DE60221938T2 - Bereitstellungsverfahren eines Substrats mit gebrauchsfertiger, gleichmässig verteilter extrazellulärer Matrix - Google Patents

Bereitstellungsverfahren eines Substrats mit gebrauchsfertiger, gleichmässig verteilter extrazellulärer Matrix Download PDF

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DE60221938T2
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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf ein Verfahren zur Herstellung eines einzigartigen Zellkulturmediums. Insbesondere bezieht sich diese Erfindung auf ein Verfahren zum Extrahieren von Flüssigkeit aus einer Zellkulturapparatur, die eine an ein Substrat geheftete, gleichmäßig verteilte extrazelluläre Matrix beinhaltet.
  • 2. Stand der Technik
  • Das Netzwerk von faserigen und globulären Proteinen, das zwischen Zellen liegt, wird extrazelluläre Matrix (ECM) genannt. Die ECM ist eine lebenswichtige Komponente der zellulären Umgebung. Verschiedene ECM-Komponenten werden von Zellen sezerniert und bilden eine interstitielle Matrix und Basalmembran, das Gerüst, an dem Zellen in vivo verankert sind. Diese Strukturen sorgen für eine räumliche Orientierung und die für die Organisation und Entwicklung einer gewebespezifischen Histologie erforderliche Stabilität. Die ECM ist nicht nur ein inertes Gerüst, sondern ein wesentlicher Mitspieler bei der Regulation des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung. Die ECM sorgt für ein Milieu, das eine Schlüsselrolle bei der Regulation von zellulären Funktionen während normaler pathologischer Remodellierungsvorgänge, wie Embryonalentwicklung, Gewebereparatur, Entzündung, Tumorinvasion und Metastase, spielt. Zum Beispiel hat die ECM bekanntermaßen eine Funktion bei der Induktion, Maskierung, Speicherung und Präsentation von Wachstumsfaktoren.
  • In Anbetracht der Tatsache, dass die ECM eine lebenswichtige Komponente der zellulären Mikroumgebung ist, bauen immer mehr Forscher die extrazelluläre Matrix in ihre Zellkultursysteme ein. Die Verwendung einer ECM in vitro liefert Zellen unter Bedingungen, die ihren physiologischen Umgebungen in vivo stärker angenähert sind. Die ECM sorgt für Zellen mit mechanischem Halt und beeinflusst ihr Verhalten, indem sie für biochemische Signale sorgt, die Zellen über Zelloberflächenrezeptoren beeinflussen.
  • Die Basalmembran ist ein spezieller Typ von extrazellulärer Matrix und besteht primär aus Laminin und Typ-IV-Collagen. Eine wohlbekannte Basalmembranmatrix, die aus dem Engelbreth-Holm-Swarm-Maustumor extrahiert wurde, wird unter dem Markennamen MATRIGEL® verkauft. Dieser Maustumor ist reich an Basalmembranproteinen. Die Hauptmatrixkomponenten sind Laminin, Collagen IV, Entactin und Heparansulfat-Proteoglycan, und sie enthält auch Wachstumsfaktoren, Matrix-Metalloproteinasen (MMPs [Collagenasen]) und andere Proteinasen (Plasminogen-Aktivatoren) sowie mehrere undefinierte Verbindungen, aber sie enthält keine nachweisbaren Mengen an Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen (TIMPs). Bei Raumtemperatur geliert MATRIGEL®-Matrix unter Bildung einer rekonstituierten Basalmembran und ähnelt in ihrer Struktur, Zusammensetzung, physikalischen Eigenschaft und Fähigkeit ähnlich und behält so funktionelle Merkmale bei, die typisch für Basalmembranen in vivo sind.
  • Mehrere Verfahren wurden entwickelt, bei denen MATRIGEL®-Matrix verwendet wird, um die Invasion der Basalmembranmatrix durch Tumorzellen in vitro zu untersuchen. Typischerweise beinhalten diese Verfahren die Beschichtung der mikroporösen Membranen von Zellkultureinsätzen mit MATRIGEL®-Matrix. Herkömmliche Techniken zur Herstellung eines ECM-haltigen Zellkultursystems umfassen zuerst das Erwärmen einer kalten neutralisierten Lösung von löslichem Collagen zum Induzieren der Polymerisation und Fällung von nativen Fibrillen. Durch Inkubieren der MATRIGEL®-Matrix bei einer erhöhten Temperatur von über 4 °C wird die Matrix polymerisiert.
  • Während amorphe, chemisch vernetzte und alkalidenaturierte Collagenfilme zur Verwendung in Zellkulturen häufig getrocknet werden, um die Lagerbeständigkeit zu verbessern und die Notwendigkeit der Herstellung des Zellkultursubstrats vor jeder Verwendung zu vermeiden, werden Zellkultursubstrate, die natives fibrilläres Collagen enthalten, hergestellt und nur in Form von festen, adhärenten Gelen von nativen Fibrillen verwendet. Wie oben erwähnt, werden diese Gele am häufigsten dadurch produziert, dass man eine kalte neutralisierte Lösung von löslichem Collagen erwärmt und dadurch eine Polymerisation und Fällung nativer Fibrillen induziert. Sie werden jedoch nicht für die Lagerung getrocknet, da frühere Versuche, die nativen fibrillären Collagen-Gele kollabieren zu lassen und zu trocknen, zum Verlust der nativen Struktur, einer suboptimalen Faserbildung und schlechten Permeabilitätsmerkmalen führten. Zellkultursubstrate aus nativem fibrillärem Collagen müssen daher unmittelbar vor der Verwendung hergestellt werden. Dadurch erhöhen sich die Arbeit und der Aufwand, die mit Studien verbunden sind, bei denen Zellkulturen mit nativem fibrillärem Collagen beteiligt sind. Es besteht also ein Bedürfnis nach einem Zellkultursubstrat, das ein natives fibrilläres Collagen enthält, wie solche, die man in MATRIGEL®-Matrix findet, und das lange vor der beabsichtigten Verwendung in einer Fabrik hergestellt werden kann.
  • Herkömmliche Verfahren zur Herstellung einer Zellkulturapparatur, die natives fibrilläres Collagen enthält, entfernen wünschenswerterweise in der Matrix enthaltene Flüssigkeit unmittelbar vor der Verwendung, und nachdem das Gel polymerisiert ist. Zu den herkömmlichen Verfahren zur Entfernung der Flüssigkeit aus einer ECM gehören das Trocknen an der Luft und das Trocknen bei erhöhten Temperaturen. Zu den üblichen Bedingungen des Trocknens bei erhöhter Temperatur gehören das schnelle Trocknen bei erhöhten Temperaturen mit einem trocknenden Luftstrom, das große Salzkristalle und eine stärker ausgeprägte Musterbildung der MATRIGEL®-Matrix fördert. Schnelles Trocknen der MATRIGEL®-Matrix führt zu einer schlechten Verteilung der eindringenden Zellen.
  • Herkömmliche Techniken zur Flüssigkeitsentfernung beinhalten auch das Legen der Unterseite der porösen Oberfläche auf ein absorbierendes Material während 3 Minuten bis über Nacht und/oder das Anlegen eines leichten Vakuums an die Unterseite der porösen Oberfläche. Die Entfernung der Flüssigkeit durch langsames Trocknen unter Bedingungen einer langsam abnehmenden Temperatur und ohne Luftstrom führte zu der gleichmäßigsten Beschichtung und somit zur gleichmäßigsten Verteilung der eindringenden Zellen. Zum Beispiel offenbaren Swiderek et al. ( US-A-5,731,417 ) Verfahren zur Herstellung von getrockneten Filmen aus nativem fibrillärem Collagen für die Zellkultur, die das Trocknen der Substrate an der Luft beinhalten.
  • Herkömmliche Trocknungsverfahren verschlechtern die Funktionalität der Zellkulturapparatur. Zum Beispiel führen herkömmliche Beschichtungs- und Trocknungsverfahren häufig zu einer ungleichmäßigen oder zerklüfteten Beschichtung, die zu einer ungleichmäßigen Zellinvasion führt, was sich durch die Bildung der verschiedenen Muster, wie intensive zentrale Flecken oder Ringe von eindringenden Zellen, bemerkbar macht. Infolgedessen ist das genaue Zählen der eindringenden Zellen unter dem Mikroskop sehr kompliziert. Außerdem ist die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen invasiven und nichtinvasiven Zellen erheblich vermindert. Zu den invasiven Zellen gehören HT-1080-Zellen, und zu den nichtinvasiven Zellen gehören NIH-3T3-Zellen. Daher ist ein Substrat aus verteiltem fibrillärem Collagen, wie eine MATRIGEL®-Matrix, wünschenswerterweise gleichmäßig und reproduzierbar.
  • US-A-5,891,558 beschreibt das Gefriertrocknen von Collagenbiopolymeren zur Herstellung von Collagenschäumen für Implantate.
  • Kurzbeschreibung der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, das eine getrocknete extrazelluläre Matrix beinhaltet und für die in-vitro-Kultur von Zellen entwickelt wurde. Insbesondere betrifft diese Erfindung ein Verfahren zum Versehen eines Zellkultursubstrats mit einer gebrauchsfertigen, gleichmäßig verteilten extrazellulären Matrix, umfassend: a) Auftragen von Komponenten der extrazellulären Matrix, die natives fibrilläres Collagen umfassen, auf einen Substratbereich, wobei das Substrat eine Membran mit einer Porengröße von 0,5 bis 30 μm ist; b) Inkubie ren der Komponenten der extrazellulären Matrix, so dass ihre Polymerisation ermöglicht wird; c) Gefrierenlassen der polymerisierten extrazellulären Matrix auf dem Substratbereich; d) Lyophilisieren der gefrorenen extrazellulären Matrix auf dem Substratbereich; e) Erwärmenlassen der lyophilisierten extrazellulären Matrix auf Raumtemperatur.
  • Das Verfahren der Erfindung liefert eine Zellkulturapparatur einschließlich einer Oberfläche, die dafür geeignet ist, Zellen darauf wachsen zu lassen, und einer Beschichtung von extrazellulärer Matrix auf der Oberfläche, wobei die Matrixbeschichtung das Polymerisationsprodukt einer Lösung von bioaktiven Proteinen umfasst, wobei innerhalb der Matrix vorhandene Flüssigkeit durch Lyophilisierung im Wesentlichen entfernt wird.
  • Die vorliegende Erfindung versucht die Mängel des Standes der Technik zu beheben, indem sie ein Verfahren beschreibt, das eine Zellkulturapparatur liefert, die eine extrazelluläre Matrix enthält, welche eine gleichmäßige Verteilung aufweist, über einen weiten Bereich von ECM-Konzentrationen effektiv ist, eine hochgradig gleichmäßige Tumorzellenmigration über die gesamte Zellkulturoberfläche ergibt, das Zählen der Zellen erleichtert und zwischen invasiven Tumorzellen und vermutlich nichtinvasiven Kontrollzellen unterscheidet. Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch eine Zellkulturapparatur, die eine extrazelluläre Matrix beinhaltet, welche lange vor der beabsichtigten Verwendung hergestellt wird.
  • Bevorzugte Ausführungsformen dieser Erfindung gehen aus den Unteransprüchen hervor.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine hochgradig gleichmäßige Beschichtung eines Substrats von Rand zu Rand mit einer extrazellulären Matrix bereit und ist über einen erheblich weiteren Konzentrationsbereich der extrazellulären Matrix als bei Herstellung mit herkömmlichen Flüssigtrocknungsverfahren effektiv. Die Gleichmä ßigkeit der Beschichtung ergibt eine hochgradig gleichmäßige Tumorzellmigration über die gesamte Oberfläche der extrazellulären Matrix im Gegensatz zu dem herkömmlichen Verfahren, bei dem eine Zellmigration in sehr ungleichmäßiger Weise in der Mitte der Membran stattfindet. Die gleichmäßige Migration erleichtert das Zählen der Zellen entweder durch manuelle Methoden oder durch Bildanalyse. Die lyophilisierte Beschichtung hat auch eine ausgeprägte Fähigkeit, zwischen invasiven Tumorzellen und vermutlich nichtinvasiven Kontrollzellen zu differenzieren.
  • Eine Zellkulturapparatur, die getrocknetes natives fibrilläres Collagen aufweist, kann in jedem der Zellkulturvorschriften und -verfahren, die in der Technik bekannt sind, anstelle von herkömmlichen Collagen-Zellkultursubstraten verwendet werden. Das Zellkultursubstrat aus nativem fibrillärem Collagen auf der porösen Oberfläche wird im Napf einer Gewebekulturplatte platziert, wobei sich die Unterseite der porösen Oberfläche in Kontakt mit einem geeigneten Kulturmedium befindet. Dies ermöglicht es dem Kulturmedium, durch die poröse Oberfläche zu fließen und in Kontakt mit dem Zellkultursubstrat zu kommen. Das Kulturmedium und andere Materialien, die darin vorhanden sein können, diffundieren durch das Zellkultursubstrat in Kontakt mit Zellen, die auf seiner Oberfläche ausgesät sind. Wegen der leichteren Handhabung kann das Zellkultursubstrat auf der mikroporösen Membran eines Zellkultureinsatzes hergestellt werden.
  • Nach dem Auftragen einer kalten extrazellulären Matrix auf eine poröse Oberfläche lässt man die Temperatur der kalten neutralisierten Collagenlösung sich auf 15 °C bis 40 °C erhöhen, um die Bildung von nativen Collagenfibrillen und -fasern einzuleiten. Für den Inkubationsschritt der vorliegenden Erfindung werden die Temperaturen wünschenswerterweise erhöht, vorzugsweise auf 37 °C, mit 5% Kohlendioxid in einer angefeuchteten Kammer. Während die Temperatur der Collagenlösung zunimmt, beginnen native Fibrillen auf der porösen Oberfläche zu polymerisieren und zu gelieren und beschichten dadurch deren Oberseite. Das Gel umfasst große, organisierte Collagenfasern mit den Streifenbildungen, die für natives Collagen charakteristisch sind, sowie eingeschlossener Flüssigkeit aus der Collagenlösung (interfibrilläre Flüssigkeit). Wünschenswerterweise dauert der Inkubationsschritt ausreichend lange, damit die extrazelluläre Matrix ein Gel bilden kann. Im Allgemeinen sind 0,5 bis 3 Stunden bei 37 °C ausreichend, um eine vollständige Polymerisation auf einer porösen Oberfläche, wie der Membran eines Zellkultureinsatzes, zu erhalten.
  • Nachdem das Collagen der extrazellulären Matrix polymerisiert ist, wird die interfibrilläre Flüssigkeit des polymerisierten Collagens wünschenswerterweise aus dem Gel gesaugt. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung sieht vor, dass die gelbeschichteten Einsätze bei einer Temperatur von nicht mehr als -30 °C gefrieren gelassen werden, bevor der Lyophilisierungsvorgang eingeleitet wird. Beschichtete Einsätze können in einem Lyophilisator gefrieren gelassen und dann über Nacht lyophilisiert werden, und während dieser Zeit lässt man den Lyophilisator sich auf Raumtemperatur erwärmen. Durch diesen Vorgang kollabiert das Gel auf der porösen Oberfläche und bildet eine dünne Membran aus nativen Collagenfasern und -fibrillen. Wünschenswerterweise wird ein gleichmäßiger Kuchen erhalten, der an der Membran des Einsatzes haftet.
  • Die Zellkultursubstrate aus nativem fibrillärem Collagen dieser Erfindung können als getrocknete Filme auf porösen Oberflächen produziert werden. Sie behalten wünschenswerterweise die native fibrilläre Collagenstruktur in getrockneter Form bei und haben daher die verbesserten Permeabilitätsmerkmale von gegossenen Collagen-Gelen und die Lagerbeständigkeit von amorphen oder vernetzten Collagenfilmen. Die getrocknete Membran kann für die Zellkultur gegebenenfalls von der porösen Oberfläche entfernt werden, aber es ist wegen des höheren strukturellen Halts und der leichteren Handhabung im Allgemeinen zu bevorzugen, das Zellkultursubstrat aus nativem fibrillärem Collagen auf seiner porösen Oberfläche zu verwenden. Zellen auf der oberen Oberfläche des Zellkultursubstrats können Medien, Wachstumsfaktoren und anderen Materialien ausgesetzt sein, indem diese durch die Unterseite der porösen Oberfläche und das Zellkultursubstrat diffundieren, da die Zellkulturfilme der Erfindung ausgezeichnete Diffusionseigenschaften aufweisen.
  • Salzkonzentrationen, die bei etwa physiologischen Konzentrationen oder darüber liegen und vorzugsweise 0,15 M bis 1 M betragen, können verwendet werden, um die Bildung von großen nativen Collagenfasern zu fördern. Bei Salzkonzentrationen unterhalb von physiologischen Konzentrationen gibt es, wenn überhaupt, nur eine geringe Bildung von Collagenfasern. Wenn die Salzkonzentration jedoch auf ungefähr physiologische Konzentrationen erhöht wird, wird die Faserbildung im Wesentlichen vollständig, wobei nur wenig amorphes Collagen vorhanden ist. Wenn die Salzkonzentration über physiologische Konzentrationen hinaus erhöht wird, entstehen außerdem immer größere Fasern. Wenn die Salzkonzentration jedoch 1,1 M erreicht, fehlt die Faserbildung wiederum im Wesentlichen vollständig. Wenn sich das solubilisierte Collagen in saurer Lösung befindet, kann der pH-Wert auf ungefähr 6-8, vorzugsweise 7,0-7,4, steigen, gleichzeitig mit der Einstellung der Salzkonzentration durch Zugabe von kalter NaOH in einem Puffer wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), was eine endgültige Salzkonzentration von 0,15 M bis 1 M, vorzugsweise wenigstens 0,6 M (etwa das Vierfache von physiologischer Kochsalzlösung), ergibt. Das Collagen wird in Lösung gehalten, indem man es in der Kälte (gewöhnlich etwa 4 °C) aufbewahrt, bis eine Polymerisation von Collagenfibrillen und -fasern gewünscht wird. Die Collagenkonzentration ist für die Bildung der nativen Collagenfasern nicht entscheidend, beträgt jedoch vorzugsweise 10 bis 500 μg/cm2 der porösen Oberfläche, wenn sie zur Verwendung als Zellkultursubstrat vorgesehen sind, besonders bevorzugt 65 bis 85 μg/cm2.
  • Eine Vielzahl von Polymerisationsbedingungen einschließlich nichtphysiologischer Bedingungen kann verwendet werden, um die Zellkulturfilme ohne Bedenken wegen negativer Auswirkungen von nichtcollagenartigen Rückständen, wie Salzen oder organischen Materialien, auf die Zellumgebung zu produzieren. Durch Kollabierenlassen des Gels auf die poröse Oberfläche und Trocknen im Einklang mit dem Verfahren dieser Erfindung unter Bildung des fibrillären Collagenfilms erhält man eine gleichmäßige Oberfläche für eine gleichmäßige Verteilung von Zellen und, falls gewünscht, eine Konzentration von Collagen (etwa 5-10 mg/ml). Die native fibrilläre Collagenstruktur liefert die räumliche in-vivo-Orientierung für die Bindung von Zellrezeptoren, die man in Zellkultursubstraten aus amorphem Collagen nicht findet. Das fibrilläre Collagennetzwerk liefert auch eine texturierte Oberfläche, die zu einer höheren Collagenoberfläche auf jedem Film führt, der sich auf den im Wesentlichen zweidimensionalen Oberflächen anderer Collagen-Zellkultursubstrate befindet. Die Zellkultursubstrate aus nativem fibrillärem Collagen binden Zellen gieriger und gleichmäßiger an ihre Oberflächen als die Collagensubstrate des Standes der Technik. Das heißt, viele verschiedene Zelltypen, die auf die Oberfläche aufgetragen werden, binden schnell und vollständig daran (z.B. Epithelzellen, Endothelzellen und Fibroblasten).
  • Organisationsentropie treibt die Polymerisationsreaktion der Erfindung an. Da der physikalische Mechanismus bei anderen Proteinen, die eine ähnliche Art von Selbstorganisation erfahren, derselbe ist, produziert ein beliebiges Protein oder beliebige Proteine, die in vitro spontan organisierte polymere Strukturen bilden, native Konstrukte, wenn sie in dem obigen Produktionsverfahren anstelle von Collagen verwendet werden. Dazu gehören Proteine, die Homopolymere (z.B. Fibronectin oder Laminin) und Heteropolymere (z.B. Laminin mit Collagen IV oder Laminin mit Proteoglycanen) bilden. Extrazelluläre Matrixkomponenten, die Proteine umfassen, welche eine Selbstorganisation erfahren, wie solche, die man in MATRIGEL® (Collaborative Biomedical Products, Inc.) findet, können gemäß den Verfahren der Erfindung polymerisiert und getrocknet werden, um native Konstrukte zu produzieren. Obwohl alle solche Proteine möglicherweise keine Gele produzieren, die in derselben Weise wie Collagen-Gele kollabieren und einen Film bilden, wenn die interfibrilläre Flüssigkeit entfernt wird, sollte ein Entfernen der interfibrillären Flüssigkeit aus dem polymerisierten Substrat und Trocknen eine Retention des nativen Konstrukts im Endprodukt ermöglichen.
  • Bei dem Verfahren der Erfindung kann jedes Membranmaterial als Substrat verwendet werden, doch kann es bei bestimmten biologischen Anwendungen positive oder negative Wirkungen der ausgewählten Membran geben. Während geätzte Membranen für Transportstudien bevorzugt sein mögen, können auch gegossene Membranen verwendet werden, wenn der Permeabilitätskoeffizient des getesteten Materials nicht den Permeabilitätskoeffizient der Membran übersteigt (d.h. der Permeabilitätskoeffizient der Membran ist kein begrenzender Faktor).
  • Zweckmäßigerweise können in Zellkulturanwendungen Kulturplatteneinsätze, die poröse Membranen aufweisen, bevorzugt sein (z.B. BIOCOAT Control Cell Culture Insert, Collaborative Biomedical Products; TRANSWELL, Costar; MILLICELL Culture Plate Insert, Millipore Corporation). PET-Membranen können bei Anwendungen, die Mikroskopie beinhalten, aufgrund ihrer höheren Transparenz gegenüber Materialien wie Polycarbonat hoher Dichte bevorzugt sein. Aus diesen Gründen können daher für verschiedene Anwendungen verschiedene Membranen bevorzugt sein und können vom Fachmann routinemäßig ausgewählt werden.
  • Zu den geeigneten porösen Oberflächen zur Verwendung als Substrat der vorliegenden Erfindung gehören natürliche oder synthetische Polymere, wie Cellulosemembranen, poröses Polycarbonat, poröses Polytetrafluorethylen (z.B. TEFLON-Netzmembranen, wie Millipore CM), Nylonmembranen und -netze, Glasfilter, poröses Polyethylenterephthalat, Polymethylpentan, Polypropylen, Polyethylen und verschiedene Typen von Filtern (z.B. ANOPORE-Aluminiumkristallfilter). Die poröse Oberfläche sollte eine Porengröße haben, die klein genug ist, um zu verhindern, dass die Collagenlösung vor der Polymerisation hindurchfließt, aber groß genug, um den Durchtritt von Flüssigkeiten, wie Medien und der interfibrillären Flüssigkeit, zu ermöglichen. Im Allgemeinen liefern Membranen mit Porengrößen von 0,5 bis 30 μm die gewünschten Eigenschaften. Eine Oberfläche, die eine Membran mit Poren von ungefähr 8 μm umfasst, ist für die meisten allgemeinen Zellkulturanwendungen, wie Materialtransportstudien, bevorzugt. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Membran Poren von 0,5 bis 30 μg/cm2 der Einsatzmembranoberfläche.
  • Nach dem Trocknen kann die Zellkulturapparatur der vorliegenden Erfindung sterilisiert werden, zum Beispiel durch Bestrahlung (z.B. ultraviolettes Licht, Elektronenstrahlen oder Gammabestrahlung) oder Einwirkung von Ethylenoxidgas. Die Filme aus nativem fibrillärem Collagen gemäß der Erfindung behalten im Gegensatz zu den Collagenzellkultursubstraten des Standes der Technik ihre native fibrilläre Struktur bei, wenn sie getrocknet werden, und daher ähneln sie stärker einem in-vivo-Collagensubstrat.
  • Eine Vielzahl von Materialien einschließlich bioaktiver Proteine kann mit der extrazellulären Matrix der vorliegenden Erfindung copolymerisiert oder durch Adsorption an das Collagen in den Film eingebaut werden, wie es für ein bestimmtes Zellkultursystem gewünscht wird. Dazu gehören unter anderem Zellen, Antikörper, Enzyme, Rezeptoren, Wachstumsfaktoren, zusätzliche Komponenten der extrazellulären Matrix, Cytokine, Hormone und Wirkstoffe. Diese Materialien können in der für die ausgewählte Zellkulturanwendung geeigneten Konzentration zu der kalten Collagenlösung gegeben werden. Durch die Polymerisation der nativen Collagenfibrillen, wie sie oben beschrieben ist, wird das Material an die Collagenfasern gebunden oder mit diesen copolymerisiert. Aufgrund der offenen Faserstruktur des Zellkultursubstrats stehen biologisch aktive hinzugefügte Materialien den kultivierten Zellen leicht zur Verfügung, um deren Eigenschaften oder Verhalten zu moderieren oder zu regulieren.
  • Die zu kultivierenden Zellen können subkonfluent oder konfluent auf der oberen Oberfläche des Substrats ausgesät und für das Zellwachstum geeigneten Umgebungsbedingungen ausgesetzt werden. Wenn das Zellkultursubstrat zum Beispiel auf der Oberfläche der Membran eines Einsatzes für den Napf einer Kulturplatte hergestellt wird, wird eine kleine Menge des Kulturmediums in den Napf gegeben. Der Einsatz wird in den Napf gegeben, so dass das Kulturmedium mit der Unterseite der porösen Membran in Kontakt steht und durch das Zellkultursubstrat diffundiert und mit Zellen in Kontakt kommt, die auf der Substratoberfläche ausgesät sind.
  • Jedes Zellkulturmedium, das für das Wachstum und die Differenzierung von Epithelzellen geeignet ist, kann in Zellkulturen verwendet werden, bei denen die vorliegenden Collagen-Zellkultursubstrate eingesetzt werden. Dazu gehören unter anderem Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), MEM, M-199 und RPMI. Zusätze, wie sie in der Technik bekannt sind, können zu dem Kulturmedium gegeben werden; dazu gehören Serum (z.B. FBS oder Kälberserum), serumhaltige Zusätze (NU-SERUM) und serumfreie Zusätze (MITO+). Ein bevorzugtes Zellkulturmedium für Darmepithelzellen ist DMEM, dem MITO+ Serum Extender (Collabo rative Biomedical Products, Redford, Mass.) zugesetzt wurde, so dass man eine volldefinierte, serumfreie Zellkulturumgebung erhält.
  • Die folgenden Beispiele werden angegeben, um bestimmte Ausführungsformen der Erfindung zu veranschaulichen, und sollen die Erfindung, die durch die beigefügten Ansprüche und deren Äquivalente definiert ist, nicht einschränken.
  • Beispiel 1
  • Herstellung einer Zellkulturapparatur mit einer getrockneten, gleichmäßig verteilten extrazellulären Matrix
  • Das folgende experimentelle Beispiel beschreibt die Herstellung von Zellkultursubstraten mit getrocknetem, gleichmäßig verteiltem nativem fibrillärem Collagen auf 1 μm dicken Polyethylenterephthalat(PET)-Membranen in PET-Zellkultureinsätzen. In diesem Beispiel werden etwa 200 μm MATRIGEL®-Matrix zu der Membran gegeben.
  • Eine kalte saure Lösung von MATRIGEL®-Matrix wird durch Zugabe von zehnmal DPBS/NaOH auf 674 μg/ml eingestellt, wobei man eine Endkonzentration von etwa viermal DPBS erhielt, pH 7,4, und das Gemisch wird bis zur Verwendung auf Eis gehalten. Einsatzhalter werden in Gewebekulturschalen gegeben. Die Zellkultureinsätze werden mit einer sterilen Zange in die Einsatzhalter eingesetzt, und bis zur Verwendung werden Deckel auf die Schalen gegeben. Das MATRIGEL®-Collagen-Beschichtungsgel (0,10 ml) wird auf jede Membran gegeben, der Deckel der Kulturschale wird wieder aufgesetzt, und die Schale wird leicht geschwenkt, um die Beschichtungslösung gleichmäßig auf der Membran zu verteilen. Die beschichteten Membranen werden bei 37 °C inkubiert, damit das Collagen polymerisieren kann (etwa 2,0 Stunden), wobei die Membranen in einer feuchten Umgebung gehalten werden, um ein vorzeitiges Trocknen zu verhindern.
  • Nachdem das Collagen polymerisiert ist, werden die beschichteten Einsätze in einen vorgekühlten Lyophilisator gegeben und gefrieren gelassen (bei einer Temperatur von nicht mehr als -30°C), bevor der Lyophilisierungsvorgang eingeleitet wird. Einsätze werden über Nacht lyophilisiert, und währenddessen lässt man den Lyophilisator sich auf Raumtemperatur erwärmen. Ein gleichmäßiger Kuchen wird erhalten, der an der Membran des Einsatzes haftet.
  • Die Zellkultursubstrate aus nativem Collagen werden dann in den Gewebekulturschalen sterilisiert, indem man sie 0,05-0,06 Joule ultraviolettem Licht aussetzt, und werden bis zur Verwendung in verschlossenen Beuteln bei 4 °C gelagert.
  • Beispiel 2
  • Invasionsassay
  • NIH-3T3-Zellen (nichtinvasiv) und HT-1080-Zellen (invasiv) wurden in DMEM, das 10% fetales Kälberserum oder Neugeborenen-Kälberserum enthielt, bis fast zur Konfluenz wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Trypsinierung geerntet und in DMEM gewaschen, ohne Serum oder Proteinase-Inhibitor hinzuzufügen. Die Zellen wurden in DMEM in einer Konzentration von 1 × 105/ml suspendiert. Vor der Herstellung der Zellsuspension wurde die getrocknete Schicht der MATRIGEL®-Matrix 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit DMEM rehydratisiert. Die Rehydratisierungslösung wurde vorsichtig entfernt, 0,75 ml DMEM, das 5% fetales Kälberserum enthielt, wurde als chemischer Lockstoff in jeden Plattennapf gegeben, und 0,5 ml (5 × 104 Zellen) Zellsuspension wurden zu jedem Einsatz gegeben. Die Platteneinsätze wurden 22 Stunden lang bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5% CO2 inkubiert. Unbeschichtete Membraneinsätze wurden ebenfalls besät und dienten als Kontrollen.
  • Fixierung und Anfärbung von beschichteten Einsätzen
  • Nach der Inkubation wurde die obere Oberfläche der Membran in jedem Einsatz sachte mit einem Baumwollstäbchen abgerieben, um alle nichtinvasiven Zellen und die MATRIGEL®-Matrix zu entfernen. Die eindringenden Zellen auf der unteren Oberfläche der Membran wurden fixiert und angefärbt, indem man sie nacheinan der durch die drei Lösungen des Diff-Quik-Staining-Kits (Dade) führte. Der überschüssige Farbstoff wurde entfernt, indem man jeden Einsatz in destilliertes Wasser eintauchte. Die obere Oberfläche der Membran wurde ein zweites Mal abgerieben, um gegebenenfalls noch vorhandenes Wasser, Zellen oder MATRIGEL®-Matrix zu entfernen. Die Einsätze wurden auf eine andere 24-Napf-Platte übergeführt und an der Luft trocknen gelassen. Die Zahl der Zellen, die durch die MATRIGEL®-Matrix auf die Membran eingedrungen waren, wurde auf der Unterseite der Membran durch direktes Zählen mit einem Mikroskop quantifiziert, nachdem die Zellen mit Diff-Quik angefärbt worden waren.
  • Die Zellen wurden aufgezählt, indem man je nach der Zahl und Verteilung der Zellen Mikrophotographien mit 40- oder 200-facher Vergrößerung nahm. Es wurden Photos gemacht, ohne die Membran von dem Einsatzgehäuse zu entfernen. Die Zellen in mehreren Feldern (gewöhnlich 5) jedes Photos wurden mit Hilfe eines regelmäßigen Gitters ausgezählt. Die Daten wurden als "% Invasion" ausgedrückt, d.h. als Verhältnis von Zellen, die durch die mit MATRIGEL®-Matrix beschichteten Einsätze hindurch einwanderten, relativ zum unbeschichteten Kontrolleinsatz.
  • Proteinanfärbung auf beschichteten Einsätzen
  • Um die Gleichmäßigkeit der Verteilung der Beschichtung zu bewerten, wurden beschichtete Einsätze mit Coomassieblau angefärbt, um ein Profil des Proteingehalts über die Fläche des Einsatzes zu erhalten. Beschichtete Einsätze wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit gepufferter Kochsalzlösung rehydratisiert. Die Rehydratisierungslösung wurde sorgfältig entfernt und durch Coomassie-Anfärbungslösung (1 mg pro ml Coomassie Brilliant Blue R-250 in 10% Essigsäure, 40% Methanol) ersetzt. Nach 30 Minuten wurde der Farbstoff sorgfältig entfernt, die Einsätze wurden zweimal mit destilliertem Wasser gespült und an der Luft trocknen gelassen. Die Qualität der Ablagerung der MATRIGEL®-Matrix wurde bei 100facher Vergrößerung bewertet.
  • Beispiel 3
  • Ergebnisse eines Invasionsassays unter Verwendung von erfindungsgemäßen Zellkulturapparaturen
  • Dieses Beispiel zeigt, dass Zellkultureinsätze, die gemäß den Verfahren der Erfindung hergestellt wurden, eine Leistung gemäß gewünschten Leistungsanforderungen zeigten; diese Anforderungen sind unten in Tabelle 1 gezeigt, in der NIH-3T3-Zellen (3T3) repräsentativ für nichtinvasive Tumorzellen und HT-1080-Zellen repräsentativ für metastasierende Tumorzellen sind. Tabelle 1 Gewünschte Leistungsanforderungen
    NIH-3T3-Invasion HT-1080-Invasion Musterbildung Oberflächenverteilung der Beschichtung
    10% oder weniger 25% oder mehr keine gleichmäßig
  • Erfindungsgemäße Zellkultureinsätze wurden auf die Fähigkeit von NIH-3T3-Zellen und HT-1080-Zellen, in eine Basalmembranmatrix einzudringen, getestet. Fixierte und angefärbte Einsätze wurden gemäß der obigen Beschreibung untersucht, um den Grad der Invasion und Musterbildung zu bewerten. Die Ergebnisse dieser Bewertungen sind im Folgenden im Einzelnen dargestellt.
  • Die erfindungsgemäßen Zellkulturapparaturen zeigten im Wesentlichen keine Invasion der Kontroll-NIH-3T3-Zellen, d.h. der nichtinvasiven Zellen. Es gab jedoch einen hohen Grad der Invasion durch die HT-1080-Tumorzellen. Eindringende HT-1080-Zellen waren gleichmäßig über die Oberfläche jedes Einsatzes verteilt, was eine hochgradig gleichmäßige Tumorzellenmigration über die gesamte Zellkulturoberfläche ergab. Die erfindungsgemäßen Zellkulturapparaturen waren frei von Musterbildung, wie intensiven zentralen Flecken oder Ringen aus eingedrungenen Zellen. Die Ergebnisse des vorliegenden Beispiels wurden sowohl mit individuellen 24-Napf-Einsätzen als auch mit 24-Multinapfeinsätzen erhalten. Die dünne, gleichmäßige Beschichtung mit MATRIGEL®-Matrix, die nach diesem Verfahren gleichmäßig über die Membranoberfläche ausgebreitet wurde, kann kürzere Zeiten ermöglichen, um Tumorinvasionsassays abzuschließen.

Claims (11)

  1. Verfahren zum Versehen eines Zellkultursubstrats mit einer gebrauchsfertigen, gleichmäßig verteilten extrazellulären Matrix, umfassend: a) Auftragen von Komponenten der extrazellulären Matrix, die natives fibrilläres Collagen umfassen, auf einen Substratbereich, wobei das Substrat eine Membran mit einer Porengröße von 0,5 bis 30 μm ist; b) Inkubieren der Komponenten der extrazellulären Matrix, so dass ihre Polymerisation ermöglicht wird; c) Gefrierenlassen der polymerisierten extrazellulären Matrix auf dem Substratbereich; d) Lyophilisieren der gefrorenen extrazellulären Matrix auf dem Substratbereich; e) Erwärmenlassen der lyophilisierten extrazellulären Matrix auf Raumtemperatur.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Komponenten der extrazellulären Matrix ausreichend lange inkubiert werden, so dass die extrazelluläre Matrix ein Gel bilden kann.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Komponenten der extrazellulären Matrix bei einer erhöhten Temperatur inkubiert werden.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Komponenten der extrazellulären Matrix bei einer Temperatur von etwa 37 °C inkubiert werden.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Komponenten der extrazellulären Matrix in Gegenwart von Kohlendioxid inkubiert werden.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Konzentration des Kohlendioxids 5% beträgt.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die polymerisierte extrazelluläre Matrix in einem Lyophilisator gefrieren gelassen wird.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die polymerisierte extrazelluläre Matrix bei einer Temperatur, die nicht wärmer als -30 °C ist, gefrieren gelassen wird.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Komponenten der extrazellulären Matrix weiterhin eine Komponente umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Laminin, Entactin, Heparansulfat-Proteoglycan, Wachstumsfaktoren, Proteinasen und Kombinationen davon besteht.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Substrat ein Membranmaterial ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer porösen Membran, geätzten Membran, gegossenen Membranen und Kombinationen davon besteht.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Substrate natürliche oder synthetische Polymere umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Cellulosemembranen, porösem Polycarbonat, porösem Polytetrafluorethylen, Nylonmembranen und -netzen, Glasfiltern, porösem Polyethylenterephthalat, Polymethylpentan, Polypropylen, Polyethylen und Kombinationen davon besteht.
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