Protozoen
als wasserlebende Kleinstorganismen sind einzellige eukaryotische
Organismen. Im Labor stehen eine Reihe von Vertretern dieser Organismengruppe
schon seit mehreren Jahrzehnten im Zentrum biochemischen und molekulargenetischen
Interesses (Gall J G, 1986, The Molecular Biology of Ciliated Protozoa,
Academic Press, London; Lwoff A, 1951, Biochemistry and Physiology
of Protozoa, Academic Press, London; Levandowsky M, Hutner S H,
1981, Biochemistry of Protozoa, vol. I-V. Academic Press, London.).
In jüngster
Vergangenheit erlangten einige Protozoenspezies auch zunehmende
Bedeutung im Bereich der Toxikologie, Umweltschadstoffforschung
und Biotechnologie (Gilron G L, Lynn D H, 1997, Ciliated Protozoa
as Test Organisms in Toxicity Assessment. In: Microscale Testing
in Aquatic Toxicology, Wells P G, Lee K, Blaise C (eds), CRC Press,
Boca Raton; Tiedke A, 2001, Biotechnology with Protozoa. In: Biotechnology,
Brehm H-J, Wiley-VCH, Weinheim).
Eine
wichtige Voraussetzung biochemischer, molekulargenetischer und toxikologischer
Untersuchungen ist die Möglichkeit
zur Kultivierung des biologischen Ausgangsmaterials in Reinkultur.
Fremdorganismen würden
durch ihre eigene Biologie bzw. durch das zusätzliche Vorhandensein von Stoffwechselprozessen
und Biomolekülen
die Probe verunreinigen und damit die Analyse des eigentlichen Untersuchungsgegenstandes stören oder
gar verhindern.
In
aller Regel besitzen die für
Laboruntersuchungen herangezogenen Protozoen-Spezies keine cryptobiotischen
Lebensstadien, vermögen
also keine stoffwechselarmen Dauerformen (Cysten) wie viele ihrer Verwandten
zu bilden, sondern behalten auch unter den Bedingungen der Langzeit-Kultivierung
ihre aktive, vergleichsweise stoffwechselintensive Lebensform bei,
die auf ständiges
Vorhandensein von Nahrung bzw. Nährstoffen
angewiesen ist. Die Rein-Kultivierung dieser labortypischen Arten
erfolgt daher meist in Vollmedien auf der Basis von Proteose-Pepton/Hefeextrakt
(PPY) kultiviert (Cell Biology, 1994, A Laboratory Handbook, Celis
J (ed), Academic Press, London); seltener finden synthetische Medien
mit chemisch definierter Zusammensetzung Verwendung (Szablewski
et al., 1991, Tetrahymena thermophila; growth in the synthetic nutrient
medium in the presence and absence of glucose, J. Protozool, 38,
62-65). Neben der Kultivierung in gelösten Nährstoffen werden auch wässrige Medien
verwandt, die als Nährsubstrat
feste Bestandteile pflanzlichen (meist Zerealien wie Reis oder Getreide)
oder tierischen Ursprungs (Fleisch) enthalten (z.B. Vater-Dobberstein
B, Hilfrich H-G, 1982, Versuche mit Einzellern, Kosmos, Stuttgart).
Besonders letztere Form mit festem Nährsubstrat wird häufig zur
Stammkultivierung der Organismen gewählt.
Die
Stammkultivierung bildet den Grundstock der Kultivierung des biologischen
Materials. Von Stammkulturen wasserlebender Klein- und Kleinstorganismen
ausgehend werden z.B. die eigentlichen Protozoen-Versuchskulturen gezogen, deren Kulturmedium
der jeweiligen biologischen/biochemischen Fragestellung angepasst
ist. Die Stammkultivierung dient in erster Linie dem Zweck, biologisches
Ausgangsmaterial langfristig vorzuhalten und zugleich einer genetischen
Verschiebung („genetic
shift") vorzubeugen,
weshalb die Organismen hier unter Bedingungen sehr geringen oder
stationären
Wachstums, d.h. unter weitgehender Vermeidung der Ausbreitungsmöglichkeit
von Mutanten, gehalten werden. Die Hälterung der Organismen geschieht dabei
in steril verschlossene Gefäßen, wobei
Substrat und Zellen in einem Kultivierungsraum vereint vorliegen.
Mit
zunehmendem Alter bildet sich in Stammkulturen durch absterbende
Organismen Zell-Debris [Fragmente toter (Körper)zellen, Zellfragmente].
Ebenso zersetzt sich im Laufe der Zeit das anfangs noch konsistente,
aus festen Bestandteilen pflanzlichen (Zerealien) oder tierischen
(z.B. Fleisch) Ursprungs bestehende Nährsubstrat. Bei herkömmlichen
Verfahren der Kultivierung in einem einzigen Kultivierungsraum kommt
es – besonders
bei der Entnahme von Zellen – leicht
zur Vermischung dieser partikulären
Abbauprodukte mit der Zellsuspension. Eine für viele Zwecke notwendige genaue
Bestimmung der Zelldichten solcher gealterter Kulturen wird damit
erheblich erschwert. Gebräuchliche
photometrische Methoden werden durch die mit der Vermischung einhergehende
Eintrübung
gestört
und die auch üblichen
elektronischen Zellzählverfahren
sind aufgrund der partikulären
Verunreinigungen nicht direkt anwendbar. Um dennoch die tatsächliche
Zelldichte dieser Stammkulturen zu ermitteln, muss auf zeit- und
arbeitsaufwendige mikroskopische Bestimmungsmethoden zurückgegriffen
werden, oder die Zellen müssen
durch umständliche,
weitere Arbeitsschritte erfordernde Verfahren (z.B. Zentrifugation),
vom Kulturmedium getrennt werden.
Die
Aufgabe der Erfindung ist es, Systeme zur Stammkultivierung wasserlebender
Klein- und Kleinstorganismen zu schaffen, mit denen die genannten
Nachteile der Stammkultivierung überwunden
werden und die eine Stammkultivierung von wasserlebenden Klein-
und Kleinstorganismen insbesondere derart ermöglichen, dass eine Vermischung
abgestorbener Zellbestandteile (Zelldebris) und partikulären Nährsubstrates
bei der Entnahme lebender Zellen vermieden werden kann. Eine weitere
Aufgabe der Erfindung besteht darin, Vorrichtungen zur Implementierung
der Verfahren anzugeben.
Um
ausgehend von bekannten Verfahren zur Stamm-Kultivierung von wasserlebenden
Klein- und Kleinstorganismen, insbesondere von Protozoen (Einzellern), über längere Zeiträume detritus-
und nährstoffpartikelfreie
Organismensuspensionen/Zellsuspensionen zu erreichen (Detritus:
breiige oder krümelige Überreste
zerfallener Gewebs- u. Zellteile), wird erfindungsgemäß vorgeschlagen,
dass die Zellen in einem aus zwei übereinander angeordneten Kammern
bestehenden, steril verschlossenen Kultivierungssystem in Flüssigkeit
gehältert
werden, wobei festes Nährsubstrat
bzw. partikuläre
Nährmediumbestandteile
nur der unteren Kammer (Versorgungskammer) zugesetzt werden, und
die obere Kammer als Reservoir (Organismenreservoir/Zellreservoir)
partikelfreier Organismensuspension/Zellsuspension (Kulturkammer)
dient. Beide Kammern stehen über
eine oder mehrere Öffnungen
miteinander in Verbindung. Ihre Nährstoffe erhalten die Zellen
vorzugsweise aus festen, partikulären Nährsubstraten wie beispielsweise
Zerealien oder Fleisch. Entsprechend ihrer im Vergleich zur Organismensuspension/Zellsuspension
höheren
Dichte und ihrer die Zellen um ein Vielfaches übertreffenden Größe werden
sie dem unteren Teil des Kultivierungssystems zugesetzt. Die Öffnung bzw.
Porenweite der trennenden Schicht zwischen beiden Kammern ist nun
so bemessen, dass Partikel von der Größe der Organismen ungehindert
passieren können,
die Nährpartikel
aber zurückgehalten
werden. Zugleich muss die Öffnung
bzw. Porenweite so gewählt
sein, dass die in der Trennschicht wirkenden Kapillarkräfte stark
genug sind, Flüssigkeit
selbst nach Kippen der Kultivierungseinheit zu halten. Damit ist
gewährleistet, dass
sich im Laufe der Zeit bildender Zelldebris nach unten in die Versorgungskammer
absinken und sich dort ansammeln kann. Umgekehrt wird das partikuläre Nährsubstrat
aufgrund der geringen Porenweite der Trennschicht im unteren Teil
zurückgehalten.
Die
Aufgaben der Erfindung werden durch Verfahren und durch Vorrichtungen
gemäß den Merkmalen des
Patentanspruches 1 gelöst.
Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen beschrieben.
Das
erfindungsgemäße Kultivierungssystem
zur Gewinnung partikelfreier Langzeit-Reinkulturen von Protozoen
besteht darin, dass die Organismen in einem aus zwei übereinander
angeordneten Kammern bestehenden Kultivierungssystem gehältert werden,
die untere Kammer mit festem Nährsubstrat
befüllt
ist (Versorgungskammer), und die obere Kammer als Reservoir (Organismenreservoir/Zellreservoir)
partikelfreier Organismensuspension/Zellsuspension dient (Kulturkammer)
und Versorgungs- und Kulturkammer durch eine offenporige physikalische
Barriere voneinander abgetrennt sind, wobei gilt, dass
- – die
Organismen steril und als Reinkultur kuliviert werden,
- – die
Kultivierungseinheit steril, aber sauerstoffdurchlässig verschlossen
ist,
- – partikuläre, feste
Nährstoffe
pflanzlichen oder tierischen Ursprungs das Ausgangssubstrat der
Kultur bilden und
- – die
physikalische Barriere zwischen den beiden Kammern eine oder mehrere Öffnungen
aufweist, die groß genug
sind, den aktiven Übertritt
von Zellen zu gewährleisten
sowie ein passives Absinken abgestorbener Zellen oder Zellbestandteile
zu ermöglichen,
aber klein genug sind, durch Kapillarkräfte Kulturflüssigkeit
zurückzuhalten
und selbst im gekippten Zustand der Kultivierungseinheit eine Vermischung
der beiden Kammerinhalte verhindern bzw. deutlich reduzieren.
Das
Kultivierungssystem kann als einteiliges oder zweiteiliges System
ausgelegt sein, bei dem die obere Kammer von der unteren abgenommen
werden kann, d.h. beide Kammern vollständig voneinander trennbar sind.
Im Falle einer Zweiteilung lassen sich die Organismen ohne weitere
Hilfsmittel direkt mit der Kulturkammer von der Versorgungskammer
entfernen.
Ein
weiteres Merkmal der Erfindung besteht darin, dass ein sauerstoffdurchlässiger Verschluss
aus einem durchstechbaren Septum besteht, durch das von außen mittels
einer Spritze Zellen steril entnommen werden können, ohne die Kultivierungseinheit öffnen zu
müssen.
Ein Septumverschluss hat neben der Möglichkeit der wiederholten
Entnahme noch den weiteren Vorteil, ohne Sterilraumbedingungen verbrauchte
oder alte Flüssigkeit
in der Kultivierungskammer zu ersetzen bzw. auszutauschen.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
besteht darin, dass die Kultivierungseinheit als Photometer-Küvette ausgelegt
ist. Damit lässt
sich die Dichte der Organismen nicht-invasiv direkt im Kultivierungssystem
noch vor der Entnahme bestimmen und eine definierte Zahl von Organismen
entnehmen.
In
einer hevorzugten Weiterbildung werden als Kultivierungssystem Röhrchen im
96-er Standard-Mikrotiterplattenformat herangezogen. Dies erleichtert
die halb- bzw. vollautomatische
Befüllung
des Kultivierungssystems und ermöglicht
die Herstellung der Stammkulturen in großer Zahl.
Als
wasserlebende Klein- und Kleinstorganismen im Sinne dieser Erfindung
werden beispielsweise Bakterien, Algen, Pilze, Protozoen und kleine
Metazoen (Vielzeller) verstanden.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Gewinnung partikelfreier Langzeit-Kulturen besteht darin, dass die Organismen
in Kultivierungssystemen aus zwei übereinander angeordneten Kammern
so gehältert
werden, dass die als Versorgungskammer dienende untere Kammer mit
festem Nährsubstrat
befüllt
wird und die obere Kammer als Kulturkammer sowie als Reservoir (Organismenreservoir/Zellreservoir)
partikelfreier Organismensuspension/Zellsuspension dient und beide
Kammern durch eine offenporige physikalische Barriere voneinander
abgetrennt werden. Dabei werden die Organismen steril und als Reinkultur
kultiviert und die Kultivierungseinheiten steril, aber sauerstoffdurchlässig verschlossen.
Als Ausgangssubstrat werden in der Kultur partikuläre, feste
Nährstoffe
pflanzlichen oder tierischen Ursprungs eingesetzt. Vorteilhaft erfolgt
die Kultivierung in Standard Glas-Gefäßen mit
Schraubverschluss und einliegendem Septum und in Gefäßen im 96er
Mikrotiterplatten-Format.
Unter
partikelfreien Kulturen im Sinne dieser Erfindung werden solche
verstanden, die weitestgehend frei von nicht lebenden partikulären Bestandteilen
wie Zelldebris oder Nährsubstratpartikeln
sind.
Es
ist eine entscheidende und überraschende
Eigenschaft der vorliegenden Erfindung, dass durch die Kompartimentierung
der Kultivierungseinheit eine von Zelldebris und Nährsubstratpartikeln
freie Organismensuspension/Zellsuspension in der oben liegenden
Kulturkammer erreicht wird: Begünstigt
durch die Schwerkraft sinken in dem aufrecht stehenden, zwei-kammerigen
Kultivierungssystem absterbendes Zellmaterial sowie partikuläre Stoffwechselprodukte
in die unten liegende Versorgungskammer. Umgekehrt wird das partikuläre Nährsubstrat
aufgrund der geringen Porenweite der Trennschicht im unteren Teil
zurückgehalten.
Wird die Kultivierungseinheit z.B. zur Entnahme von Zellmaterial
oder während
eines Transports gekippt, verhindert die Trennschicht bzw. die dort
aufgrund von Kapillarkräften
zurückgehaltene
Flüssigkeit
eine Durchmischung der beiden Kammern. Durch diese Separation werden
damit aufwendige physikalische Verfahren wie Zentrifugation oder
Filtration zur Abtrennung von Partikeln aus der Kultur überflüssig. Durch
den erfindungsgemäßen modularen
Aufbau des Kultivierungssystems wird eine wesentliche Voraussetzung
zur Nutzung dieser Organismen für
eine Reihe biochemischer/molekulargenetischer sowie toxikologischer
Fragestellungen erfüllt.
Neben
dem wesentlichen Vorteil einer von unerwünschten partikulären Verunreinigungen
freien Organismensuspension/Zellsuspension in der oberen Kammer
bewirkt die vertikale Anordnung der Kammern darüber hinaus, dass sich ein Großteil der
in der Kulturvorrichtung vorhandenen Organismen in der oben liegenden
Kulturkammer ansammelt: Erstens zeigen Protozoen eine allgemeine
Tendenz zur Aerotaxis, d.h. sich entlang von Sauerstoffgradienten
zu orientieren und an Orten höheren
Sauerstoffgehaltes, d.h. oben, in Verschlussnähe zu akkumulieren. Und zweitens
nutzt die vertikale Anordnung das häufig bei Protozoen anzutreffende
negativ geotaktische Verhalten der Zellen, das zu einer Bewegung
gegen die Schwerkraft und damit zu einer relativen Anreicherung
der Zellen im oberen Teil der Flüssigkeitssäule führt.
Das
erfindungsgemäße Kultivierungssystem
ermöglicht
es,
- • Zellen
mehrfach der Kulturkammer steril zu entnehmen sowie das entnommene
Volumen durch wässrige Mediumbestandteile
zu ersetzten und damit eine semi-kontinuierliche Weiterkultivierung
der Zellen zu erreichen;
- • die
Organismendichte/Zelldichte ohne vorherige Entnahme von Organismensuspension/Zellsuspension direkt
in der Kulturkammer zu bestimmen;
- • die
Kulturkammer mit der darin enthaltenen partikelfreien Organismensuspension/Zellsuspension
von der Versorgungskammer leicht abtrennen zu können.
Die
Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und
aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als
auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen,
für die
mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Diese Merkmale bestehen
aus an sich bekannten Elementen, die in ihrer neuen Kombination
zu den erfindungsgemäßen vorteilhaften
Kultivierungssystemen führen
und die in ihrer Gesamtheit einen synergistischen Effekt ergeben,
der darin besteht, dass erstmals Kultivierungssysteme zur Gewinnung
partikelfreier Langzeit-Reinkulturen von beweglichen Mikroorganismen
oder kleinen Vielzellern zur Verfügung gestellt werden.
Die
Verwendung der neuen Kultivierungssysteme besteht in der Gewinnung
partikelfreier Langzeit-Reinkulturen von Organismen und weiterhin
darin, dass sie
- – als Küvetten zur direkten photometrischen
Bestimmung der Organismendichte/Zelldichte in der Kulturkammer und
als Photometer-Küvette der
septumverschlossenen Kultivierungs-einheit
- – als
Kultivierungsgefäße im 96er
Mikrotiterplatten-Format
- – als
Vorrichtungen zur Implementierung der erfindungsgemäßen Kultivierungs-verfahren
sowie
- – zur
Bestimmung der Organismendichte/Zelldichte ohne vorherige Entnahme
von Organismensuspension/Zellsuspension direkt in der Kulturkammer
dienen.
Die
Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert werden,
ohne auf diese Beispiele beschränkt
zu sein.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Kultivierungseinheit gemäß 1 werden
beide Kammern 1, 2 von einem zylinderförmigen Gefäß (vorzugsweise
aus Glas oder Kunststoff) umschlossen und durch einen offenporigen
Schaumstoff 3 voneinander getrennt. Offenporiger Schaumstoff
(z.B. Polyurethan-, Polyester- und Polyether-Schäume) ist preiswert und in beinahe
jeder beliebigen Porengröße erhältlich.
Er lässt
sich leicht an die jeweiligen Abmessungen der Kultivierungseinheit
anpassen und kann – bei
entsprechender Wahl der Porengröße – von den
Zellen durchdrungen werden. Wird eine Schichtdicke des Schaumstoffes
von mehreren Millimetern gewählt
und liegt die Porengröße bei maximal
etwa zwei mm, kann zudem erreicht werden, dass selbst im gekippten
Zustand der Kultivierungseinheit keine Bestandteile aus der Versorgungskammer 2 in
die Kulturkammer 1 übertreten und
die Organismensuspension/Zellsuspension 5 verunreinigen,
da sich in den feinen Poren des Schaumstoffes 4 aufgrund
von Kapillarkräften
eine die beiden Kammern 1, 2 trennende, stationäre wässrige Schicht
praktisch ohne Fließbewegungen
bildet. Oben ist die Kultivierungseinheit steril, aber sauerstoffdurchlässig durch
einen Stopfen oder eine Kappe 7 verschlossen. Nach Entfernen
des Verschlusses 7 kann die Organismensuspension/Zellsuspension 5 ohne
Verunreinigungen durch Zelldebris, Detritus oder Nährsubstratpartikel
entnommen werden. Geschieht dies unter sterilen Bedingungen, lassen
sich Zellen wiederholt entnehmen. Wird zugleich das entnommene Volumen
steril durch wässrige
Mediumbestandteile ersetzt, kann eine semi-kontinuierliche Weiterkultivierung
der Stammkultur erreicht werden.