing and intact synthesis processes in liver tissue or hepatocytes. It can be seen that concentrations of more than 1300 pg/l albumin or more than 0.7 mmol/l urea can be detected both in the 10-day cultures and in the 14-day cultures even after 10 or 14 days.
  • FIG. 6 the concentrations of albumin (Fig. 6) and urea (Fig. 7) of liver sinusoidal endothelial cells cultivated in a cell culture chamber 1 according to the invention over a period of 10 or 14 days in co-culture with macrophages and hepatocytes are compared shown for cell lysis.
  • LPS lipopolysaccharides
  • interleukin-10 IL-10; Fig. 9
  • interleukin-6 IL-6; Fig. 10

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Zellkulturkammer (1) zur in vitro-Herstellung und Kultivierung von Zellschichten und Organmodellen mit zwei übereinander angeordneten und durch eine poröse Membran (8) mit zwei Seitenflächen voneinander getrennten und durchströmbaren ersten und zweiten Kanälen (3, 4), wobei durch die Seitenflächen der Membran (8) jeweils ein Zellsubstrat (9, 10) gebildet ist. Gekennzeichnet ist die Zellkulturkammer (1) dadurch, dass mindestens die Innenwände der ersten und der zweiten Kanäle (3, 4) aus Polybutylenterephtalat (PBT) bestehen. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Kultivierung von humanen oder tierischen Zellen, insbesondere von Lebersinusoidalen Endothelzellen, allein und in Ko-Kultur mit Hepatozyten und Immunzellen.

Description

Zellkulturkammer und Verfahren zur Kultivierung von Zellen und zur in v/Yro-Herstellunq von
Zellschichten und Orqanmodellen
Die Erfindung betrifft eine Zellkulturkammer zur Kultivierung von Zellen und zur in vitro- Herstellung von Zellschichten als auch Organmodellen sowie ein Verfahren zur Kultivierung und zum verbesserten Funktionserhalt insbesondere von Lebersinusoidalen Endothelzellen (LSEC) allein als auch in Ko-Kultur mit leberspezifischen Zelltypen.
Aus dem Stand der Technik sind Vorrichtungen, insbesondere Zellkulturkammern, bekannt, die eine in vitro Kultur und Untersuchung von Zellkulturen unter perfundierenden Bedingungen erlauben. Dabei können die jeweiligen Zellkulturen mit Flüssigkeiten oder auch Gas- und Aerosolgemischen umspült bzw. inkubiert und somit Bedingungen simuliert werden, die den physiologischen Bedingungen in vivo sehr nahekommen. Außerdem eignen sich derartige Zellkulturkammern dazu, um Wirkungen und gegebenenfalls auftretende Wechselwirkungen zwischen einer oder mehreren Zellkulturen und einem Medium oder mehreren Medien sowie im Medium enthaltener Testsubstanzen zu untersuchen (z. B. in den Bereichen Pharmakokinetik (PK) und Pharmakodynamik (PD), Absorptions-, Distributions-, Metabolismus, Exkretions- und Toxikologie (ADMET)-Studien, Substanz-Sensitivitätstests und Substanz-Sicherheitstests).
Zellkulturkammern sind beispielsweise in der WO 2015/169287 A1 beschrieben. Diese umfassen zwei Kanäle, die durch eine poröse Membran voneinander getrennt sind. Als Material für solche Zellkulturkammern werden oft Kunststoffe eingesetzt, die biokompatibel sind und sich fertigungstechnisch zudem gut auch in komplexe Formen bringen lassen. Insbesondere sind solche Materialien für die Verarbeitung mittels verschiedener Spritzgusstechniken geeignet. Beispiele solcher Kunststoffe sind Polyurethane (PU), Polyimide, Styrene (SEBS), Polypropylene (PP), Polystyrene (PS), Polycarbonate (PC) und zyklische Polyolefine (COP und COC). Daneben werden Zellkulturkammern aus Polydimethylsiloxanen (PDMS) hergestellt und z. B. für die Kultur komplexer Zell-/ Organmodelle verwendet (z. B. WO 2017/096282 A1, WO 2019/164962 A1). Die Anwendung PDMS-basierter Chips für komplexe Zell-/Organmodelle gestaltet sich jedoch aufwändig, da das PDMS im Gegensatz zu biokompatiblen, spritzgussfähigen Kunststoffen vorher zwingend aktiviert werden muss, um überhaupt für Zellkulturen geeignet zu sein. Dies erfolgt zum Beispiel durch das Einbringen von Aktivierungslösungen in Verbindung mit UV- Bestrahlung und mehreren Waschschritten. Diese Vorabprozeduren sind nicht in jedem Labor beim Endanwender problemlos durchführbar und bergen ein gewisses Fehlerpotential vor dem Start der eigentlichen Zellkultur.
Um die zu untersuchenden Systeme aus Zellkulturen und Medien so wenig wie möglich zu beeinflussen, sollten die Materialien der Zellkulturkammern im Idealfall inert sein. Allerdings ist beispielsweise von dem häufig verwendeten Material PDMS bekannt, dass dieses gegenüber einigen chemischen Verbindungen hohe Bindekapazitäten aufweist (Auner et al. , (2019): Chemical-PDMS-binding kinetics and implications for bioavailability in microfluidic devices; Lab Chip 19: 864-874). Derartige Bindekapazitäten können einen schwer abzuschätzenden Einfluss auf Untersuchungen haben, die mit aus PDMS bestehenden Zellkulturkammern durchgeführt werden. So adsorbieren z. B. Substanzen mit einem logP größer 1 ,8 und einem Hydrogen donor count von 0 stark an PDMS, was eine Wirkstofftestung und die Interpretation der erhaltenen Daten erheblich erschwert. Beispielsweise besitzt die Substanz Propiconazol einen logP von 3,72 und einen sogenannten Hydrogen donor count von 0. Es ist sehr hydrophob und kann in PDMS-Chips nach 24 Stunden nur noch mit weniger als 30% der Ausgangskonzentration im Kulturmedium nachgewiesen werden, da es irreversibel an PDMS bindet (Auner et al. 2019).
Der hier dargelegten Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine verbesserte Zellkulturkammer und deren Verwendung vorzuschlagen, mittels denen die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile reduziert werden.
Die Aufgabe wird mit den Gegenständen der unabhängigen und nebengeordneten Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstände der abhängigen Ansprüche.
Die Aufgabe wird mit einer Zellkulturkammer zur Kultivierung von Zellen und in vitro- Herstellung von Zellschichten und Organmodellen gelöst. Die erfindungsgemäße Zellkulturkammerweist mindestens zwei übereinander angeordnete und durch eine poröse Membran mit zwei Seitenflächen voneinander getrennte und durchströmbare Kanäle auf, wobei durch die Seitenflächen der Membran jeweils ein Zellsubstrat gebildet wird.
Gekennzeichnet ist die Vorrichtung dadurch, dass mindestens die Innenwände des ersten und des zweiten Kanals aus Polybutylenterephthalat (PBT) bestehen.
PBT ist ein Polymer, das zur Herstellung von Produkten verwendet wird, die einer hohen mechanischen Belastung unterliegen und/oder die wiederholt mit heißen Medien in Kontakt gelangen. Typische Verwendungen von PBT sind beispielsweise Gleitlager, Ventilteile, Schrauben, Teile für Haushaltsgeräte wie Kaffeemaschinen, Eierkocher, Toaster oder Haartrockner. PBT ist für die Spritzguss-Verarbeitung sehr gut geeignet. Dieses für die Verwendung in Zellkulturkammern ungewöhnliche Material zeigte in Versuchen sehr geringe Bindekapazitäten gegenüber einer Reihe von Bestandteilen der verwendeten Medien, so dass ein Einfluss des Materials der Zellkulturkammer auf die in einer solchen Zellkulturkammer erfolgenden Untersuchungen vorteilhaft reduziert werden kann. So haben die Erfinder in Tests zur Wirkstoffadsorption unter anderem mit Propiconazol und Troglitazon gefunden, dass PBT für Wrkstofftestungen von Substanzen bis zum logP von 3,72 (logP Propiconazol: 3,72; logP Troglitazon: 3,60) sehr gut geeignet ist. Nach einer Inkubationsdauer von 24h sind mindestens 80% der Ausgangskonzentration des Propiconazols bzw. des Troglitazons im Kulturmedium nachweisbar (vergleiche Fig. 3a,
Fig. 3b).
Die erfindungsgemäße Zellkulturkammer kann für die Kultivierung von Zellkulturen und Organmodellen sowie für deren Untersuchung (z. B. eine Echtzeit-Beobachtung über optische Lösungen, wie Mikroskopie) verwendet werden. Dabei können die Zellkulturen/Organmodelle mit Medien definierter Zusammensetzung unter ebenfalls bekannten und gegebenenfalls regelbaren Umgebungsbedingungen (z. B. Temperatur, Luftdruck, Flussrate und Scherstress, relative Ausrichtung der Zellkulturkammer, Sauerstoff, pH-Wert) versorgt werden. Vorteilhaft kann die Zellkulturkammer auch zur Kultivierung von wenigstens zwei verschiedenen Zelltypen verwendet werden. Die Kultivierung von wenigstens zwei verschiedenen Zelltypen wird hierin auch als Ko-Kultur oder Ko-Kultivierung bezeichnet. Eine solche Ko-Kultur kann für eine weitere Annäherung der Modellumgebung an in wVo-Bedingungen sorgen. Eine solche Ko-Kultur von wenigstens zwei verschiedenen Zelltypen in der Zellkulturkammer etabliert im Sinne der Erfindung ein Organmodell.
Eine spezifische Verwendung der erfindungsgemäßen Zellkulturkammer besteht darin, sogenannte Lebersinusoidale Endothelzellen (liver sinusoidal endothelial cells; LSEC) zu kultivieren und bei Bedarf zu untersuchen. Vorteilhaft können die LSEC in der Zellkulturkammer auch in Ko-Kultur mit weiteren Leberzellen, wie insbesondere Hepatozyten, Kupffer-Zellen/Makrophagen und/oder Stellat-Zellen, kultiviert werden. LSEC, allein und in Ko-Kultur mit weiteren Leberzellen, sind ein wichtiges Testsystem für die Untersuchung einer Vielzahl von Funktionen und Wechselwirkungen der Leber als einem der zentralen Stoffwechselorgane des Körpers, insbesondere von Säugetieren. Allerdings ist die Kultivierung dieser LSEC allein als auch in Ko-Kultur mit weiteren Leberzellen sehr anspruchsvoll. Es soll nachfolgend ein kurzer Überblick gegeben werden.
Lebersinusoidale Endothelzellen sind spezialisierte Endothelzellen der Leber, die sich durch das Fehlen einer ausgeprägten Basalmembran und das Vorhandensein kleiner offener Poren, Fenestrae genannt, auszeichnen. Die einzigartige durchlässige Struktur der LSEC ermöglicht dem Blutplasma den freien Zugang zum zwischen den LSEC und den Hepatozyten befindlichen Disse-Raum. Dadurch können Hepatozyten kleine Moleküle, z. B. Nährstoffe, austauschen, ohne dass ein direkter Kontakt mit dem Blutstrom besteht. Zudem übernehmen LSEC im Körper spezifische Funktionen, wie die sogenannte Clearance von Makromolekülen, die Produktion von Gerinnungsfaktoren und das Adhärieren von Immunzellen, z. B. bei Leberschädigung. Weiterhin zeichnen diese sich durch spezifische Marker, wie beispielsweise Faktor VIII, Stabilin-2, LSECtin und CD32b (siehe Tabelle 1), aus. Es wird vermutet, dass LSEC direkt an der medikamenteninduzierten Lebertoxizität beteiligt sind, weshalb sie interessant für tiefergehende Wirkstoff-Testungen sind.
Tabelle 1: Bekannte Lebersinusoidale Endothelzell-Marker und deren Funktion
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Besondere Anforderungen bei der Verwendung der LSEC als Modellsystem sind durch den Umstand bedingt, dass die LSEC gemeinhin nach Isolation innerhalb von wenigen Stunden bis Tagen ihre Funktionalität und spezifischen Marker (siehe Tabelle 1) verlieren. Sie sind dann beispielsweise nicht mehr oder nur noch bedingt zur Überprüfung der Toxizität von Wirkstoffen, z. B. bei der Überprüfung des Beitrages der Immunzellen zur Hepatotoxizität, geeignet. Die Erfindung schlägt Lösungen vor, mittels denen die Funktionalitäten von LSEC allein und in Ko-Kultur mit weiteren leberspezifischen Zelltypen erheblich länger erhalten werden können. Dazu können beispielsweise die Kanäle derart ausgebildet sein, dass in dem ersten Kanal vaskuläre Bedingungen eines Blutgefäßes unter Zuhilfenahme von LSEC nachgebildet werden können. Die LSEC können allein oder in Ko-Kultur mit weiteren Zellen, insbesondere Kupffer-Zellen, kultiviert werden.
Kupffer-Zellen, die residenten Makrophagen der Leber, sind in vivo im hepatischen Sinusoid lokalisiert, wodurch sie eine Überwachungsfunktion ausüben, indem sie die Leber in die Lage versetzen, auf Pathogene und Schäden zu reagieren. Kupffer-Zellen sind in der Lage, eine beispielsweise durch Wirkstoffe hervorgerufene Entzündung oder phänotypische Veränderungen präzise zu regulieren, was zu einer unterschiedlichen Expression und Sekretion von pro- oder anti-entzündlichen Mediatoren (z. B. I L- 1 ß , TNF, IL-6, IL-10) führt. Diese kritische Regulierung der Entzündungsreaktion macht sie zu einem wichtigen Bestandteil von in wfro-Modellen von Lebererkrankungen sowie von in w ro-Screening- Modellen für Medikamententoxizität, die durch entzündungsbedingte Herabregulation von Medikamenten-metabolisierenden Enzymen und/oder Medikamententransportern entsteht. Kupffer-Zellen/Makrophagen spielen dadurch eine essenzielle Rolle bei der Entwicklung von Nebenwirkungen von Substanzen/Wirkstoffen. In der Leber regulieren Kupffer- Zellen/Makrophagen zusammen mit LSEC die Immunantwort. Sie spielen z. B. eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) und der Nichtalkoholischen Steatohepatitis (NASH). Es gibt zudem Hinweise darauf, dass Kupffer- Zellen bei einigen Medikamenten die Leber vor Wrkstoff-induzierter Leberschädigung (Drug induced liver injury, DILI) schützen, indem sie hepatoprotektive Zytokine, einschließlich IL-10 und IL-6, freisetzen. Bei anderen Medikamenten wurde gezeigt, dass Kupffer-Zellen durch die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen, einschließlich TNF, I L-1 ß und IL-6, die je nach Kontext entweder schützend oder schädigend wirken können, wesentlich zur DILI beitragen. In einigen Fällen kann die Neigung eines Medikaments, DILI zu induzieren, in vitro nur dann aufgedeckt werden, wenn Kupffer-Zellen vorhanden und auf eine pro inflammatorische Reaktion ausgerichtet sind. Die erfindungsgemäße Zellkulturkammer bietet den großen Vorteil, dass Kupffer-Zellen zusammen mit LSEC unter physiologischen Bedingungen ko-kultiviert werden können. Gezielte in vitro DILI-Tests unter körpernahen Konditionen werden somit ermöglicht.
In dem zweiten Kanal können hepatische Bedingungen nachgebildet werden. Die hepatischen Bedingungen können beispielsweise unter Zuhilfenahme von Hepatozyten erzeugt werden. LSEC und Hepatozyten in Ko-Kultur können ein Organmodell einer Säugetier-Leber bilden. Die Hepatozyten können allein oder in Ko-Kultur mit weiteren Zellen, insbesondere Stellat-Zellen, kultiviert werden.
Stellat-Zellen (HSCs) sind im “ruhenden” Zustand als Speicher von Vitamin A und als antigen-präsentierende Zellen in der Leber beschrieben. Eine Aktivierung der Stellat-Zellen ist der kritische Schritt zur Entwicklung einer Leberfibrose. Er geht einher mit dem Verlust der Vitamin A Speicherung und führt unter der Stimulation von zellulären Mediatoren, Zytokinen und Chemokinen aus verletzten oder entzündlichen Zellen, zur Transdifferentiation. Im Anfangsstadium der Fibrogenese verwandeln sich HSCs in proliferative und kontraktile Myofibroblasten. Diese beschleunigen die Sekretion von extrazellulärer Matrix und vermindern den Abbau der extrazellulären Matrixelemente, was schließlich zur Fibrogenese führt. Zusammen mit den Kupffer-Zellen leisten sie einen signifikanten Beitrag zur Entwicklung von NAFLD, NASH und Leberfibrose. Die Ko-Kultur von Stellat-Zellen mittels der erfindungsgemäßen Zellkulturkammer kann beispielsweise das Studium der Mechanismen der Fibrogenese ermöglichen, insbesondere durch Tests von potentiell beteiligten Mediatoren oder Signalmolekülen.
Die poröse Membran zwischen dem ersten und dem zweiten Kanal wird vorteilhaft mit einer Dicke aus einem Bereich von 10 bis 20 pm, insbesondere aus einem Bereich von 10 bis 13 pm, ausgewählt. Beispielsweise weist die Membran eine Dicke von 12 pm auf. Eine Membrandicke oberhalb von 20-50 pm erschwert den Stoff- und löslichen Faktor-Austausch zwischen der vaskulären und der hepatischen Kammer. Zudem wird ein Einwandern von Immunzellen in das Lebergewebe durch hohe Membrandicken erschwert und beeinflusst die Ergebnisse aus Wirkstofftestungen negativ. Die Membran kann bevorzugt aus einem rigiden Material, wie Polyethylenterephtalat (PET), bestehen. Alternativ kann die Membran auch aus einem flexiblen Material, wie einem thermoplastischen Elastomer (TPE) oder einem elastischen Polyurethan (TPU), bestehen. In diesen Fällen kann die Membran mit einer Dicke von 10 bis 75 pm, bevorzugt 10 bis 50 pm, ausgeführt sein. Die Porengröße der Membran liegt vorteilhaft in einem Bereich von 0,4 pm bis 8 pm. Es hat sich gezeigt, dass Porengrößen von mehr als 3 pm, beispielsweise 5 pm, 6 pm, 7 pm oder 8 pm den Austausch an löslichen Faktoren und das Einwandern von Immunzellen in den hepatischen Kanal erleichtern. Die Membran kann eine zusätzliche Oberflächenstrukturierung aufweisen, die beispielsweise durch Laserstrukturieren erzeugt werden kann. Eine solche Strukturierung kann vorteilhaft zur Manipulation von Zellwachstum und/oder zur Manipulation der strömungsmechanischen Eigenschaften der Membran (beispielsweise um vorbestimmte Flussprofile zu etablieren) eingestellt sein.
Ferner können die Membran und/oder die Kanäle beispielsweise mit Sauerstoffplasma plasmabehandelt sein. Unpolare Werkstoffe, v. a. Kunststoffe mit langen Polymerketten, besitzen eine sehr niedrige Oberflächenenergie (i.d.R. 20-40 mN/m; zum Vergleich PDMS nur 20 mN/m), die nicht mit der hohen Oberflächenspannung von wässrigen Flüssigkeiten, wie sie regulär in der Zellkultur Vorkommen, übereinstimmt. Polare Werkstoffe wie zum Beispiel PET (44 mN/m) und PBT (48 mN/m) liegen leicht darüber. Die Oberflächenenergie von Kunststoffen besteht aus einem dispersen und einem polaren Anteil. Vor allem der polare Anteil der Oberflächenenergie ist sehr gering. Durch die Plasmabehandlung wird die Oberflächenenergie bedeutend heraufgesetzt (insgesamt bis zu 80-90 mN/m), vor allem deren polarer Anteil. Zusätzlich werden die Oberflächen von eventuell vorhandenen Trennmitteln befreit und funktionalisiert. Bei diesem Prozess entstehen durch die Behandlung mit Sauerstoffplasma reaktive Sauerstoffspezies, welche Polymerbindungen aufbrechen und angreifbar für chemisch-biologische Wechselwirkungen machen oder zusätzliche Hydroxygruppen in das PBT-Polymer einfügen. Hierdurch wird die Membran- und/oder Kanal-Oberfläche hydrophiler, was in einer verbesserten Beschichtbarkeit mit biologischen Komponenten (wie Kollagen, Fibronektin, Laminin), einer verbesserten Zelladhäsion und einer deutlichen Reduktion der Adsorption von hydrophoben Substanzen resultiert.
Der Plasmabehandlung kann ein Reinigungsschritt vorgelagert sein, indem die Zellkulturkammer für beispielsweise 10 min in Isopropanol oder Ethanol inkubiert wird. Die eigentliche Plasmabehandlung der getrockneten Kammern kann insbesondere im Niederdruckplasmaverfahren erfolgen. Dafür werden die (gereinigten) Zellkulturkammern in eine Vakuumkammer aus z. B. Borosilikatglas gestellt und bei Niederdruck von <100 Pa (< 1 mbar) für bis zu 20 min mit Sauerstoffplasma behandelt. Das Sauerstoffplasma kann durch Kurzwellenanregung mit einem Hochfrequenzgenerator bei 13,56 MHz und bis zu 200 W Leistung erzeugt werden.
Der erste und der zweite Kanal sind in einem vorteilhaften Betriebszustand der Zellkulturkammer übereinander angeordnet. Das bedeutet, dass der erste Kanal bezüglich der Schwerkraftwirkung oberhalb des zweiten Kanals angeordnet ist. Eine solche Anordnung erleichtert beispielsweise die Beobachtung der Zellen mittels eines inversen Mikroskops, sodass oberhalb der Zellkulturkammer der erforderliche Freiraum zum Manipulieren der Zellkulturkammer erhalten bleibt. Inbegriffen in dieses Verständnis sind auch Ausgestaltungen der Zellkulturkammer, bei denen der erste Kanal bis zu 60° gegenüber der Wirkrichtung der Schwerkraft geneigt über dem zweiten Kanal angeordnet ist, was beispielsweise durch eine schräge Anordnung der Membran zwischen dem ersten und zweiten Kanal erreicht werden kann, sowie Betriebslagen der Zellkulturkammer, die bis zu 60° gegenüber der Wirkrichtung der Schwerkraft geneigt sind.
Die Erfindung stellt ein Modellsystem bereit, in dem unter spezifischen, körperähnlichen Kulturbedingungen insbesondere humane LSEC, allein und in Ko-Kultur mit weiteren leberspezifischen Zelltypen, für mindestens 4 Tage, insbesondere für bis zu 14 Tage, sowohl ihre Marker als auch ihre funktionalen Eigenschaften erhalten bleiben. So ist die Expression der folgenden LSEC-Marker im Modellsystem bis zu 14 Tage nachweisbar: CD31, CD206, vWf, Faktor VIII, LSECtin, L-SIGN, LYVE-1, Stabilin-2, VAP-1, FcRn, MHC I und MHC II. Dieser Fortschritt wird neben der Materialbeschaffenheit des PBT durch weitere optionale Verbesserungen erreicht. So kann in einer Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mindestens eine Seitenfläche der Membran mit einem Gemisch beschichtet sein, welches Fibronektin und/oder Kollagen I und/oder Kollagen IV enthält. Der Begriff „beschichtet“ schließt ein, dass das Fibronektin und/oder Kollagen I und/oder Kollagen IV chemisch (kovalent oder nichtkovalent) an die Membran gebunden ist/sind. Dabei liegt das Fibronektin in einer Konzentration von 0,5 bis 5 pg/ml, das Kollagen I in einer Konzentration von 100 bis 300 pg/ml und das Kollagen IV in einer Konzentration von 100 bis 300 pg/ml vor. Die Beschichtung kann in weiteren Ausführungsbeispielen auf beiden Seitenflächen der Membran vorhanden sein. Für bestimmte Verwendungen kann es vorteilhaft sein, wenn kein Kollagen I enthalten ist, da dieses beispielsweise bei Fibrose vermehrt in der Leber gebildet wird und damit keinen typischen physiologischen Zustand repräsentiert.
Es ist in weiteren Ausführungen der Erfindung möglich, dass an mindestens eine der Seitenflächen der Membran Dextran- Ketten gekoppelt sind, an denen Fibronektin-Peptide oder RGD-Peptide oder Vitronectin-Peptide oder Bone-Sialoprotein-Peptide mit RGD- Sequenz (Arginin-Glycin-Asparaginsäure) gebunden sind. Die RGD-Sequenz dient insbesondere der Vermittlung der Zelladhäsion.
Es ist auch möglich, dass an mindestens eine der Seitenflächen der Membran Heparin- Ketten gekoppelt sind, an denen Fibronektin-Peptide oder FGF-Peptide mit RGD-Sequenz oder RGD-Peptide allein oder Vitronectin-Peptide mit RGD-Sequenz oder Bone-Sialoprotein- Peptide mit RGD-Sequenz gebunden sind. FGF-Peptide sind Peptide des Fibroblasten Wachstumsfaktors (fibroblast growth factor).
Liegt eine zuvor genannte Beschichtung der Membran vor, können die LSEC folgende Marker bis zu 14 Tage im Modellsystem aufweisen: CD32b, CD31, vWf, Faktor VIII, LSECtin, L-SIGN, Stabilin-2, VAP-1, LYVE-1, FcRn, MHC I und MHC II.
Die erfindungsgemäße Zellkulturkammer kann in einem Verfahren zur Kultivierung von humanen oder tierischen Zellen, wie beispielsweise Zellen der Maus, der Ratte, des Schweins oder des Hunds, etc. verwendet werden.
Bei diesem Verfahren wird durch mindestens einen der Kanäle permanent oder temporär ein Kulturmedium gefördert.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Zellen vorzugsweise auf einer apikalen Seite der Membran kultiviert. In dem hierin gemeinten Sinn bedeutet „apikal“, dass die Zellkultur von dem Kulturmedium auf der Seite umspült wird, die der Membran zugewandt ist. Insbesondere ist dies die nach oben, also der Erdanziehungskraft entgegen, gerichtete Seitenfläche der Membran. Apikal kultivierte Zellen wachsen also auf der Membranseite, die vom Kulturmedium umspült wird.
Das Kulturmedium kann jedoch auch basolateral mit der Zellkultur in Kontakt gebracht werden. Ein basolateraler Kontakt mit apikal kultivierten Zellen liegt demnach bei einem Kontakt via der porösen Membran vor.
Besonders bevorzugt kann die erfindungsgemäße Zellkulturkammer in einem Verfahren zur Kultivierung von LSEC verwendet werden. Die LSEC können allein oder in Ko-Kultur mit weiteren leberspezifischen Zelltypen kultiviert werden; eine Ko-Kultur mit weiteren leberspezifischen Zelltypen wird hierin als Lebermodell bezeichnet.
Für die Kultur von LSEC wird ein bevorzugt apikal in dem ersten Kanal anliegendes vaskuläres Kulturmedium (LSEC Medium; ECM) verwendet. Dieses kann ein basales Endothelzell-Grundmedium, wie M199 oder MCDB, umfassen, in dem 0-20% humanes Serum und/oder 0-20% FCS (fetal calf serum), 0-10 ng/ml HGF (hepatocyte growth factor), 0-10 ng/ml EGF (epidermal growth factor), 0-10 ng/ml bFGF (basic fibroblast growth factor), 0-20 ng/ml IGF-I, 0-5 ng/ml VEGF (vascular endothelial growth factor), 0-50 mM Hydrocortison, 0-5 mM Ascorbinsäure und/oder 0-4% ITS (Insulin/T ransferrin/Selenium) und Heparin (0-5U/ml) enthalten sind. Insbesondere zur Ko-Kultur mit Hepatozyten und/oder Stellat-Zellen kann ein bevorzugt basolateral in dem zweiten Kanal anliegendes hepatisches Grundmedium, wie Williams E Medium, genutzt werden, in dem 0-20% FCS (fetal calf serum) und/oder 0-20% humanes Serum, 0-5 mM -Glutamin oder Glutamax, 0-10 pg/ml Insulin, 0-4% MCB, 0-5 pM Dexamethason, 0-50 pM Hydrocortison und 0-5% DMSO enthalten sind. Das hepatische Kulturmedium kann mit Hepatozyten und/oder Stellat-Zellen angeimpft sein. Vorteilhaft kann das Kulturmedium frei von Zusätzen tierischen Ursprungs hergestellt sein. Natürlich ist es gleichwertig und ebenso möglich, umgekehrt vorzugehen und für die Kultur der LSEC das vaskulare Kulturmedium an den zweiten Kanal anzulegen und in dem ersten Kanal das hepatische Grundmedium.
Es hat sich erwiesen, dass die Funktionalität einer LSEC-Zellkultur verlängert werden kann, wenn diese in Ko-Kultur mit weiteren Zellen (wiederum sowohl apikal als auch basolateral) kultiviert wird. Dabei wirken sich insbesondere ko-kultivierte Zellen, wie Hepatozyten, Stellat- Zellen und Immunzellen, wie z. B. Kupffer-Zellen/ Makrophagen, im Vergleich zu Zellkulturen ohne Ko-Kultur vorteilhaft auf die Erhaltung der Funktionalitäten aus. Vorteilhaft ist hier, wenn die genutzten Zellen zum Aufbau des Lebermodells den identischen HLA (human leukocyte antigen)-Status aufweisen.
Vorteilhaft wird die Scherrate bzw. Flussrate des Kulturmediums in mindestens einem der Kanäle so gewählt, dass diese vergleichbar mit den im Körper auftretenden Scherraten ist. Beispielsweise werden in dem ersten Kanal vaskuläre Bedingungen (eines Blutgefäßes) nachgebildet. In dem zweiten Kanal können hepatische Bedingungen nachgebildet werden. Dies wird beispielsweise erreicht, indem durch den ersten Kanal ein apikales Kulturmedium mit einer am Lebersinusoid angelegten Scherrate ausgewählt aus einem Bereich von >0,2 bis 1 dyn/cm2, bevorzugt zwischen 0,5 und 0,8 dyn/cm2 und durch den zweiten Kanal ein basolaterales Kulturmedium mit einer Scherrate ausgewählt aus einem Bereich von größer Null bis 0,2 dyn/cm2 gefördert wird. Insbesondere bei einer Zellkultur mit LSEC wird die Scherrate in dem ersten Kanal besonders bevorzugt auf etwa 0,7 dyn/cm2 eingestellt, was den physiologischen vaskulären Bedingungen in der Leber entspricht. Die in dem zweiten Kanal eingestellte Scherrate vermeidet weitgehend ein ungewolltes Absetzen von z. B. transmigrierten Immunzellen in Richtung der Schwerkraftwirkung weg von der Membran und die Anhäufung von Stoffwechselendprodukten der Hepatozyten. Die Abmaße der Kanäle können diesbezüglich angepasst und daher unterschiedlich sein. Beispielsweise kann der zweite Kanal eine geringere Breite und/oder eine größere Höhe als der erste Kanal aufweisen. Natürlich ist es gleichwertig und ebenso möglich, umgekehrt vorzugehen und in dem ersten Kanal hepatische Bedingungen nachzubilden und in dem zweiten Kanal vaskuläre Bedingungen nachzubilden.
Der Sauerstoffgehalt im Kulturmedium, insbesondere im apikalen Medium, wird vorteilhaft auf einen Wert von 15% am Kanal-Einlass und 3 bis 5% am Kanal-Auslass eingestellt. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Zellkulturkammer sowie das verwendete Kulturmedium, die angegebenen Scherraten, eine Verschaltung zweier Kanäle einer Zellkulturkammer oder mehrerer Zellkulturkammern miteinander und gegebenenfalls die Einstellung von Hypoxie-Bedingungen z. B. durch Anordnung der Zellkulturkammer(n) in einem Hypoxie-Schrank, erlauben die Einstellung der genannten Sauerstoffgehalte.
Die erfindungsgemäße Zellkulturkammer kann in weiteren Verwendungen beispielsweise zur Kultivierung von Darmzellen, von Lungenzellen und/oder von Lungenbläschenzellen und in v/Yro-Herstellung von Zellschichten bzw. Organmodellen dieser Zelltypen benutzt werden.
Zur Etablierung eines Lebermodells kann die Membran in einem vorgelagerten Schritt mit Proteinen der extrazellulären Matrix beschichtet und apikal mit LSEC, bevorzugt in Ko-Kultur mit Kupffer-Zellen besiedelt werden. Insbesondere basolateral kann die Membran alternativ oder zusätzlich mit Hepatozyten, vorteilhaft in Ko-Kultur mit Stellat-Zellen, besiedelt werden. Ferner können dem apikalen Kulturmedium oder den Kulturmedien Immunzellen, wie beispielsweise Monozyten, Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen, Neutrophile, beigegeben und in die Zellkulturkammer eingespült werden. Dadurch ist es möglich, definierte Immunzell- Populationen über die apikale Seite zu perfundieren und den Einfluss dieser Immunzellen auf das Lebermodell zu überprüfen. Der Begriff „einspülen“ schließt ein, dass eingespülte Zellen durch die vaskuläre Kammer zirkulieren und an Oberflächen adhärieren können, d.h. sich auf der Endothelzellschicht oder der Membran ansiedeln können, insbesondere an oder in der Nähe von LSEC-Zellen.
Zur Etablierung eines Darmmodells kann die Membran in einem vorgelagerten Schritt mit Proteinen der extrazellulären Matrix beschichtet und bevorzugt apikal mit intestinalen Endothelzellen, bevorzugt in Ko-Kultur mit Immunzellen, besiedelt werden. Insbesondere basolateral kann die Membran alternativ oder zusätzlich mit Darm-Epithel- und/oder mit glatten Muskelzellen und/oder Immunzellen besiedelt werden. Ferner können dem Kulturmedium oder den Kulturmedien Immunzellen, wie beispielsweise Monozyten, Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen, Neutrophile, beigegeben werden. Die Darmmodelle können apikal wie basolateral mit Scherraten von 0-3 dyn/cm2 kultiviert werden. Zudem können dem basolateralen Kulturmedium Mikroorganismen (z. B. Teile des Mikrobioms) zugesetzt werden, um beispielsweise den Einfluss solcher Mikroorganismen auf das Darmmodell zu untersuchen.
Zur Etablierung eines Lungenmodells kann die Membran in einem vorgelagerten Schritt mit Proteinen der extrazellulären Matrix beschichtet und bevorzugt apikal mit pulmonalen Epithelzellen (z. B. small airway-Epithelzellen, alveolare Epithelzellen), bevorzugt in Ko- Kultur mit Immunzellen, besiedelt werden. Insbesondere basolateral kann die Membran mit pulmonalen Endothelzellen als auch in apikal/basolateral vertauschter Anordnung besiedelt werden. Ferner können dem Kulturmedium oder den Kulturmedien Immunzellen, wie beispielsweise Monozyten, Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen, Neutrophile, beigegeben werden. Die Lungenmodelle können apikal wie basolateral mit Scherraten von 0-2 dyn/cm2 kultiviert werden. Zudem können die Epithelzellen nach Erreichen hoher Konfluenz ohne Medium kultiviert werden, um eine Air-Liquid-Interphase, wie im Körper, auszubilden.
Um physiologische Wirkungen von Wrkstoffen oder Signalmolekülen oder Mikroorganismen etc. auf die kultivierten Zellen, Zellschichten oder Organmodelle mittels einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer zu untersuchen, können die kultivierten Zellen, Zellschichten oder Organmodelle mit Wrkstoffen oder Molekülen oder Mikroorganismen versetzt werden, indem diese in die Zellkulturkammer eingespült werden. Beispielsweise kann mit Erreichen eines gewünschten Besiedlungsstatus ein zu untersuchender Wrkstoff beziehungsweise mehrere zu untersuchende Wrkstoffe dem Kulturmedium oder einem anderen flüssigem Trägermedium in jeweils gewünschten Dosierungen apikal oder basolateral zugesetzt und die Zellkultur damit umspült (perfundiert) werden. Als Messwerte können beispielsweise Eigenschaften des aus dem jeweiligen Kanal austretenden Kulturmediums erfasst werden. Bei geeigneter Gestaltung der Zellkulturkammer und deren optischer Eigenschaften können mikroskopische Untersuchungen, beispielsweise direkte und/oder fluoreszenzbasierte Beobachtungen der adhärent an der Membran wachsenden Zellen und/oder der ko-kultivierten Zellen durchgeführt werden. Ebenso kann mit Signalmolekülen oder Mikroorganismen verfahren werden.
Ein großer Vorteil der Erfindung ist die Möglichkeit der Nachgestaltung unterschiedlicher Bedingungen in den Kanälen. Insbesondere können in einem der beiden Kanäle die Bedingungen eines Blutgefäßes nachgebildet werden, was als vaskuläre Bedingungen bezeichnet werden kann. In Bezug auf die Membran kann dieser Kanal als vaskuläre Seite bezeichnet werden. In dem anderen Kanal können beispielsweise die Bedingungen in einem Lebergewebe nachempfunden werden, was als hepatische Bedingungen beziehungsweise in Bezug auf die Membran als hepatische Seite bezeichnet werden kann. Auf der hepatischen Seite, die insbesondere durch den unteren Kanal gegeben ist, wird mittels des Kulturmediums eine zwar geringe, aber hinreichend große Scherrate erzeugt, die ein unerwünschtes Absetzen von Zellen weg von der Membran erheblich reduziert. Die Kanäle der erfindungsgemäßen Zellkulturkammer weisen außerdem aufgrund ihrer Materialeigenschaften eine geringe Adsorption von Verbindungen auf, die in einem Kulturmedium enthalten sind. Vorteilhaft werden dadurch die Ergebnisse von Experimenten wenig beeinflusst.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels sowie anhand von Grafiken zu durchgeführten Versuchen noch weiter veranschaulicht. Dabei zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer mit zwei Kanälen und einer in Ko-Kultur besiedelten Membran;
Fig. 2 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer mit vier Kanälen in einer Explosionsdarstellung;
Fig. 3a eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines Versuchs zur Adsorptionswirkung von PBT in zwei erfindungsgemäßen Zellkulturkammern;
Fig. 3b eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines weiteren Versuchs zur Adsorptionswirkung von PBT in zwei erfindungsgemäßen Zellkulturkammern;
Fig. 4 eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines Versuchs zur Freisetzung von LDH (Lactatdehydrogenase) über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen im Vergleich mit einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer und den Bedingungen der Zelllyse;
Fig. 5 eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines Versuchs zur Freisetzung von ASAT (Aspartat-Aminotransferase) über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen im Vergleich mit einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer und den Bedingungen der Zelllyse; Fig. 6 eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines Versuchs zum Nachweis der Synthese und Freisetzung von Albumin über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen im Vergleich mit einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer und den Bedingungen der Zelllyse;
Fig. 7 eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines Versuchs zum Nachweis der Synthese und Freisetzung von Harnstoff über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen im Vergleich mit einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer und den Bedingungen der Zelllyse;
Fig. 8 eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines Versuchs zum Nachweis von lnterleukin-1 beta über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen im Vergleich mit einer Kultivierung in einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer und unter Zugabe von LPS;
Fig. 9 eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines Versuchs zum Nachweis von lnterleukin-10 über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen im Vergleich mit einer Kultivierung in einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer und unter Zugabe von LPS; und
Fig. 10 eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines Versuchs zum Nachweis von lnterleukin-6 über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen im Vergleich mit einer Kultivierung in einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer und unter Zugabe von LPS.
Eine erfindungsgemäße Zellkulturkammer 1 gemäß der Fig. 1 umfasst ein Gehäuse 2, das mindestens in den Bereichen eines ersten Kanals 3 und eines zweiten Kanals 4 aus Polybutylenterephthalat (PBT) besteht. Jeder der Kanäle 3, 4 weist einen Einlass 5 und einen Auslass 6 auf, die dem Zustrom beziehungsweise dem Ableiten eines Kulturmediums 7 in beziehungsweise aus den jeweiligen Kanälen 3, 4 dienen. Der erste Kanal 3 und der zweite Kanal 4 sind voneinander durch eine poröse Membran 8 getrennt. In dem ersten Kanal 3, der zugleich einen apikalen Bereich der Zellkulturkammer 1 darstellt, ist eine Zellkultur 9, beispielsweise aus Lebersinusoidalen Endothelzellen, auf einer dem ersten Kanal 3 zugewandten Seitenfläche der Membran 8, die als apikale Seite 8.1 der Membran bezeichnet wird, angesiedelt.
Auf einer dem zweiten Kanal 4 zugewandten Seitenfläche der Membran 8, die als basolaterale Seite 8.2 der Membran bezeichnet wird, ist eine optional vorhandene Ko- Kultur 10, die Hepatozyten enthält, angesiedelt. Die Membran 8 ist beispielsweise 12 pm dick und besteht aus PET.
Die Kanäle 3, 4 weisen jeweils eine Breite B, quer dazu eine Höhe H und eine nicht bezeichnete Tiefe senkrecht zur Zeichnungsebene auf. In einerweiteren Ausgestaltung der Erfindung werden in dem relativ zur Schwerkraftwirkung oben angeordneten ersten Kanal 3 vaskuläre Bedingungen beispielsweise eines Blutgefäßes nachgebildet, während in dem zweiten Kanal 4 hepatische Bedingungen nachgestellt werden.
Die Scherrate im Modell wird für die vaskuläre Seite und die hepatische Seite eingestellt, indem durch den ersten Kanal 3 ein apikales Kulturmedium 7a mit einer Scherrate von 0,7 dyn/cm2 und durch den zweiten Kanal 4 ein basolaterales Kulturmedium 7b mit einer Scherrate von >0 bis 0,2 dyn/cm2 gefördert wird.
Die Beschichtung der Membran 8 besteht im Ausführungsbeispiel aus einem Gemisch von Fibronektin/ Kollagen I und Kollagen IV (Fibronektin 5pg/ml, Kollagen I 0,3mg/ml, Kollagen IV 100pg/ml). Eine Kultivierung der Zellkulturen 9, 10 erfolgt in zelltyp- und spezies-spezifischen Medien mit spezifischen Formulierungen. Das apikale Kulturmedium 7a des ersten Kanals 4 (ECM) enthält 10% humanes Serum sowie Wachstumsfaktoren, Antioxidantien und ITS in jeweils geeigneten und dem Fachmann geläufigen Konzentrationen. Das basolaterale Medium 7b des zweiten Kanals 4 enthält Wachstumsfaktoren, ein Kollagen IV/ 1 Gemisch sowie ITS jeweils in geeigneten und dem Fachmann geläufigen Konzentrationen.
Die Zugabe von spezifischen Medien von basolateraler Seite kann durch die Kultur von Hepatozyten und ggf. Stellat-Zellen in zellspezifischem Medium 7b in dem zweiten Kanal 4 ersetzt werden. Zudem haben auf apikaler Seite (erster Kanal 3) Makrophagen einen positiven Einfluss auf die Eigenschaften/Funktionalität der Zellkultur 9.
Nicht näher dargestellt sind eine Pumpeinheit je Kanal 3, 4 zur gesteuerten Förderung des jeweiligen Kulturmediums 7, 7a, 7b und eine Steuerung zur Ansteuerung der Pumpeinheiten. Zusätzlich können verschiedene Sensoren (z. B. für Sauerstoff, pH-Wert, Laktat, TEER) vorhanden sein, mittels deren Messwerten die Zellkulturen 9 und 10 untersucht werden können. Die Sensoren können mit der Steuereinheit verbunden sein, um beispielsweise die Zusammensetzung und/oder die Scherrate bzw. Flussrate des jeweiligen Kulturmediums 7, 7a, 7b in Abhängigkeit der erfassten Messwerte zu regulieren.
Ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer 1 mit zwei ersten Kanälen 3 und zwei zweiten Kanälen 4 (nicht sichtbar) ist in Fig. 2 in einer Explosionsdarstellung gezeigt. Das Gehäuse 2 wird aus einer oberen Abdeckung 2.1, einer unteren Abdeckung 2.2 und einem Mittelstück 2.3 in Form eines Spritzgussformstücks gebildet. Das Mittelstück 2.3 enthält die Ausformungen der Kanäle 3 und 4, die jeweils durch eine eingelegte Membran 8 voneinander getrennt werden.
Die Figuren 3a und 3b zeigen Ergebnisse von Versuchen zur Adsorptionswirkung von PBT in zwei erfindungsgemäßen Zellkulturkammern 1 unterschiedlicher Ausführung. Mit der Bezeichnung „Chip PBT-BC1“ ist eine erste Ausführung der Zellkulturkammer 1 und mit „Chip PBT-BC2“ eine zweite Ausführung bezeichnet. Die erste Ausführung weist für den ersten Kanal 3 eine Breite B von 34,6 mm, eine Tiefe T von 6,56 mm und eine Höhe H von 0,7 mm auf. Der zweite Kanal 4 besitzt die Maße 44,8 mm, 3,6 mm und 0,8 mm (B/T/H). Die entsprechenden Maße für die zweite Ausführung „Chip PBT-BC2“ der Zellkulturkammer 1 betragen 34,6 mm, 8,06 mm und 0,7 mm (B/T/H) für den ersten Kanal 3 und 49,4 mm, 5,61 mm und 1,0 mm (B/T/H) für den zweiten Kanal 4.
Die Grafik der Fig. 3a zeigt den prozentualen Anteil (RTC - ratio to control) von im Kulturmedium 7 verbliebenen und nachweisbaren Propiconazol (logP 3,72) nach einer Inkubationszeit von 4 Stunden und nach 24 Stunden. Im Vergleich ist eine Kontrolle in Form einer Stammlösung (100mM) mit Propiconazol angegeben. Die Grafik der Fig. 3b zeigt den prozentualen Anteil von im Kulturmedium 7 verbliebenen Troglitazon (logP 3,60). Auch im Beispiel der Fig. 3b wurden Proben nach 4 Stunden und nach 24 Stunden Inkubationszeit entnommen, die mit einer Kontrolle in Form einer Troglitazon-Stammlösung (64mM) verglichen wurden. Den beiden Grafiken ist jeweils zu entnehmen, dass in beiden Ausführungen der erfindungsgemäßen Zellkulturkammer 1 auch nach 24 Stunden noch mehr als 85% des Propiconazols (Fig. 3a) bzw. mehr als 80% des Troglitazons (Fig. 3b) im Kulturmedium 7 nachgewiesen werden konnten.
Die Figuren 4 und 5 zeigen die zeitlichen Verläufe der Freisetzung von LDH (Lactatdehydrogenase; Fig. 4) beziehungsweise von ASAT (Aspartat-Aminotransferase; Fig. 5) von in einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer 1 über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen kultivierten Lebersinusoidalen Endothelzellen in Ko-Kultur mit Makrophagen und Hepatozyten im Vergleich zur Zelllyse. LDH und ASAT sind Enzyme, die bei Zellschädigungen freigesetzt werden und sich daher zur Bewertung des Vitalitäts- Zustands eines Organs oder von Geweben und Zellen eignen. Zu sehen ist eine gegenüber der Zelllyse signifikant geringere Freisetzung von LDH beziehungsweise ASAT durch die kultivierten Zellen selbst nach 14 Tagen.
In den Figuren 6 und 7 sind die Konzentrationen von Albumin (Fig. 6) und Harnstoff (Fig. 7) von in einer erfindungsgemäßen Zellkulturkammer 1 über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen kultivierten Lebersinusoidalen Endothelzellen in Ko-Kultur mit Makrophagen und Hepatozyten im Vergleich zur Zelllyse gezeigt. Albumin und Harnstoff können als Ausdruck vorhandener und intakter Syntheseprozesse in Lebergewebe beziehungsweise Hepatozyten angesehen werden. Es ist zu erkennen, dass sowohl in den 10-Tages-Kulturen als auch in den 14-Tages-Kulturen auch nach 10 beziehungsweise 14 Tagen Konzentrationen über 1300 pg/l Albumin beziehungsweise mehr als 0,7 mmol/l Harnstoff nachgewiesen werden können. Die Fig. 8 zeigt die Ergebnisse eines Versuchs zum Nachweis von lnterleukin-1 beta ( I L- 1 b) über einen Zeitraum von 10 beziehungsweise 14 Tagen. Zusätzlich wurde in einige Proben am zehnten Tag und am vierzehnten Tag Lipopolysaccharide (LPS) zugegeben, um die Aktivierbarkeit von im Lebermodell enthaltenen Immunzellen (Makrophagen) zu überprüfen und es wurden die jeweiligen Reaktionen dargestellt. Die Zugabe von LPS, als sogenannter pyrogener Stoff, stellt einen im Fachgebiet üblichen Test auf Endotoxine dar. Immunzellen, wie Makrophagen, reagieren auf diesen Stimulus mit erhöhter Freisetzung an Zytokinen. Die Ergebnisse zeigen einen deutlichen Anstieg der Konzentration des IL-1beta nach der Zugabe von LPS. Daraus lässt sich ableiten, dass Makrophagen in Ko-Kultur mit den untersuchten Lebersinusoidalen Endothelzellen und Hepatozyten auch nach 10 beziehungsweise nach 14 Tagen in der Lage waren, auf ein Endotoxin mit einer Immunantwort zu reagieren. Dies ist wichtig, um Immunzell-vermittelte Nebenwirkungen von Wirkstoffen aufdecken zu können.
Im Grundsatz gleiche Ergebnisse werden für das lnterleukin-10 (IL-10; Fig. 9) und lnterleukin-6 (IL-6; Fig. 10) erhalten.
Bezuqszeichen
1 Zellkulturkammer
2 Gehäuse 2.1 obere Abdeckung
2.2 untere Abdeckung
2.3 Mittelstück
3 erster Kanal
4 zweiter Kanal 5 Kanal-Einlass
6 Kanal-Auslass
7 Kulturmedium
7a apikales Kulturmedium
7b basolaterales Kulturmedium 8 Membran
8.1 apikale Seite der Membran
8.2 basolaterale Seite der Membran
9 Zellkultur
10 Ko-Kultur B Breite
H Höhe

Claims

Patentansprüche
1. Zellkulturkammer (1) zur Kultivierung von Zellen und in wfro-Herstellung von Zellschichten und Organmodellen umfassend: einen ersten durchströmbaren Kanal (3); einen zweiten durchströmbaren Kanal (4); eine poröse Membran (8); wobei die beiden Kanäle (3, 4) übereinander angeordnet und durch die Membran (8) voneinander getrennt sind, die Membran (8) eine zu dem ersten Kanal (3) orientierte erste Seitenfläche und eine zu dem zweiten Kanal (4) orientierte zweite Seitenfläche aufweist, durch die Seitenflächen der Membran (8) jeweils ein Zellsubstrat (9, 10) gebildet ist, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens die Innenwände des ersten Kanals (3) und des zweiten Kanals (4) aus Polybutylenterephthalat bestehen.
2. Zellkulturkammer (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (8) eine Dicke, ausgewählt aus einem Bereich von 10 bis 75 pm, bevorzugt aus einem Bereich von 10 bis 50 pm, besonders bevorzugt aus einem Bereich von 10 bis 13 pm, aufweist.
3. Zellkulturkammer (1) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (8) aus Polyethylenterephtalat (PET) oder einem thermoplastischen Elastomer (TPE) oder einem elastischen Polyurethan (TPU) besteht.
4. Zellkulturkammer (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Seitenfläche der Membran (8) eine zusätzliche Oberflächenstrukturierung aufweist.
5. Zellkulturkammer (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Seitenfläche der Membran (8) und/oder wenigstens einer der Kanäle (3, 4) plasmabehandelt ist.
6. Zellkulturkammer (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Seitenfläche der Membran (8) mit einem Gemisch beschichtet ist, wobei das Gemisch Fibronektin, und/oder Kollagen I und/oder Kollagen IV enthält und das Fibronektin in einer Konzentration von 0,5 bis 5 pg/ml, das Kollagen I in einer Konzentration von 100 bis 300 pg/ml und das Kollagen IV in einer Konzentration von 100 bis 300 pg/ml vorliegt.
7. Zellkulturkammer (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass an mindestens eine der Seitenflächen der Membran (8) Dextran-Ketten gekoppelt sind, an denen Fibronektin-Peptide oder RGD-Peptide oder Vitronectin-Peptide oder Bone- Sialoprotein-Peptide mit RGD-Sequenz gebunden sind.
8. Zellkulturkammer (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass an mindestens eine der Seitenflächen der Membran (8) Heparin- Ketten gekoppelt sind, an denen Fibronektin-Peptide oder FGF-Peptide mit RGD-Sequenz oder RGD-Peptide allein oder Vitronectin-Peptide mit RGD-Sequenz oder Bone-Sialoprotein-Peptide mit RGD- Sequenz gebunden sind.
9. Zellkulturkammer (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass an mindestens eine der Seitenflächen der Membran (8) humanes Kollagen I und/oder humanes Kollagen IV mit einer Konzentration von jeweils mehr als 100 pg/ml gekoppelt ist.
10. Verfahren zur Kultivierung von humanen oder tierischen Zellen unter Verwendung einer Zellkulturkammer (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Zellen auf einer apikalen Seite (8.1) der Membran (8) kultiviert werden und in dem ersten Kanal (3) und/oder in dem zweiten Kanal (4) ein Kulturmedium (7) gefördert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Zellen auf einer basolateralen Seite (8.2) der Membran (8) kultiviert werden und in dem ersten Kanal (3) und/oder in dem zweiten Kanal (4) ein Kulturmedium (7) gefördert wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die kultivierten Zellen Lebersinusoidale Endothelzellen sind.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei in dem ersten Kanal (3) vaskuläre Bedingungen nachgebildet werden und in dem zweiten Kanal (4) hepatische Bedingungen nachgebildet werden, indem durch den ersten Kanal (3) ein apikales Kulturmedium (7a) mit einer Scherrate ausgewählt aus einem Bereich von >0,2 bis 1 dyn/cm2, insbesondere aus einem Bereich zwischen 0,5 und 0,8 dyn/cm2 und durch den zweiten Kanal (4) ein basolaterales Kulturmedium (7b) mit einer Scherrate ausgewählt aus einem Bereich von größer Null bis einschließlich 0,2 dyn/cm2 gefördert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei in dem zweiten Kanal (4) vaskuläre Bedingungen nachgebildet werden und in dem ersten Kanal (3) hepatische Bedingungen nachgebildet werden, indem durch den zweiten Kanal (4) ein apikales Kulturmedium (7a) mit einer Scherrate ausgewählt aus einem Bereich von >0,2 bis 1 dyn/cm2, insbesondere aus einem Bereich zwischen 0,5 und 0,8 dyn/cm2 und durch den ersten Kanal (3) ein basolaterales Kulturmedium (7b) mit einer Scherrate ausgewählt aus einem Bereich von größer Null bis einschließlich 0,2 dyn/cm2 gefördert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem durch mindestens einen der Kanäle (3, 4) ein Kulturmedium (7) gefördert wird, wobei der Sauerstoffgehalt in dem Kulturmedium (7) an einem Einlass (5) des Kanals (3, 4) auf einen Wert von 15% eingestellt wird und an einem Auslass (6) des Kanals (3, 4) auf einen Wert zwischen 3% und 5% eingestellt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, bei dem die Lebersinusoidalen Endothelzellen mit Kupffer-Zellen und/oder Hepatozyten und/oder Stellat-Zellen ko-kultiviert werden.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die kultivierten Zellen intestinale Endothelzellen und/oder intestinale Epithelzellen und/oder intestinale glatte Muskelzellen sind.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die kultivierten Zellen pulmonale Epithelzellen und/oder pulmonale Endothelzellen sind.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 19, bei dem ein Wirkstoff und/oder ein
Signalmolekül in die Zellkulturkammer eingespült wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 20, bei dem Immunzellen und/oder Mikroorganismen in die Zellkulturkammer eingespült werden.
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