DE10312505A1

DE10312505A1 - Kultivierungssysteme zur Gewinnung von Langzeit-Reinkulturen wasserlebender Kleinorganismen

Info

Publication number: DE10312505A1
Application number: DE2003112505
Authority: DE
Inventors: Wilfried Pauli
Original assignee: Pauli Wilfried Dr
Current assignee: Pauli Wilfried Dr
Priority date: 2003-03-15
Filing date: 2003-03-15
Publication date: 2004-09-23
Anticipated expiration: 2023-03-16
Also published as: DE10312505B4

Abstract

Die Erfindung betrifft Kultivierungssysteme zur Gewinnung partikelfreier Langzeit-Kulturen von wasserlebenden Kleinst- und Kleinorganismen (Bakterien, Algen, Pilze, Protozoen oder kleinen Metazoen), die aus zwei übereinander angeordneten Kammern bestehen. Die untere Kammer ist als Versorgungskammer mit festem Nährsubstrat befüllt. Die obere Kammer stellt eine Kulturkammer dar, die als Reservoir partikelfreier Organismensuspensionen dient. Beide Kammern sind durch eine offenporige physikalische Barriere (Schaumstoff) voneinander abgetrennt. Die erfindungsgemäßen Kultivierungssysteme können auch so ausgelegt sein, dass sie sich als photometrierbare Kultivierungseinheit verwenden lassen.

Description

Die Erfindung betrifft Kultivierungssysteme zur Gewinnung partikelfreier Langzeit-Kulturen von wasserlebenden Kleinst- und Kleinorganismen sowie Verfahren, bei denen die Organismen in einem zwei-kammerigen Kultivierungssystem steril verschlossen gehältert werden und ferner Vorrichtungen zur Implementierung der Kultivierungsverfahren.

Protozoen als wasserlebende Kleinstorganismen sind einzellige eukaryotische Organismen. Im Labor stehen eine Reihe von Vertretern dieser Organismengruppe schon seit mehreren Jahrzehnten im Zentrum biochemischen und molekulargenetischen Interesses (Gall J G, 1986, The Molecular Biology of Ciliated Protozoa, Academic Press, London; Lwoff A, 1951, Biochemistry and Physiology of Protozoa, Academic Press, London; Levandowsky M, Hutner S H, 1981, Biochemistry of Protozoa, vol. I-V. Academic Press, London.). In jüngster Vergangenheit erlangten einige Protozoenspezies auch zunehmende Bedeutung im Bereich der Toxikologie, Umweltschadstoffforschung und Biotechnologie (Gilron G L, Lynn D H, 1997, Ciliated Protozoa as Test Organisms in Toxicity Assessment. In: Microscale Testing in Aquatic Toxicology, Wells P G, Lee K, Blaise C (eds), CRC Press, Boca Raton; Tiedke A, 2001, Biotechnology with Protozoa. In: Biotechnology, Brehm H-J, Wiley-VCH, Weinheim).

Eine wichtige Voraussetzung biochemischer, molekulargenetischer und toxikologischer Untersuchungen ist die Möglichkeit zur Kultivierung des biologischen Ausgangsmaterials in Reinkultur. Fremdorganismen würden durch ihre eigene Biologie bzw. durch das zusätzliche Vorhandensein von Stoffwechselprozessen und Biomolekülen die Probe verunreinigen und damit die Analyse des eigentlichen Untersuchungsgegenstandes stören oder gar verhindern.

In aller Regel besitzen die für Laboruntersuchungen herangezogenen Protozoen-Spezies keine cryptobiotischen Lebensstadien, vermögen also keine stoffwechselarmen Dauerformen (Cysten) wie viele ihrer Verwandten zu bilden, sondern behalten auch unter den Bedingungen der Langzeit-Kultivierung ihre aktive, vergleichsweise stoffwechselintensive Lebensform bei, die auf ständiges Vorhandensein von Nahrung bzw. Nährstoffen angewiesen ist. Die Rein-Kultivierung dieser labortypischen Arten erfolgt daher meist in Vollmedien auf der Basis von Proteose-Pepton/Hefeextrakt (PPY) kultiviert (Cell Biology, 1994, A Laboratory Handbook, Celis J (ed), Academic Press, London); seltener finden synthetische Medien mit chemisch definierter Zusammensetzung Verwendung (Szablewski et al., 1991, Tetrahymena thermophila; growth in the synthetic nutrient medium in the presence and absence of glucose, J. Protozool, 38, 62-65). Neben der Kultivierung in gelösten Nährstoffen werden auch wässrige Medien verwandt, die als Nährsubstrat feste Bestandteile pflanzlichen (meist Zerealien wie Reis oder Getreide) oder tierischen Ursprungs (Fleisch) enthalten (z.B. Vater-Dobberstein B, Hilfrich H-G, 1982, Versuche mit Einzellern, Kosmos, Stuttgart). Besonders letztere Form mit festem Nährsubstrat wird häufig zur Stammkultivierung der Organismen gewählt.

Die Stammkultivierung bildet den Grundstock der Kultivierung des biologischen Materials. Von Stammkulturen wasserlebender Klein- und Kleinstorganismen ausgehend werden z.B. die eigentlichen Protozoen-Versuchskulturen gezogen, deren Kulturmedium der jeweiligen biologischen / biochemischen Fragestellung angepasst ist. Die Stammkultivierung dient in erster Linie dem Zweck, biologisches Ausgangsmaterial langfristig vorzuhalten und zugleich einer genetischen Verschiebung („genetic shift") vorzubeugen, weshalb die Organismen hier unter Bedingungen sehr geringen oder stationären Wachstums, d.h. unter weitgehender Vermeidung der Ausbreitungsmöglichkeit von Mutanten, gehalten werden. Die Hälterung der Organismen geschieht dabei in steril verschlossene Gefäßen, wobei Substrat und Zellen in einem Kultivierungsraum vereint vorliegen.

Mit zunehmendem Alter bildet sich in Stammkulturen durch absterbende Organismen Zell-Debris [Fragmente toter (Körper)zellen, Zellfragmente]. Ebenso zersetzt sich im Laufe der Zeit das anfangs noch konsistente, aus festen Bestandteilen pflanzlichen (Zerealien) oder tierischen (z.B. Fleisch) Ursprungs bestehende Nährsubstrat. Bei herkömmlichen Verfahren der Kultivierung in einem einzigen Kultivierungsraum kommt es – besonders bei der Entnahme von Zellen – leicht zur Vermischung dieser partikulären Abbauprodukte mit der Zellsuspension. Eine für viele Zwecke notwendige genaue Bestimmung der Zelldichten solcher gealterter Kulturen wird damit erheblich erschwert. Gebräuchliche photometrische Methoden werden durch die mit der Vermischung einhergehende Eintrübung gestört und die auch üblichen elektronischen Zellzählverfahren sind aufgrund der partikulären Verunreinigungen nicht direkt anwendbar. Um dennoch die tatsächliche Zelldichte dieser Stammkulturen zu ermitteln, muss auf zeit- und arbeitsaufwendige mikroskopische Bestimmungsmethoden zurückgegriffen werden, oder die Zellen müssen durch umständliche, weitere Arbeitsschritte erfordernde Verfahren (z.B. Zentrifugation), vom Kulturmedium getrennt werden.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, Systeme zur Stammkultivierung wasserlebender Klein- und Kleinstorganismen zu schaffen, mit denen die genannten Nachteile der Stammkultivierung überwunden werden und die eine Stammkultivierung von wasserlebenden Klein- und Kleinstorganismen insbesondere derart ermöglichen, dass eine Vermischung abgestorbener Zellbestandteile (Zelldebris) und partikulären Nährsubstrates bei der Entnahme lebender Zellen vermieden werden kann. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Vorrichtungen zur Implementierung der Verfahren anzugeben.

Um ausgehend von bekannten Verfahren zur Stamm-Kultivierung von wasserlebenden Klein- und Kleinstorganismen, insbesondere von Protozoen (Einzellern), über längere Zeiträume detritus- und nährstoffpartikelfreie Organismensuspensionen / Zellsuspensionen zu erreichen (Detritus: breiige oder krümelige Überreste zerfallener Gewebs- u. Zellteile), wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, dass die Zellen in einem aus zwei übereinander angeordneten Kammern bestehenden, steril verschlossenen Kultivierungssystem in Flüssigkeit gehältert werden, wobei festes Nährsubstrat bzw. partikuläre Nährmediumbestandteile nur der unteren Kammer (Versorgungskammer) zugesetzt werden, und die obere Kammer als Reservoir (Organismenreservoir / Zellreservoir) partikelfreier Organismensuspension / Zellsuspension (Kulturkammer) dient. Beide Kammern stehen über eine oder mehrere Öffnungen miteinander in Verbindung. Ihre Nährstoffe erhalten die Zellen vorzugsweise aus festen, partikulären Nährsubstraten wie beispielsweise Zerealien oder Fleisch. Entsprechend ihrer im Vergleich zur Organismensuspension / Zellsuspension höheren Dichte und ihrer die Zellen um ein Vielfaches übertreffenden Größe werden sie dem unteren Teil des Kultivierungssystems zugesetzt. Die Öffnung bzw. Porenweite der trennenden Schicht zwischen beiden Kammern ist nun so bemessen, dass Partikel von der Größe der Organismen ungehindert passieren können, die Nährpartikel aber zurückgehalten werden. Zugleich muss die Öffnung bzw. Porenweite so gewählt sein, dass die in der Trennschicht wirkenden Kapillarkräfte stark genug sind, Flüssigkeit selbst nach Kippen der Kultivierungseinheit zu halten. Damit ist gewährleistet, dass sich im Laufe der Zeit bildender Zelldebris nach unten in die Versorgungskammer absinken und sich dort ansammeln kann. Umgekehrt wird das partikuläre Nährsubstrat aufgrund der geringen Porenweite der Trennschicht im unteren Teil zurückgehalten.

Die Aufgaben der Erfindung werden durch Verfahren und durch Vorrichtungen gemäß den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Das erfindungsgemäße Kultivierungssystem zur Gewinnung partikelfreier Langzeit-Reinkulturen von Protozoen besteht darin, dass
die Organismen in einem aus zwei übereinander angeordneten Kammern bestehenden Kultivierungssystem gehältert werden,
die untere Kammer mit festem Nährsubstrat befällt ist (Versorgungskammer), und die obere Kammer als Reservoir (Organismenreservoir / Zellreservoir) partikelfreier Organismensuspension / Zellsuspension dient (Kulturkammer) und
Versorgungs- und Kulturkammer durch eine offenporige physikalische Barriere voneinander abgetrennt sind,
wobei gilt, dass

– die Organismen steril und als Reinkultur kuliviert werden,
– die Kultivierungseinheit steril, aber sauerstoffdurchlässig verschlossen ist,
– partikuläre, feste Nährstoffe pflanzlichen oder tierischen Ursprungs das Ausgangssubstrat der Kultur bilden und
– die physikalische Barriere zwischen den beiden Kammern eine oder mehrere Öffnungen aufweist, die groß genug sind, den aktiven Übertritt von Zellen zu gewährleisten sowie ein passives Absinken abgestorbener Zellen oder Zellbestandteile zu ermöglichen, aber klein genug sind, durch Kapillarkräfte Kulturflüssigkeit zurückzuhalten und selbst im gekippten Zustand der Kultivierungseinheit eine Vermischung der beiden Kammerinhalte verhindern bzw. deutlich reduzieren.

Das Kultivierungssystem kann als einteiliges oder zweiteiliges System ausgelegt sein, bei dem die obere Kammer von der unteren abgenommen werden kann, d.h. beide Kammern vollständig voneinander trennbar sind. Im Falle einer Zweiteilung lassen sich die Organismen ohne weitere Hilfsmittel direkt mit der Kulturkammer von der Versorgungskammer entfernen.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung besteht darin, dass ein sauerstoffdurchlässiger Verschluss aus einem durchstechbaren Septum besteht, durch das von außen mittels einer Spritze Zellen steril entnommen werden können, ohne die Kultivierungseinheit öffnen zu müssen. Ein Septumverschluss hat neben der Möglichkeit der wiederholten Entnahme noch den weiteren Vorteil, ohne Sterilraumbedingungen verbrauchte oder alte Flüssigkeit in der Kultivierungskammer zu ersetzen bzw. auszutauschen.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform besteht darin, dass die Kultivierungseinheit als Photometer-Küvette ausgelegt ist. Damit lässt sich die Dichte der Organismen nicht-invasiv direkt im Kultivierungssystem noch vor der Entnahme bestimmen und eine definierte Zahl von Organismen entnehmen.

In einer hevorzugten Weiterbildung werden als Kultivierungssystem Röhrchen im 96-er Standard-Mikrotiterplattenformat herangezogen. Dies erleichtert die halb- bzw. vollautomatische Befüllung des Kultivierungssystems und ermöglicht die Herstellung der Stammkulturen in großer Zahl.

Als wasserlebende Klein- und Kleinstorganismen im Sinne dieser Erfindung werden beispielsweise Bakterien, Algen, Pilze, Protozoen und kleine Metazoen (Vielzeller) verstanden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung partikelfreier Langzeit-Kulturen besteht darin, dass die Organismen in Kultivierungssystemen aus zwei übereinander angeordneten Kammern so gehältert werden, dass die als Versorgungskammer dienende untere Kammer mit festem Nährsubstrat befüllt wird und die obere Kammer als Kulturkammer sowie als Reservoir (Organismenreservoir / Zellreservoir) partikelfreier Organismensuspension / Zellsuspension dient und beide Kammern durch eine offenporige physikalische Barriere voneinander abgetrennt werden. Dabei werden die Organismen steril und als Reinkultur kultiviert und die Kultivierungseinheiten steril, aber sauerstoffdurchlässig verschlossen. Als Ausgangssubstrat werden in der Kultur partikuläre, feste Nährstoffe pflanzlichen oder tierischen Ursprungs eingesetzt. Vorteilhaft erfolgt die Kultivierung in Standard Glas-Gefäßen mit Schraubverschluss und einliegendem Septum und in Gefäßen im 96er Mikrotiterplatten-Format.

Unter partikelfreien Kulturen im Sinne dieser Erfindung werden solche verstanden, die weitestgehend frei von nicht lebenden partikulären Bestandteilen wie Zelldebris oder Nährsubstratpartikeln sind.

Es ist eine entscheidende und überraschende Eigenschaft der vorliegenden Erfindung, dass durch die Kompartimentierung der Kultivierungseinheit eine von Zelldebris und Nährsubstratpartikeln freie Organismensuspension / Zellsuspension in der oben liegenden Kulturkammer erreicht wird: Begünstigt durch die Schwerkraft sinken in dem aufrecht stehenden, zwei-kammerigen Kultivierungssystem absterbendes Zellmaterial sowie partikuläre Stoffwechselprodukte in die unten liegende Versorgungskammer. Umgekehrt wird das partikuläre Nährsubstrat aufgrund der geringen Porenweite der Trennschicht im unteren Teil zurückgehalten. Wird die Kultivierungseinheit z.B. zur Entnahme von Zellmaterial oder während eines Transports gekippt, verhindert die Trennschicht bzw. die dort aufgrund von Kapillarkräften zurückgehaltene Flüssigkeit eine Durchmischung der beiden Kammern. Durch diese Separation werden damit aufwendige physikalische Verfahren wie Zentrifugation oder Filtration zur Abtrennung von Partikeln aus der Kultur überflüssig. Durch den erfindungsgemäßen modularen Aufbau des Kultivierungssystems wird eine wesentliche Voraussetzung zur Nutzung dieser Organismen für eine Reihe biochemischer / molekulargenetischer sowie toxikologischer Fragestellungen erfüllt.

Neben dem wesentlichen Vorteil einer von unerwünschten partikulären Verunreinigungen freien Organismensuspension / Zellsuspension in der oberen Kammer bewirkt die vertikale Anordnung der Kammern darüber hinaus, dass sich ein Großteil der in der Kulturvorrichtung vorhandenen Organismen in der oben liegenden Kulturkammer ansammelt: Erstens zeigen Protozoen eine allgemeine Tendenz zur Aerotaxis, d.h. sich entlang von Sauerstoffgradienten zu orientieren und an Orten höheren Sauerstoffgehaltes, d.h. oben, in Verschlussnähe zu akkumulieren. Und zweitens nutzt die vertikale Anordnung das häufig bei Protozoen anzutreffende negativ geotaktische Verhalten der Zellen, das zu einer Bewegung gegen die Schwerkraft und damit zu einer relativen Anreicherung der Zellen im oberen Teil der Flüssigkeitssäule führt.

Das erfindungsgemäße Kultivierungssystem ermöglicht es,

– Zellen mehrfach der Kulturkammer steril zu entnehmen sowie das entnommene Volumen durch wässrige Mediumbestandteile zu ersetzten und damit eine semi-kontinuierliche Weiterkultivierung der Zellen zu erreichen;
– die Organismendichte / Zelldichte ohne vorherige Entnahme von Organismensuspension / Zellsuspension direkt in der Kulturkammer zu bestimmen;
– die Kulturkammer mit der darin enthaltenen partikelfreien Organismensuspension / Zellsuspension von der Versorgungskammer leicht abtrennen zu können.

Die Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Diese Merkmale bestehen aus an sich bekannten Elementen, die in ihrer neuen Kombination zu den erfindungsgemäßen vorteilhaften Kultivierungssystemen führen und die in ihrer Gesamtheit einen synergistischen Effekt ergeben, der darin besteht, dass erstmals Kultivierungssysteme zur Gewinnung partikelfreier Langzeit-Reinkulturen von beweglichen Mikroorganismen oder kleinen Vielzellern zur Verfügung gestellt werden.

Die erfindungsgemäße Verwendung der neuen Kultivierungssysteme besteht in der Gewinnung partikelfreier Langzeit-Reinkulturen von Organismen und weiterhin darin, dass sie

– als Küvetten zur direkten photometrischen Bestimmung der Organismendichte / Zelldichte in der Kulturkammer und als Photometer-Küvette der septumverschlossenen Kultivierungs-einheit
– als Kultivierungsgefäße im 96er Mikrotiterplatten-Format
– als Vorrichtungen zur Implementierung der erfindungsgemäßen Kultivierungs-verfahren sowie
– zur Bestimmung der Organismendichte / Zelldichte ohne vorherige Entnahme von Organismensuspension / Zellsuspension direkt in der Kulturkammer

dienen.

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.

Nach der Erfindung sind die Kultivierungsbehältnisse in mehreren Varianten herstellbar und einzusetzen. Ausführungsbeispiele sind in den nachfolgenden Zeichnungen dargestellt und werden im folgenden näher beschrieben.
Legende zu den Figuren
Es zeigen
1 eine schematische Übersichtsdarstellung einer erfindungsgemäßen Kultivierungsvorrichtung mit abnehmbarem Schraubverschluss
2 einen Verschluss mit eingelegtem durchstechbaren Septum
3 eine Anordnung von Kultivierungseinheiten im 96er Mikrotiterplattenformat
4 eine Kultivierungseinheit als Photometer-Küvette / schematische Übersichtsdarstellung einer als Küvette ausgelegten, septumverschlossenen Kultivierungseinheit
5 eine Kultivierungseinheit, bestehend aus einer von der Kulturkammer abtrennbaren Versorgungskammer / schematische Darstellung einer Kultivierungseinheit mit abtrennbarer Kulturkammer.
Bezugszeichen
In einer bevorzugten Ausführungsform der Kultivierungseinheit gemäß 1 werden beide Kammern 1, 2 von einem zylinderförmigen Gefäß (vorzugsweise aus Glas oder Kunststoff) umschlossen und durch einen offenporigen Schaumstoff 3 voneinander getrennt. Offenporiger Schaumstoff (z.B. Polyurethan-, Polyester- und Polyether-Schäume) ist preiswert und in beinahe jeder beliebigen Porengröße erhältlich. Er lässt sich leicht an die jeweiligen Abmessungen der Kultivierungseinheit anpassen und kann – bei entsprechender Wahl der Porengröße – von den Zellen durchdrungen werden. Wird eine Schichtdicke des Schaumstoffes von mehreren Millimetern gewählt und liegt die Porengröße bei maximal etwa zwei mm, kann zudem erreicht werden, dass selbst im gekippten Zustand der Kultivierungseinheit keine Bestandteile aus der Versorgungskammer 2 in die Kulturkammer 1 übertreten und die Organismensuspension / Zellsuspension 5 verunreinigen, da sich in den feinen Poren des Schaumstoffes 4 aufgrund von Kapillarkräften eine die beiden Kammern 1, 2 trennende, stationäre wässrige Schicht praktisch ohne Fließbewegungen bildet. Oben ist die Kultivierungseinheit steril, aber sauerstoffdurchlässig durch einen Stopfen oder eine Kappe 7 verschlossen. Nach Entfernen des Verschlusses 7 kann die Organismensuspension / Zellsuspension 5 ohne Verunreinigungen durch Zelldebris, Detritus oder Nährsubstratpartikel entnommen werden. Geschieht dies unter sterilen Bedingungen, lassen sich Zellen wiederholt entnehmen. Wird zugleich das entnommene Volumen steril durch wässrige Mediumbestandteile ersetzt, kann eine semi-kontinuierliche Weiterkultivierung der Stammkultur erreicht werden.
Eine vorteilhafte Modifizierung gemäß 2 der Kultivierungseinheit sieht sauerstoffdurchlässige durchstechbare Septen 9 (z.B. aus Silikon oder Silikon/Teflon) als Verschluss 7 vor. Nach Durchstechen des Septums 9 kann – ohne Öffnen der Kultivierungseinheit – mit Hilfe einer Sterilspritze 10 mehrfach Organismensuspension / Zellsuspension 5 entnommen und transferiert werden, ohne dass es hierzu weiterer Vorkehrungen zum sterilen Arbeiten (z.B. sterile Werkbank, Arbeiten an der Flamme) bedarf. Ebenso lässt sich hier ohne Öffnen der Kultivierungseinheit das entnommene Suspensionsvolumen oder alte Kulturflüssigkeit durch frische Mediumbestandteile ersetzen. Bewährt haben sich hier Glasröhrchen, wie sie im Bereich der Chromatographie eingesetzt werden. Sie sind in unterschiedlichen Ausführungen preiswert erhältlich und zeichnen sich durch einen (abnehmbaren) Schraubverschluss 8 mit eingelegtem Silikon/Teflon-Septum 9 aus. Das Septum 9 ist sauerstoffdurchlässig und kann außerdem zur Entnahme oder Zugabe von Flüssigkeit mehrfach ohne Schädigung des Sterilverschlusses mit einer Kanüle durchstochen werden.
Um eine halb- bzw. vollautomatisierte Herstellung der Stammkulturen in großer Zahl zu erreichen, hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, Glas- oder Kunststoffröhrchen als Kultivierungssystem zu verwenden, die im 96er Mikrotiterplattenformat bereits vorgefertigt auf dem Markt erhältlich sind. 3 zeigt eine solche Anordnung von Röhrchen. Der Rückgriff auf solche Standard-Formate bietet neben der Automatisierbarkeit ein großes Angebot an sehr unterschiedlichen Kulturgefäßen und erlaubt zudem, die Anschaffungs- und Herstellungskosten sehr gering zu halten.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform besteht gemäß 4 darin, dass die Kultivierungseinheit als Photometer-Küvette ausgelegt ist. Auf diese Weise wird eine genaue und nicht-invasive Bestimmung der Organismendichte / Zelldichte schon vorab in der Kulturkammer 1 ermöglicht. Die Kultivierungseinheit wird hierzu in ein Photometer in der Weise eingebracht, dass der Lichtstrahl durch die Kulturkammer 1 mit der darin enthaltenen, von störenden Partikeln freien Organismensuspension / Zellsuspension 5 fällt. Anhand der optischen Dichte (bzw. des Extinktionswertes) bei einer vorgegebenen Lichtwellenlänge und einer Kalibrierungskurve lässt sich die genaue Organismendichte / Zelldichte in der Kulturkammer 1 errechnen und durch Entnahme eines bestimmten Volumens eine definierte Anzahl von Organismen entnehmen. Prinzipiell kann dabei jede Lichtwellenlänge zur Bestimmung herangezogen werden, allerdings muss der Zusammenhang zwischen optischer Dichte und Organismendichte / Zelldichte (Kalibrierungskurve) jeweils bekannt sein. Wird als Verschluss 7 ein durchstechbares Septum 9 gewählt, können darüber hinaus Zellen auch unter nicht-Sterilraumbedingungen beispielsweise mittels einer Sterilspritze 10 mehrfach und steril in präziser Anzahl entnommen werden.
Alternativ zur Ausführungsform, bei der beide, Kultur- und Versorgungskammer von einem Behältnis fest umfasst werden, hat sich gemäß 5 eine erfindungsgemäße Ausgestaltung der Kultivierungssystems bewährt, bei dem die Kulturkammer 1 mit der darin befindlichen Organismensuspension / Zellsuspension 5 von der Versorgungskammer 2 abgenommen werden kann. Bei der in 5 illustrierten Ausführungsform werden zwei Röhrchen ineinander gesteckt, wobei der Boden der Kulturkammer 1 die Trennschicht 3 zur Versorgungskammer 2 bildet und ein Loch 11 im Boden der Kulturkammer 1 (oberes Röhrchen) die Verbindung zur Versorgungskammer 2 herstellt.
Die Erfindung ist nicht auf die dargestellten Ausführungsformen beschränkt. Vielmehr können die Kulturkammer, die Trennschicht, die Versorgungskammer sowie die Verschlussvorrichtungen anwendungsabhängig modifiziert werden.
Beispielsweise kann das Volumen der Versorgungskammer 2 um ein Vielfaches größer angelegt sein als das Volumen innerhalb der Kultivierungskammer 1. Ferner kann abweichend von der dreidimensionalen Struktur der offenporigen Trennschicht eine zweidimensionale netzartige Matrix treten. Weitere Modifizierungsmöglichkeiten beziehen sich auf die Form der Kammern und der Kultivierungseinheit sowie die Auswahl der Verschlussvorrichtung.

Claims

Kultivierungssysteme zur Gewinnung partikelfreier Langzeit-Reinkulturen von wasserlebenden Kleinst- und Kleinorganismen, bestehend aus zwei übereinander angeordneten Kammern, wobei die untere Kammer als Versorgungskammer mit festem Nährsubstrat befüllt ist und die obere Kammer eine Kulturkammer darstellt, die als Reservoir partikelfreier Organismensuspensionen dient und beide Kammern durch eine offenporige physikalische Barriere voneinander abgetrennt sind.
Kultivierungssysteme nach Anspruch 1 als Vorrichtungen zur Gewinnung partikelfreier Langzeit-Reinkulturen von wasserlebenden Kleinst- und Kleinorganismen – Bakterien, Algen, Pilze, Protozoen oder kleinen Metazoen – dadurch gekennzeichnet, dass sie aus zwei vertikal übereinander angeordneten Kammern bestehen, von denen die oben liegende – steril, aber sauerstoffdurchlässig nach außen hin verschlossene – Kulturkammer das Organismenreservoir darstellt und die untere die Versorgungskammer.
Kultivierungssysteme nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie 3.1. als einteiliges Kultivierungssystem eine einzelne Kultivierungseinheit bilden und 3.2. als zweiteiliges Kultivierungssystem vorliegen, wobei beide Kammern vollständig voneinander abgetrennt werden.
Kultivierungssysteme nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierungseinheit als Küvette zur direkten photometrischen Bestimmung der Organismendichte in der Kulturkammer ausgelegt ist.
Kultivierungssysteme nach Anspruch 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, dass der sauerstoffdurchlässige Verschluss aus einem durchstechbaren Septum besteht.
Kultivierungssysteme nach Anspruch 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Kultivierungsgefäßen im 96er Mikrotiterplatten-Format bestehen.
Kultivierungssysteme nach Anspruch 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Standard Glas-Gefäßen mit Schraubverschluss und einliegendem Septum bestehen.
Verfahren zur Gewinnung partikelfreier Langzeit-Reinkulturen von wasserlebenden Kleinst- und Kleinorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass die Organismen in Kultivierungssystemen aus zwei übereinander angeordneten Kammern nach Anspruch 1 bis 6 so gehältert werden, dass die als Versorgungskammer dienende untere Kammer mit festem Nährsubstrat befüllt wird und die obere Kammer als Kulturkammer sowie als Reservoir partikelfreier Organismensuspensionen dient und beide Kammern durch eine offenporige physikalische Barriere voneinander abgetrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass a. die Organismen steril und als Reinkultur kultiviert werden, b.die Kultivierungseinheit steril, aber sauerstoffdurchlässig verschlossen wird, c. partikuläre, feste Nährstoffe pflanzlichen oder tierischen Ursprungs als Ausgangssubstrat der Kultur eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung in Gefäßen im 96er Mikrotiterplatten-Format erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung in Standard Glas-Gefäßen mit Schraubverschluss und einliegendem Septum erfolgt.
Verwendung der Kultivierungssysteme nach Anspruch 1 bis 6 zur Gewinnung partikelfreier Langzeit-Reinkulturen von wasserlebenden Kleinst- und Kleinorganismen.
Verwendung nach Anspruch 11 als Küvette zur direkten photometrischen Bestimmung der Organismendichte in der Kulturkammer und als Photometer-Küvette der septumverschlossenen Kultivierungseinheit.
Verwendung nach Anspruch 11 und 12 als Kultivierungsgefäße im 96er Mikrotiterplatten-Format.
Verwendung nach Anspruch 11 und 12 als Vorrichtung zur Implementierung des Kultivierungsverfahrens nach Anspruch 7 bis 10.
Verwendung nach Anspruch 11 bis 14 zur Bestimmung der Organismendichte ohne vorherige Entnahme von Organismensuspension direkt in der Kulturkammer.