DE4432326C2 - Verfahren zur toxikologischen Prüfung von Werkstoffen, insbesondere Kunststoffen, und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruch 1 sowie auf eine Vorrichtung nach Anspruch 7.

Insbesondere auf dem medizinischen Sektor werden zunehmend Ar­ tikel aus z. B. Kunststoff, aber auch Keramik oder Metallegierungen gefertigt, die z. B. als Implantat unmittelbaren und längeren Kontakt mit lebendem Gewebe haben. Beispiele sind z. B. Endoprothesen, Katheter, Sonden, Herzschrittmacher, Herzklappen, Gefäßprothe­ sen, Brustimplantate aber auch Nahtmaterial, Haftschalen, Zahner­ satz und viele andere Artikel mehr. Bei allen diesen Artikeln muß die Körperverträglichkeit gewährleistet sein, mit anderen Worten, der zur Herstellung verwendete Werkstoff muß physiologisch unbe­ denklich sein.

Bei den in diesem Zusammenhang besonders interessanten Kunst­ stoffen handelt es sich um Polymere, die überwiegend als inert und damit untoxisch gelten. Ursachen einer eventuellen Kunst­ stofftoxizität sind hauptsächlich sekundär und können z. B. auf Materialverunreinigungen, im Herstellungsprozeß eingesetzte Ver­ arbeitungshilfsmittel, Antioxidantien, freie Restmonomere oder auch hydrolytische mikrobiologische und sonstige Abbauprodukte sowie thermische Zersetzungsprodukte zurückzuführen sein.

Gegenwärtig wird die toxikologische Prüfung von z. B. Kunststoffen sowohl in Zellkulturen (z. B. Direktkontakt-Methode, Eluatmetho­ de, Agar-Overlay-Test) als auch im Tierversuch (z. B. Haut- und Schleimhauttest sowie Muskelimplantattest am Kaninchen) durchge­ führt. Durch Verbesserung der Zellkulturtechnik sind in den letzten Jahren verstärkt In-vitro-Methoden für die toxikologische Untersu­ chung von Werkstoffen eingesetzt worden. Ein derartiges Untersu­ chungsverfahren ist z. B. in der Deutschen Optikerzeitung (DOZ) Nr. 3 1982 auf Seite 96 f beschrieben. Hier werden Kontaktlin­ senwerkstoffe auf Polymerbasis auf ihre Eignung untersucht. Dazu werden Zellkulturen in direktem Oberflächenkontakt mit den zu un­ tersuchenden Polymeren inkubiert und über einen längeren Zeit­ raum der morphologische Zustand der Zellen mikroskopisch beob­ achtet. In Abhängigkeit von dem Zellzustand kann dann meist ge­ nauer als im Tierversuch auf den Grad der Toxizität des getesteten Polymerwerkstoffes zurückgeschlossen werden.

Nachteilig an dem beschriebenen Verfahren ist allerdings, daß die morphologischen Veränderungen der Zellen erst nach ein bis drei Tagen zu beobachten sind und frühzeitig auftretende Zellmembran­ schädigungen nicht oder nicht ausreichend empfindlich erfaßt wer­ den. Ein weiterer Nachteil ist die subjektive und nur über ein Punktesystem quantifizierbare Aussage, die mit der beschriebenen Methode erhalten wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zu schaffen, das die beim Oberflächenkontakt des Werkstoffs mit lebenden Zellen ablaufenden pathobiochemischen Mechanismen empfindlich, objektiv und synchron zum Schädigungsbild in vivo erfaßt und darüber hinaus fein differenzierbare quantitative Aussagen liefert. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung bereitzustellen, mit der sich das Verfahren in besonders einfacher Weise durchführen läßt.

Gelöst werden diese Aufgaben mittels eines Verfahrens, das die kennzeichnenden Merkmale des Anspruches 1 enthält, sowie mit einer Vorrichtung gemäß Anspruch 7.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Zellen eingesetzt, deren Zellmembran Arachidonsäure als essentiellen Baustein ent­ halten und die vor der Prüfung mit [³H]Arachidonsäure markiert worden sind. Die markierten Zellen werden in einem Testansatz in Gegenwart des zu prüfenden Werkstoffes und in einem parallelen werkstofffreien Kontrollansatz mit gleichen Zellzahlen inkubiert. Zu definierten Zeiten wird im zellfreien Überstand der Ansätze die Radioaktivität bestimmt. Aus dem Unterschied zwischen den für den Test und den Kontrollansatz gemessenen Werten kann dann eine Aussage über die Toxizität des geprüften Werkstoffes ab­ geleitet werden.

Arachidonsäure ist essentieller Bestandteil der Lipidfraktion von Membranen vieler Zellen. Membranschädigungen, z. B. bei Gewe­ beentzündung, führen zu einer Freisetzung von Arachidonsäure. Diese Tatsache ist bereits seit längerem bekannt. So haben z. B. Stark et al in "Alternative Methods in Toxicology 1" Seiten 179- 203, 1983 beschrieben, daß Hepatomzellen in Gegenwart von z. B. n-Butanol zuvor eingebaute [³H]Arachidonsäure freisetzen.

Überraschend wurde nun festgestellt, daß eine Freisetzung von [³H]Arachidonsäure auch in Gegenwart von festen Werkstoffen erfolgt, wobei ein direkter Kontakt zwischen Zellen und dem Werkstoff nicht gegeben sein muß. Diese Beobachtung war vor allen Dingen deswegen überraschend, weil z. B. bei dem relativ inerten Kunststoff nur geringe Oberflächenwechselwirkungen mit einem umgebenden zellhaltigen Medium zu erwarten sind und Kunststoffe per se in der Regel nur eine äußerst geringe toxische Wirkung haben. Basierend auf dieser Beobachtung wurde das erfindungsgemäße Verfahren entwickelt, das erstmalig unter beson­ derer Berücksichtigung der Membrantoxizität mit guter Reprodu­ zierbarkeit eine differenzierte quantitative toxikologische Bewertung auch von nur geringfügig unterschiedlichen Werkstoffen erlaubt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht auf die oben zitierten U937-Zellinien beschränkt. Es können vielmehr auch andere menschliche bzw. tierische sowie einzelne pflanzliche Zellinien und einzellige Organismen eingesetzt werden. Wichtig ist lediglich, daß die eingesetzten Zellen in ihrer Membran als integralen Be­ standteil Arachidonsäure enthalten und mit relativ geringem Aufwand mit [³H]Arachidonsäure markiert werden können. Die Auswahl geeigneter Zellen bzw. der Einbau von [³H]Arachidon­ säure in die Zellmembran stellt für den Fachmann keinerlei Problem dar.

Die markierten Zellen werden in Gegenwart des Werkstoffes und ohne Werkstoff inkubiert. Zu vorgegebenen Zeiten wird die Radioaktivität im zellfreien Überstand der jeweiligen Ansätze ge­ messen und zueinander in Beziehung gesetzt. Die Messung der Radioaktivität kann in einem herkömmlichen Liquid Scintillation Counter erfolgen. Bei nichttoxischen Werkstoffen sind die Werte im Test- und im Kontrollansatz etwa gleich. Leichte toxische Wirkung liegt vor, wenn die Radioaktivität im zellfreien Überstand des Testansatzes nicht mehr als doppelt so hoch wie im Kontrollansatz ist. Auf mittlere bis starke Toxizität läßt sich aus Werten schließen, die mehr als doppelt so hoch sind.

Um vergleichbare Werte zu erhalten, ist es erforderlich, daß die Zellzahlen in dem Test- und dem Kontrollansatz übereinstimmen. Auch dies läßt sich ohne Probleme von einem Fachmann bewerk­ stelligen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann z. B. in Dienstleistungslabo­ ren durchgeführt werden. Bei entsprechender Ausstattung können alle Schritte des Verfahrens in einem solchen Labor durchgeführt werden. Es ist aber auch möglich, die einzelnen Verfahrensschritte aufzutrennen. So ist es z. B. denkbar, daß mit [³H]Arachidonsäure markierte Zellen in größerem Umfang in einem Spezialbetrieb her­ gestellt werden und in lagerfähiger Form an z. B. Betriebe abge­ geben werden, die die weiteren Schritte des Verfahrens direkt bei sich im Hause durchführen wollen. Denkbar ist es z. B. auch, daß nur die Inkubation der Test- und Kontrollansätze direkt in z. B. dem kunststoffverarbeitenden Betrieb erfolgt und die Proben zentral an einem anderen Ort ausgewertet werden.

Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen ge­ schützt.

Nach Anspruch 2 ist vorgesehen, daß die Prüfung mit menschlichen Zellinien erfolgt. Die bei dieser Prüfung gewonnenen Ergebnisse kommen den Verhältnissen beim Menschen am nächsten und erlau­ ben daher eine gute Voraussage über die Körperverträglichkeit der geprüften Werkstoffmaterialien.

Weitere Ausgestaltungen der Erfindung zielen auf eine Erleichte­ rung bei der Durchführung des Verfahrens.

So ist nach Anspruch 3 vorgesehen, daß die bei der Prüfung einge­ setzten, mit [³H]Arachidonsäure markierten Zellen in lyophilisierter oder kryokonservierter Form bereitgestellt werden. Z.B. lyophili­ sierte Zellen lassen sich unter entsprechenden Bedingungen auch über längere Zeiträume lagern. Es reicht, zu Beginn der Prüfung die lyophilisierten Zellen in z. B. Zellkulturmedium oder destilliertem Wasser aufzunehmen und in die Test- und Kontroll­ ansätze zu pipettieren. Die Prüfung kann dann gegebenenfalls nach einer kurzen Vorkultivierung zur Reaktivierung der lyophilisierten Zellen unmittelbar beginnen.

Noch einfacher gestaltet sich die Durchführung der Prüfung, wenn, wie in Anspruch 4 vorgesehen, die Zellkulturen bereits in den Reaktionsgefäßen immobilisiert sind. Zur Durchführung der Prü­ fung reicht es hier aus, die z. B. Nährlösung in die Reaktionsgefäße zu pipettieren und dann den zu prüfenden Werkstoff zuzusetzen.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß bei entsprechender Aus­ rüstung der Reaktionsgefäße die Immobilisierung der Zellen über den gesamten Prüfungsverlauf erhalten bleiben kann. Die zur Aus­ wertung erforderlichen zellfreien Überstände können dann (ohne Zentrifugation) direkt aus den Reaktionsgefäßen entnommen wer­ den.

Wie oben gesagt, ist es für eine korrekte Durchführung der Prüfung erforderlich, daß die ausgewertete Probe aus dem zellfreien Überstand stammt, also keine Zellen mehr enthält. Um gleiche Be­ dingungen zwischen Test- und Kontrollansatz herzustellen, wird allerdings auch anzustreben sein, daß die zu messende Probe des Testansatzes auch keine Anteile des zu prüfenden Werkstoffes mehr enthält. Je nachdem, wie die Werkstoffprobe geartet ist, Plättchen, Pulver etc., kann es unter Umständen erforderlich sein, daß auch hier ein Zentrifugationsschritt zur Abtrennung durchgeführt werden muß. In diesem Zusammenhang sieht Anspruch 5 in vorteilhafter Weise vor, daß der zu prüfende Werkstoff in einem separaten flüssigkeitsdurchlässigen Gefäß oder einem geeigneten Rahmen in den Testansatz eingesetzt wird. Auf diese Weise ist eine besonders einfache Separierung von Werkstoff und z. B. Zellkulturmedium möglich.

Eine letzte Ausgestaltung des Verfahrens sieht schließlich vor, daß der Test bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt wird. Aus den bei unterschiedlichen Temperaturen gewonnenen Prü­ fungsergebnissen lassen sich Aussagen über die Art der Toxizität des Werkstoffes herleiten. Stellt sich z. B. heraus, daß z. B. bei Re­ aktionstemperaturen von 4°C und 37°C identische Werte gemes­ sen werden, dann kann man darauf schließen, daß die toxische Wirkung des Werkstoffes enzymunabhängig ist. Zeigt sich dagegen eine Steigerung der Toxizität bei 37°C, so kann die Ursache hierfür eine Enzymaktivierung sein.

Weitere Unteransprüche betreffen eine Vorrichtung zur Durch­ führung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Diese Vorrichtung weist mindestens ein Reaktionsgefäß auf, das eine immobilisierte Zellkultur definierter Zellzahl enthält. Es versteht sich, daß es sich auch hierbei um Zellen handelt, in die zuvor [³H]Arachidonsäure eingebaut worden ist. Nach Füllung des Reaktionsgefäßes mit Zellkulturmedium ist die Vorrichtung sofort einsatzbereit.

Um die Lagerfähigkeit derartiger Vorrichtungen zu erhöhen, kann gemäß Anspruch 8 vorgesehen sein, daß die Zellen lyophilisiert oder kryokonserviert sind.

Gemäß Anspruch 9 ist vorgesehen, daß ein in das Reaktionsgefäß einsetzbarer flüssigkeitsdurchlässiger Behälter oder Rahmen zur Aufnahme des zu prüfenden Werkstoffes vorgesehen ist. Die Vor­ teile wurden bereits weiter oben diskutiert.

Eine letzte Ausgestaltung sieht schließlich vor, daß mehrere Reakti­ onsgefäße in einem Träger zusammengefaßt sind. Es kann sich z. B. um eine übliche Mikrotiterplatte handeln.

Im folgenden soll anhand von mehreren Beispielen die Durchfüh­ rung des Verfahrens erläutert werden. Weiterhin wird in einer Abbildung eine besonders bevorzugte Ausführung der erfindungs­ gemäßen Vorrichtung dargestellt.

Beispiele 1 Herstellung von [³H]Arachidonsäure-markierten Zel­ len

10 ml einer Suspension von U937-Zellen mit einer Zelldichte von 2-3 × 10⁵ Zellen/ml in 18 ml RPMI 1640-Medium werden in eine 260 ml Polystyrenzellkulturflasche eingesät. Nach Zugabe von 2 ml fetalem Kälberserum wird für zwei Tage im Begasungsbrutschrank (5% CO₂, 95% Luft) bei 37°C inkubiert. Danach ist etwa eine Zellkonzentration von 10⁶ Zellen/ml verfügbar.

Die Zellen werden dann in sterilen 15 ml-Polystyren-Zentri­ fugenröhrchen bei 200 g und 4°C fünf Minuten zentrifugiert, zweimal unter gleichen Bedingungen mit je 5 ml serumfreiem RPMI gewaschen und in serumfreiem RPMI resuspendiert. Die auf 10⁶ Zellen/ml eingestellte Zellsuspension wird dann in einer neuen 260 ml Zellkulturflasche eine Stunde bei 37°C inkubiert. Danach werden pro 27 ml Zellsuspension 3 ml fetales Kälberserum und 30 µl einer 100 µCi/ml enthaltenden [³H]Arachidonsäurelösung zuge­ geben. Zum Einbau der [³H]Arachidonsäure in die Zellmembran werden die Zellen dann weitere 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation werden die Zellen, wie oben be­ schrieben, zentrifugiert und zweimal mit serumfreiem, auf 4°C temperiertem RPMI gewaschen. Das mit [³H]Arachidonsäure mar­ kierte Zellsediment wird schließlich bei 4°C in 40 ml serumfreiem RPMI in einem sterilen Polystyrengefäß resuspendiert.

Beispiel 2 Prüfung von Reaktionsgefäßen auf ihre membran­ toxische Wirkung

Getestet wurden 10 ml Reaktionsgefäße aus Polystyren und Polypropylen. In die Reaktionsgefäße wurden jeweils 1 ml der ge­ mäß Beispiel 1 hergestellten markierten Zellsuspension gegeben. Anschließend erfolgte eine Inkubation in serumfreiem RPMI für eine Stunde bei 4°C und anschließend 24 Stunden bei 37°C. Nach Ende der Inkubation bei 4°C wurde eine Charge Röhrchen fünf Minuten bei 4°C und 200 g zentrifugiert. Je 0,5 ml des Über­ standes sowie 4,5 ml Szintillator wurden in ein Szintilla­ tionsmeßgefäß gegeben und vermischt. Danach erfolgte die Mes­ sung im Szintillationszähler. Die dabei ermittelte Radioaktivität wurde auf Impulse pro Minute und 0,5 ml (cpm/0,5 ml) umge­ rechnet.

Entsprechend wurde nach einer Stunde Inkubationszeit bei 37°C eine weitere Probe genommen und ausgewertet. Die Ergebnisse der beiden Probennahmen sind in den Tabellen 1a und 1b wiedergegeben.

Tabelle 1a

[³H]Arachidonsäure-Freisetzung nach einstündiger Inkubation von U937-Zellen bei 4°C in Polypropylen(PP)- und Polystyren(PS)-Gefäßen

Tabelle 1b

[³H]Arachidonsäure-Freisetzung nach einstündiger Inkubation von U937-Zellen bei 37°C in Polypropylen(PP)- und Polystyren(PS)-Gefäßen

Die Abkürzung MTF bedeutet Membrantoxizitätsfaktor. Der Mem­ brantoxizitätsfaktor ist der Quotient aus der in den unterschiedli­ chen Reaktionsgefäßen gemessenen Radioaktivität. Seine Größe de­ finiert im vorliegenden Fall den Grad der Kunststofftoxizität. Man erkennt hier, daß Reaktionsgefäße aus Polypropylen bei 4°C und auch bei 37°C eine deutlich höhere [³H]Arachidonsäure-Freiset­ zung bei den in ihnen kultivierten Zellen bewirken. Dies läßt den Schluß zu, daß Polypropylen im Vergleich zu Polystyren deutlich toxischer ist, wobei die toxische Wirkung von Polypropylen ver­ mutlich enzymunabhängig ist.

Beispiel 3 Prüfung einer Gefäßprothese auf ihre mebrantoxische Wirkung

Ein Stück einer Gefäßprothese aus Polyester (Oberfläche ca. 3 mm²) wurde in einem Polystyrenröhrchen, das mit 1 ml einer mit [³H]Arachidonsäure markierten Zellsuspension (Beispiel 1) be­ schickt ist, eine Stunde bei 4°C und eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert. Jeweils am Ende der einstündigen Inkubationen bei 4°C und bei 37°C wurde die [³H]Arachidonsäure-Freisetzung im Zell­ kulturüberstand bestimmt und mit der Freisetzung in den Kon­ trollansätzen (Zellen ohne Zusatz des Testmaterials) verglichen. Die Ergebnisse werden in den Tabellen 2a und 2b wiedergegeben.

Tabelle 2a

[³H]Arachidonsäure-Freisetzung nach einstündiger Inkubation von U937-Zellen in Polystyrenröhrchen (PS) mit und ohne Testpräparat (Gefäßprothese, GP) bei 4°C

Tabelle 2b

[³H]Arachidonsäure-Freisetzung nach einstündiger Inkubation von U937-Zellen in Polystyrenröhrchen (PS) mit und ohne Testpräparat (Gefäßprothese, GP) bei 37°C

Aus den Tabellen ergibt sich, daß der das Gefäßprothesematerial enthaltende Testansatz keine erhöhte [³H]Arachidonsäure-Freiset­ zung im Vergleich zu dem als Kontrollansatz dienenden Polystyren­ röhrchen zeigt. Man kann daraus folgern, daß das geprüfte Gefäßprothesenmaterial in Bezug auf seine Membrantoxizität unbe­ denklich ist.

Die hier beschriebenen Beispiele zeigen nur einen kleinen Aus­ schnitt, in dem das erfindungsgemäße Verfahren umgesetzt werden kann. Es ist selbstverständlich auch möglich und in manchen Fällen sogar geboten, weitere Proben im Verlaufe einer längeren Inkuba­ tion zu nehmen. Es besteht nämlich auch die Möglichkeit, daß die toxische Wirkung des zu prüfenden Werkstoffes nachläßt und die Zellen die zuvor freigesetzte [³H]Arachidonsäure wieder einbauen. Eine solche reversible Schädigung der Zellen würde sich durch eine während der Inkubation zunächst ansteigende und dann wieder abnehmende [³H]Arachidonsäure-Freisetzung feststellen lassen. Auch dies könnte von Interesse bei der Beurteilung der Verträg­ lichkeit des Werkstoffes sein.

Aus dem Vorhergesagten ergibt sich, daß mit dem erfindungsgemä­ ßen Verfahren, wie z. B. in den Beispielen dargelegt, unabhängig von den jeweils spezifisch gewählten Reaktionsbedingungen ein zuverlässiger Vergleich zwischen mehreren Werkstoffmaterialien möglich ist. Es handelt sich stets um eine relative Prüfung, bei dem gegen eine als Leerwert definierte Kontrolle gemessen wird. Es muß dabei sichergestellt sein, daß in die zusammengehörigen Kontroll- und Testansätze gleiche Zellen mit gleicher Aktivität (und in gleicher Zellzahl) gegeben werden und daß die Inkubation unter gleichen Reaktionsbedingungen erfolgt.

Untersuchungen haben ergeben, daß Polystyren keine bzw. eine zu vernachlässigende toxische Wirkung hat. Es bietet sich daher an, bei Prüfung unterschiedlicher Reaktionsgefäße ein Polystyrengefäß als Kontrolle einzusetzen. Sollen dem Ansatz zugesetzte Werkstoffe geprüft werden, dann bietet es sich an, Polystyrenreaktionsgefäße einzusetzen.

Abschließend soll auf die Abbildung eingegangen werden, die einen besonders bevorzugten Träger 10 von Reaktionsgefäßen 11a und 11b zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt. Die Reaktionsgefäße 11a und 11b enthalten jeweils eine Suspension von mit [³H]Arachidonsäure-markierten U937-Zellen 12 in Nährlö­ sung (z. B. RPMI) 13. Zur Abdeckung der Reaktionsgefäße 11a, 11b ist ein Deckel 14 vorgesehen.

Weiterhin ist ein Einsatz 15 vorgesehen, der zwei separate mit Flüssigkeitsdurchlässen 16 versehene und in die Reaktionsgefäße 11a, 11b einsetzbare Behälter 17a und 17b aufweist. In die Behälter kann nun wunschweise der zu prüfende Werkstoff eingegeben wer­ den. Im gezeigten Falle handelt es sich dabei um mehrere Plättchen 18 z. B. eines Kunststoffes, die in dem Behälter 17a angeordnet sind. In dem Reaktionsgefäß 11a wird also der Testansatz inkubiert, während in dem Reaktionsgefäß 11b, dessen Behälter 17b leer bleibt, die Kontrolle inkubiert wird. Die Flüssigkeitsdurchlässe 16 können so dimensioniert sein, daß sie keine Zellen durchlassen. In diesem Fall mißt man selektiv die toxische Wirkung der Substanzen, die vom dem zu untersuchenden Werkstoff an ein umgebendes Medium abgegeben werden. Werden die Flüssigkeits­ durchlässe größer (zelldurchlässig) ausgebildet, so mißt man gege­ benenfalls noch zusätzlich die toxische Wirkung, die auf einen direkten Oberflächenkontakt der Zellen mit dem Werkstoff zurück­ zuführen ist.

Zur Probenentnahme genügt es, den Deckel 14 von dem Träger 10 abzunehmen, danach den Einsatz 15 zu entfernen und die ge­ wünschte Menge Nährlösung 13 aus den Reaktionsgefäßen 11a, 11b zu entnehmen. Es versteht sich, daß die Reaktionsgefäße 11a und 11b und auch der Einsatz 15 aus möglichst neutralem Material hergestellt werden. Es hat sich in diesem Zusammenhang gezeigt, daß Polystyren die beste Zellverträglichkeit aufweist und deswegen als Trägermaterial besonders gut geeignet ist.

Claims (10)

1. Verfahren zur toxikologischen Prüfung von Werkstoffen, insbesondere Kunststoffen, bei dem Zellen unter definierten Reaktionsbedingungen zusammen mit dem zu prüfenden Werkstoff in Flüssigkeitsansätzen inkubiert werden und anhand der Reaktion der Zellen auf den Grad der Toxizität des Werkstoffes zurückgeschlossen wird, dadurch gekenn­ zeichnet, daß Zellen eingesetzt werden, deren Zellmem­ branen Arachidonsäure als essentiellen Baustein enthalten und in deren Membranen zuvor [³H]Arachidonsäure einge­ baut worden ist, die markierten Zellen in einem Testansatz in Gegenwart des zu prüfenden Werkstoffes und in einem werk­ stofffreien Kontrollansatz inkubiert werden, wobei Testansatz und Kontrollansatz auf gleiche Zellzahlen eingestellt sind, zu definierten Zeiten im zellfreien Überstand der Ansätze die Radioaktivität bestimmt wird, und aus dem Unterschied zwi­ schen den für den Test und den Kontrollansatz gemessenen Werten eine Aussage über die Toxizität des geprüften Mate­ rials abgeleitet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen auf Basis menschlicher Zellinien, insbesondere der promyelozytischen humanen Zellinie U937 eingesetzt wer­ den.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Zellen vor oder nach Markierung mit [³H]Arachidonsäure lyophilisiert oder kryokonserviert wer­ den.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Zellen in den eingesetzten Reaktionsgefäßen immobilisiert werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das zu prüfende Material in einem sepa­ raten, flüssigkeitsdurchlässigen Gefäß oder in einen Rahmen eingespannt in den Testansatz eingebracht wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Prüfung bei unterschiedlichen Tempe­ raturen durchgeführt wird.

7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den An­ sprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Reaktionsgefäß (11a, 11b) vorgesehen ist, das eine definierte Zahl von mit [³H]Arachidonsäure markierten Zellen in immobilisierter Form enthält.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen lyophilisiert oder kryokonserviert sind.

9. Vorrichtung insbesondere nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein separater in das Reak­ tionsgefäß (11a, 11b) einsetzbarer, flüssigkeitsdurchlässiger Behälter (17a, 17b) zur Aufnahme des zu prüfenden Mate­ rials vorgesehen ist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch ge­ kennzeichnet, daß mehrere Reaktionsgefäße (11a, 11b) in einem Träger (10) zusammengefaßt sind.