DE19856229C1

DE19856229C1 - Verfahren zur Bestimmung von biologischen Langzeitwirkungen von Stoffen und Kit zur Durchführung des Verfahrens

Info

Publication number: DE19856229C1
Application number: DE1998156229
Authority: DE
Inventors: Jens Zeller; Thomas Zoller
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 1998-12-04
Publication date: 2000-08-31
Anticipated expiration: 2018-12-05
Also published as: WO2000034777A2; WO2000034777A3

Abstract

Die Abschätzung der Langzeitwirkungen von Stoffen auf den tierischen oder menschlichen Organismus war bislang schwierig und z. B. mit Tierversuchen verbunden. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung von biologischen Langzeitwirkungen eines Stoffes, die von seiner Löslichkeit abhängen, mit folgenden Schritten bereit: A) Mischen einer vorbestimmten Menge des Stoffes mit einem Volumen eines Mediums für eine erste vorbestimmte Zeit zur Bildung einer ersten Probe; B) Mischen einer vorbestimmten Menge des Stoffes mit zumindest einem zweiten Volumen des Mediums für zumindest eine zweite vorbestimmte Zeit zur Bildung zumindest einer zweiten Probe; C) Zugeben der Proben zu Ansätzen geeigneter Zellen zum Hervorrufen von mit der biologischen Wirkung korrellierten, messtechnisch erfassbaren Reaktionen der Zellen; D) Messen der hervorgerufenen Reaktionen der Zellen; E) Vergleichen der Reaktionen zur Abschätzung der biologischen Langzeitwirkung in Abhängigkeit von der Löslichkeit des Stoffes. Das Verfahren ermöglicht die Abschätzung der Langzeitauswirkung von Stoffen auf Organismen durch In-vitro-Versuche. Es ist einfach, preisgünstig, schnell und ethisch unbedenklich durchführbar.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von solchen biologischen Langzeitwirkungen eines Stoffes, die von der Löslichkeit des Stoffes oder vom Herauslösen ("Auslaugen") bioaktiver Komponenten im Körper abhängen.

In den tierischen oder menschlichen Organismus eingebrachte Stoffe können in Wechselwirkung mit den Organismen treten und dadurch Reaktionen hervor rufen. Solche Reaktionen können oftmals eine Schädigung des Organismus bis hin zu seinem Tod verursachen. Wenn Stoffe für den Organismus schädlich sind, spricht man von ihrer Toxizität. Eine Toxizität kann z. B. auch in der Induzierung von Tumoren liegen, vor allem, wenn die Stoffe als "Depotgifte" fungieren.

Gerade bei neuartigen Stoffen, die in die Umgebung von Mensch und Tier einge führt werden sollen, ist es wichtig, zu prüfen, ob diese Stoffe in den Organismus gelangen können, z. B. durch Aufnahme über die Haut, oral, oder inhalativ, und ob die Stoffe eine toxische Wirkung haben.

Neben einer sofort einsetzenden toxischen Wirkung von Stoffen, die sich leicht nachweisen läßt, können Stoffe auch eine langsamere Wirkung haben, deren Messung erheblich schwieriger ist. Es hat sich gezeigt, daß die Löslichkeit einiger Stoffe einen Einfluß auf die Langzeitwirkung haben kann, da eine Löslich keit und damit verbundene kürzere Biopersistenz zu einer verringerten Einwir kung auf den Organismus und damit zu einer kleineren Reaktion führen.

So hat sich beispielsweise gezeigt, daß das krebserzeugende Potential inhalier barer Fasern von ihrer Geometrie, d. h. dem Verhältnis von Faserlänge zu Durch messer, und von ihren chemisch-physikalischen Eigenschaften abhängen, wobei die Biopersistenz in der Lunge maßgeblich von den chemisch-physikalischen Parametern abhängt. Je schneller nämlich eine inhalierte Faser in der Lunge durch Auflösung oder Abtransport eliminiert wird, umso geringer ist ihr langzeit toxikologisches Risiko. Die Auflösung und der Abtransport hängen wiederum auch von der Löslichkeit der Faser ab. Es konnte hierbei gezeigt werden, daß die eigentliche Reaktion von Zellen, wie z. B. Phagozyten, auf die Exposition mit bestimmten Fasern in einer Erhöhung der Abgabe von Sauerstoffradikalver bindungen (reactive oxygen species, ROS) besteht. Diese Sauerstoffradikalver bindungen scheinen dann durch die von ihnen hervorgerufenen Zerstörungen an zellulären Strukturen die eigentlich Verantwortlichen für die Toxizität der Fasern zu sein. Eine schnellere Entfernung der fraglichen Stoffe aus dem Organismus verringert also das Risiko einer Radikal-bedingten Schädigung des Organismus.

Es kann daher von großer Wichtigkeit für die Bewertung der Langzeiteffekte eines Stoffes sein, seine Biopersistenz im Organismus festzustellen.

Im Stand der Technik sind bislang verschiedene Ansätze zu einer solchen Be stimmung vorgenommen worden.

Im Tierversuch wurde Tieren der zu untersuchende Stoff durch Inhalation, In stillation oder Implantation verabreicht und nach einer Wartezeit das Tier getötet und auf Stoffrückstände, z. B. Faserrückstände, untersucht. Alternativ wurde gewartet, bis ein karzinogener Effekt auftrat, sofern ein solcher bei dem Stoff untersucht werden sollte. Tierversuche sind jedoch ethisch bedenklich, langwie rig und zudem mit hohen Kosten verbunden.

Ein weiterer Ansatz besteht in der Durchspülung des zu untersuchenden Stoffes mit verschiedenen Salzlösungen und einer Quantifizierung der Stoffauflösung durch Analyse der Bestandteile in der Spülflüssigkeit. Alternativ wurde mit einer Dispersion statt einer Spülung gearbeitet. Die Analyse von Stoffbestandteilen in der Suspensions- bzw. Spülflüssigkeit erlaubt zwar einen indirekten Rückschluß auf die Lösung von Stoffbestandteilen, aber keine direkte Aussage über das reaktive Potential verbliebener, noch nicht gelöster Bestandteile.

DE 44 32 326 A1 betrifft ein Verfahren zur toxikologischen Prüfung von Werkstoffen, insbesondere Kunststoffen, bei dem Zellen unter definierten Reaktionsbedingungen zusammen mit dem zu prüfenden Werkstoff in Flüssigansätzen inkubiert werden und anhand der Reaktion der Zellen auf den Grad der Toxizität des Werkstoffs zurück geschlossen werden kann, wobei Zellen eingesetzt werden, deren Zellmembran Arachi donsäure als essentiellen Baustein enthalten und in deren Membran zuvor [³H]Arachi donsäure eingebaut worden ist.

DE 44 26 496 A1 betrifft ein Verfahren zur Prüfung von ausgerüsteten Texti lien/Bekleidungsstücken auf ökotoxikologische Unbedenklichkeit durch Bioindikation über Bakterienhemmteste.

DE 41 19 079 A1 betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Abgabe von biologisch aktiven Stoffen aus Holzwerkstoffen mittels der Ermittlung der Leuchtkraftänderung von zugebenen Leuchtbakterien.

Es besteht daher weiterhin ein Bedarf an einem Verfahren, durch eine zuverlässige und einfache Bestimmung der biologischen Wirkung eines Stoffes Hinweise auf seine Löslichkeit und ggf. Biopersistenz zu erhalten. Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein solches Verfahren bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren gemäß dem unabhängigen Patentanspruch 1. Weiterhin stellt die Erfindung ein Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß dem unabhängigen Patentanspruch 15 bereit. Weitere vor teilhafte Ausgestaltungen und Aspekte ergeben sich aus den abhängigen An sprüchen, der Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen.

Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von biologi schen Langzeitwirkungen eines Stoffes, die von seiner Löslichkeit abhängen, mit folgenden Schritten:

A) Mischen einer vorbestimmten Menge des Stoffes mit einem Volumen eines Mediums für eine erste vorbestimmte Zeit zur Bildung einer ersten Probe;
B) Mischen einer vorbestimmten Menge des Stoffes mit zumindest einem zweiten Volumen des Mediums für zumindest eine zweite vorbestimmte Zeit zur Bildung zumindest einer zweiten Probe;
C) Getrenntes Zugeben der Proben zu Ansätzen geeigneter Zellen zum Her vorrufen von mit der biologischen Wirkung korrelierten, meßtechnisch erfassbaren Reaktionen der Zellen;
D) Messen der hervorgerufenen Reaktionen der Zellen;
E) Vergleichen der Reaktionen zur Abschätzung der biologischen Langzeitwir kung in Abhängigkeit von der Löslichkeit des Stoffes.

Vorzugsweise ist die zu bestimmende biologische Langzeitwirkung die Toxizität des Stoffes, wobei die Toxizität des Stoffes auf seinem Vermögen beruhen kann, eine Initiation einer Sauerstoffradikalfreisetzung aus den Zellen zu bewir ken. Die zu untersuchenden Stoffe können beispielsweise (Mineral)fasern, Stäu be, Xenobiotika und weitere (potentielle) Inhalationsnoxen sein.

Die verwendeten Zellen sind Zellen mit "respiratory-burst"-Aktivität, wie z. B. Phagozyten (Makrophagen, Monozyten, Granulozyten), Lungenzellen (Alveolare pithelzellen) oder immortalisierte Zellinien dieser oder ähnlicher Zelltypen oder andere (Tumor)-zellinien mit "respiratory-burst"-Aktivität von Mensch oder Tier. Es zeigt sich beispielsweise als hervorgerufene Reaktion eine Chemilumineszenz.

Die zur Erzeugung eines ausreichend hohen Chemilumineszenzsignals der jeweili gen Zellzahl angepaßte Menge der zu untersuchenden Stoffe beträgt vorzugs weise 100-500 µg Staub pro 5 × 10⁵ Zellen, vorzugsweise um 250 µg Staub. Versuchsansätze mit Zellzahlen im Bereich ≧ 5 × 10⁵ Zellen/ml bis ≦ 5 × 10⁶ Zellen/ml und Staubmengen im Bereich von 25 µg/ml bis 500 µg/ml haben sich bewährt.

Vorzugsweise wird die erste Probe so angesetzt, daß die erste vorbestimmte Zeit so bemessen ist, daß der zu untersuchende Stoff in dem Volumen des Medium gerade suspendiert ist, d. h. mehr oder minder unmittelbar nach dem Mischen von Stoff und Medium, während die zweite und jede weitere vorbe stimmte Zeit so bemessen sein kann, daß der zu untersuchende Stoff in dem Volumen des Medium für eine längere Zeit gemischt wird, so daß zumindest ein Teil des Stoffes Veränderungen unterworfen sein kann. Typische Werte liegen hierbei im Bereich von Wochen bis Monaten, vorzugsweise 2-6 Wochen für eine Kurzzeitinkubation. Für eine Langzeitinkubation sind Zeiträume von mehr als 6 Wochen bis mehrere Monate anzusetzen.

Das Medium, das zum Lösen bzw. Mischen des Stoffes verwendet wird, kann vorzugsweise in seiner Fähigkeit zur Dispension von Stoffen bestimmten Körper flüssigkeiten entsprechen, beispielsweise solchen aus dem Bereich des Körpers, der für die jeweilige Fragestellung interessant ist. Vorzugsweise handelt es sich um H₂O, simulierte Lungenflüssigkeiten, (modifizierte) Gamble-Lösungen, physio logische Salz- oder Kochsalzlösungen (z. B. 0,9% NaCl-Lösung), Ringerlösung, Sörensen-Puffer, Veronal-Pufferoder andere Pufferlösungen, wie z. B. angegeben in Documenta Gligy Wissenschaftliche Tabellen (6. Aufl., S. 277) oder in Gibco Produktkatalog (1996-1997, S. 77-84 u. 881. Es ist zu berücksichtigen, daß die Puffer und Lösungen selbst das Ausmaß der Chemilumineszenz beeinflussen können.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß Proben des zu untersuchen den Stoffes, die unterschiedlich lange inkubiert wurden, um Unterschiede in ihrer biologischen Wirkung in Abhängigkeit von ihrer Löslichkeit festzustellen, zu Zellansätzen gegeben werden, woraufhin die Zellen eine Reaktion zeigen, die meßtechnisch erfassbar ist. Es ist daher vor konkreter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendig, eine meß technisch erfassbare Reaktion der Zellen zu bestimmen, die mit der zu untersu chenden Langzeitwirkung des untersuchten Stoffes korrelliert ist.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine bestimmte Menge des zu unter suchenden Stoffes, z. B. eine Mineralfaser, mit einem geeigneten Medium, z. B. einer Salzlösung gemischt, um eine Suspension oder Lösung zu bilden. Hierbei werden zumindest zwei verschiedene Proben hergestellt, von denen die eine für einen längeren Zeitraum, z. B. mehrere Wochen, inkubiert wird, um eine (Teil)Lösung des Stoffes in dem Medium zu ermöglichen, während die andere Probe frisch hergestellt wird und unmittelbar nach der Suspension oder Durchmischung zur Bestimmung verwendet wird. Es ist auch möglich, mehrere Proben herzustellen, die unterschiedlich lange inkubiert werden, um von der Löslichkeit abhängige Effekte über die Zeit besser verfolgen zu können. Weiterhin ist es möglich, die erste Probe nicht unmittelbar nach ihrem Ansatz zu verwenden, sondern ebenfalls für eine vor bestimmte Zeit zu inkubieren.

Die verschiedenen, zumindest zwei Proben werden dann zu einer entsprechen den Zahl von Ansätzen geeigneter Zelle gegeben. Die Zellen können z. B. in einer Suspension in einem geeigneten Nährmedium vorliegen, so daß lediglich die beiden Flüssigkeiten miteinander vermischt werden müssen.

Unmittelbar nach Zugabe einer Probe des gemischten oder gelösten Stoffes zu dem Zellansatz wird die zu messende Eigenschaft gemessen, bei Verwendung von Mineralfasern beispielsweise die Chemilumineszenz. Dies kann beispiels weise mit einem handelsüblichen Luminometer geschehen. Der Unterschied in der Chemilumineszenz zwischen der kurz inkubierten, frischen Probe und der bzw. den vorinkubierten Proben wird bestimmt, indem entweder die Höchst werte an Chemilumineszenz (oder einer anderen Größe) der Proben, oder die Integrale der Chemilumineszenz über die Zeit dieser Proben bestimmt und miteinander verglichen werden. Das Verhältnis der so bestimmten Werte erlaubt eine Abschätzung der Langzeitwirkung bezüglich der Eigenschaft, die mit der hervorgerufenen Reaktion korrelliert ist. Es kommt dabei nicht auf die Absolut werte der erreichten Chemilumineszenz an, sondern auf das Verhältnis der ermittelten Werte, um zu einer Abschätzung der (Langzeit) Toxizität zu kommen.

Eine besonders interessante Gruppe von Stoffen zur Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung sind die Mineralfasern, insbesondere auch die lungen gängigen Mineralfasern. Im folgenden wird beispielhaft die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf solche Fasern beschrieben, wobei die zur Messung der Reaktion der Zellen verwendete Größe die von bestimmten, zu diesem Zweck geeigneten Zellen abgestrahlte Biolumineszenz ist.

Es versteht sich jedoch, daß auch andere Stoffgruppen von der Erfindung mit umfasst sein sollen und andere Reaktionen der Zellen denkbar sind, solange diese meßtechnisch erfasst werden können.

Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren schnell auf ihr toxikologisches Lang zeitrisiko überprüfbaren künstlichen Mineralfasern werden weltweit in großen Mengen zum Zwecke der Isolierung, Wärmedämmung etc. produziert und haben hier natürliche Mineralfasern, wie z. B. Asbest, weitestgehend ersetzt. Es zeigte sich, daß adverse gesundheitliche Effekt auch bei diesen künstlichen Fasern nicht ausgeschlossen werden können, welche möglicherweise von ihrer Größe, Respirierbarkeit, Lungengängigkeit und Biopersistenz im Lungengewebe ab hängen. Bezüglich der Beseitigung der Fasern aus der Lunge werden verschiede ne Mechanismen diskutiert, zu denen Aufbrechen der Fasern und Auflösen gehören. Somit stellt das erfindungsgemäße Verfahren ein nützliches Mittel zur Verfügung, um über die Auswirkung von Fasermischungen bzw. Suspensionen wiederum einen Rückschluß auf die Eliminierbarkeit der Fasern aus dem Körper und damit indirekt auf deren Toxizität zu ermöglichen.

Zur Anwendung des Verfahrens war es allerdings notwendig, eine geeignete Reaktion von Zellen zu identifizieren, die eine solche Abschätzung ermöglichten.

Wie bereits oben dargestellt, kommt es bei bestimmten Zelltypen, z. B. bei Makrophagen, nach Kontakt mit Fasern zu einer Sauerstoffradikalfreisetzung, deren direkte Messung jedoch schwierig ist. Diese Zellen zeigen jedoch bei Radikalfreisetzung das Phänomen der Chemilumineszenz, welches sich auf einfache Weise mittels geeigneter Meßgeräte quantitativ erfassen lässt. Mithin ist die Ausbildung einer Chemilumineszenz eine geeignete, meßtechnisch erfass bare Reaktion auf die Einwirkung durch die Mineralfasern. Die Chemilumines zenz-Bestimmung ermöglicht hier eine Einschätzung der Löslichkeit bzw. Biodu rabilität der untersuchten Stoffe. Die Chemilumineszenz kann ggf. durch Stoffe, wie Luminol oder Lucigenin, verstärkt werden.

Es sind jedoch auch andere Meßgrößen vorstellbar, die sich bei Einwirkung von Stoffen auf Zellen verändern, wie z. B. der pH. Auch solche Größen können zur Feststellung einer Reaktion auf einen bestimmten Stoff im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.

Für die vorliegende Anwendung hat es sich als praktisch erwiesen, eine immor talisierte Tumorzelllinie einzusetzen, die sich nach Behandlung, beispielsweise mit Calcitriol, differenziert und in eine Zellinie übergeht, die makrophagenähn liche Eigenschaften hat. Beispielsweise zeigte es sich, daß nach Exposition differenzierter Zellen vom Typ HL-60 (HL-60-M-Zellen) mit Quarz diese ein nahezu identisches Chemilumineszenzprofil zeigten wie Rinderalveolarmakropha gen. Durch Verwendung dieser immortallisierten Zellinie oder anderer, ähnlicher Zellinien ist eine einfache und schnell reproduzierbare, standardisierbare Metho dik entwickelbar, die für die Gewinnung von Makrophagen keine Tiere benötigt.

Im folgenden wird die Erfindung im Detail erläutert, wobei auf die Figuren Bezug genommen wird, in denen folgendes dargestellt ist:

Fig. 1 zeigt in Diagrammform die hervorgerufene Chemilumineszenz von Zellen nach Kontakt mit verschiedenen Mineralfasern im zeitlichen Verlauf,

Fig. 2 zeigt als Balkendiagramm zusammengefaßt aus mehreren Experi menten die jeweils größten Ausschläge ("Peaks") an Chemilumi neszenz bei den verschiedenen Materialien aus Fig. 1 und die ent sprechenden Integrale unter den in Fig. 1 dargestellten Kurven.

Die Erfindung wird weiter anhand des nachfolgenden Beispiels beschrieben.

Beispiel

Im folgenden soll die vorliegende Erfindung an einem Beispiel erläutert werden. Dieses ist auf die Bestimmung der Langzeittoxizität/Kanzerogenität von minerali schen Fasern gerichtet, wobei als zelluläre Reaktion die Chemilumineszenz be stimmt wird. Es versteht sich jedoch, daß dieses Beispiel nicht als limitierend zu verstehen ist und andere Stoffe, Langzeitwirkungen und meßtechnisch erfass bare Reaktionen ebenfalls von der Erfindung umfasst sind.

Mineralfasern

Es wurden beispielhaft folgende Stäube und Mineralfasern untersucht:

Quarz: Dieser Staub wies Charakteristika auf, die in Stöber und Arnold, 1960, Betr. Silikose-Forschung [Sonderbd. Grundlagen Silikose-Forschung] 4: 73-85 beschrieben sind. Die Quarzproben wurden freundlicherweise von Dr. E. Schiller, Heusenstamm als Muster zur Verfügung gestellt.

Glaswolle, Code A: Diese Mineralfaser weist folgende Dimensionsanteile auf: Durchmesser (D) < 1 µm: 84%; Länge (L) < 5 µm: 13,5%, 5-15 µm: 43,5%, 15-30 µm: 19%, 30-50 µm: 10,5%, < 50 µm: 13,5%. Diese Faser kann z. B. von der Grünzweig + Hartmann AG, Ludwigshafen, Deutschland, bezogen werden.

Steinwolle, Code G: Diese Mineralfaser weist folgende Dimensionsanteile auf: D < 1 µm: 8,3%; L < 5 µm: 14,3%, 5-15 µm: 51,7%, 15-30 µm: 21,6%, 30-50 µm: 8,6%, < 50 µm: 3,8%. Auch diese Faser kann z. B. von der Grün zweig + Hartmann AG, Ludwigshafen, Deutschland, bezogen werden.

Krokydolith-Faser: Diese Mineralfaser weist folgende Dimensionsanteile auf: D < 1 µm: 97,3%; L < 5 µm: 45,3%, 5-15 µm: 40,7%, 15-30 µm: 6,3%, 30-50 µm: 4%, < 50 µm: 3,7%. Auch diese Faser kann z. B. von der Grün zweig + Hartmann AG, Ludwigshafen, Deutschland, bezogen werden.

Erionit-Faser: Diese Mineralfaser weist folgende Dimensionsanteile auf: D < 1 µm: 89,2%, < 2 µm: 99%, < 3 µm: 100%; L < 5 µm: 63,7%, 5-15 µm: 30,4%, < 15 µm: 4,9%. Auch diese Faser kann z. B. von der Grünzweig + Hartmann AG, Ludwigshafen, Deutschland, bezogen werden.

Steinwolle MMVF21: Diese Faser hat einen mittleren Durchmesser von 0,9 µm und eine mittlere Länge von 44 µm. Eine weitere Charakterisierung der Eigen schaften findet sich in Bellmann et al., Environ. Health Perspect. 102 (Suppl. 5), 185-189 (1994). Diese Faser kann z. B. von der Deutsche Rockwool Mineral woll-GmbH, Gladbeck, Deutschland, bezogen werden.

HT-N: Diese Faser gehört zur HT-Gruppe, die eine höhere Löslichkeit bei pH = 4,5 aufweist. Sie weist folgende Dimensionsanteile auf: D < 5 µm: 40,73%, 0,5-1,0 µm: 28,81%, 1-1,5 µm: 16,56%, 1,5-2 µm: 8,94%, < 2 µm: 4,97%; L < 5 µm: 12,25%, 5-10 µm: 21,19%, 10-15 µm: 16,56%, 15-20 µm: 12,91%, < 20 µm: 37,09%. Auch diese Faser kann z. B. von der Deutsche Rockwool Mineralwoll-GmbH, Gladbeck, Deutschland, bezogen werden.

Herstellung der Zellansätze

Die humane, promyelozytäre Zellinie HL-60 wurde unter 5% Kohlendioxid in RPMI-1640 Medium gehalten (vgl. Zoller et al., Toxicology Letters 87, 131-138 (1996)). Üblicherweise wurden die Zellen zweimal pro Woche mit einer Konzen tration von 250000 Zellen/ml passagiert. Zur Differenzierung der Zellen zu HL-60-M wurden diese für 96 h in einer Dichte von 300.000 Zellen/ml in phenol rotfreiem Medium unter Zusatz von 10E-7 M 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (VD3) kultiviert. VD3 wurde hierbei in Ethanol verdünnt; die Endkonzentration an Ethanol betrug 1%.

Herstellung der Proben

Die Mineralfaser(stäube) (250 µg/ml) wurden in physiologischer Kochsalzlösung oder Sörensen-Phosphatpuffer suspendiert bzw. gemischt. Eine Probe wurde unmittelbar nach ihrem Ansatz verwendet, während zumindest eine andere Probe für 3-6 Wochen, üblicherweise für vier Wochen, präinkubiert wurde, bevor die Proben zu den Ansätzen gegeben wurden

Durchführung der Messung

Die Suspensionen von Fasern wurden jeweils zu gleichen Ansätzen von HL-60-M Zellen gegeben und unmittelbar nach Durchmischung der Messung in einem Berthold LB9505C Luminometer (Fa. Berthold, Deutschland) unterworfen. Hierbei wurden 500 000 Zellen in 1 ml Dulbecco's Medium ohne Phenolrot mit 10^-8 M Luminol (Sigma) für 250 µg Staub oder Mineralfaser verwendet. Die Messung wurde bei 37°C durchgeführt, für mind. 1 h fortgesetzt und mit jeweils neuen Ansätzen mind. dreimal wiederholt.

Ergebnisse

Fig. 1 zeigt typische Ergebnisse der Chemilumineszenz-Messungen der ver schiedenen eingesetzten Mineralfasern, jeweils vorinkubiert und nicht vorinku biert. Nach einem Anfangs-"Peak" der Chemilumineszenz von etwa 5-10 Minu ten erniedrigte sich diese über 30-60 Minuten, um schließlich nach dieser Zeit abzuklingen. In allen Versuchen zeigten die mit Quartz stimulierten Zellen die höchsten Chemilumineszenz-Werte. Wie in Fig. 1a gezeigt, ergab sich hier bei Quarz ein Höchstwert von 6,5 × 10⁶ cpm (counts per minute). Demgegenüber betrug der Höchstwert bei Code A und G Fasern 2 × 10⁶ cpm (Fig. 1a). Der entsprechende Höchstwert dieser Fasern nach einer vierwöchigen Vorinkubation in physiologischer Kochsalzlösung fiel unter 0,5 × 10⁶ cpm. Wie in Fig. 1b dargestellt, zeigen demgegenüber MMVF21 und HT-N Fasern eine erhöhte Chemilumineszenz nach Vorinkubation gegenüber nicht vorinkubierten Fasern. Bei Erionit und Krokydolith (Fig. 1c) waren die Unterschiede deutlich weniger ausgeprägt, mit einer Tendenz zu höheren Werten bei vorinkubierten Fasern.

Fig. 2 faßt die obigen Ergebnisse unter Zusammenfassung mehrfacher Reproduk tionen in Balkendiagrammen zusammen. Hierbei zeigt Fig. 2a die jeweiligen Höchstwerte der Chemilumineszenz; Fig. 2b zeigt die Integrale über die Zeit der Chemilumineszenz. Neben den Unterschieden zu Quarz als stärkstem Induktor sind auch hier die oben dargestellten Unterschiede zwischen den einzelnen Faser-Typen deutlich erkennbar. Die Schwankungsbreiten bei den Balken ent sprechen der Standardabweichung (standard deviation, SD). Die mit einem Stern gekennzeichneten Balken unterscheiden sich signifikant gemäß dem Student t-Test mit p ≦ 0,05 von den entsprechenden Ergebnissen, die ohne Vorinkuba tion erhalten wurden.

Da die Löslichkeit von Mineralfasern vom pH der Lösung abhängt und die Lösung der Fasern im Zeitverlauf während der Präinkubation den pH beeinflussen könn te, wurden bei einigen der Fasern die pH-Werte der Proben nach der Präinkuba tion bestimmt. Es ergaben sich folgenden Werte nach 4 Wochen Inkubation in ungepufferter Kochsalzlösung:

Glaswolle (Code A): Erhöhung von 7,2 auf 9,7
Steinwolle (Code G): Erhöhung von 7,2 auf 9,3
MMVF21: Erniedrigung von 7,2 auf 5,5
HT-N: Erniedrigung von 7,2 auf 6,3

Um auszuschliessen, daß die Erniedrigung der Chemilumineszenz bei präinkubier ten Glas- und Steinwollefasern auf die pH-Änderungen zurückzuführen ist, wurden entsprechende Proben in einem gepufferten System, nämlich in Sören sen Puffer mit pH 5,0 und 7,4, angesetzt. Es zeigte sich, daß die zuvor festge stellte Tendenz einer Absenkung der Chemilumineszenz nach Präinkubation auch in diesem gepufferten System vorhanden war.

Da die Chemilumineszenz mit der Menge der durch reaktive Sauerstoffzwischen stufen gebildeten Photonen korreliert ist, ermöglicht deren Bestimmung einen Rückschluß auf das Toxizitätsrisiko über einen längeren Zeitraum. Es zeigt sich, daß bei Glaswolle und Steinwolle die Langzeittoxizität geringer sein dürfte, da die Fasern ihre Fähigkeit zur Sauerstoffradikalinduktion verlieren. Da die stichpro benartige Untersuchung von Proben gezeigt hat, daß sich Fasermorphologie und Faserzahl innerhalb des Inkubationszeitraums nicht sichtbar geändert haben, muß vermutet werden, daß Umwandlungen an der Oberfläche der einzelnen Fasern, z. B. Gel-Schicht-Bildung oder Auslaugung für diese Abnahme der Chemi lumineszenz verantwortlich sind. Bei den Fasern MMVF21 und HT-N deutet die Zunahme der Chemilumineszenz auf ein sich über die Zeit sogar noch erhöhen des Potential zur Sauerstoffradikalinduktion hin, so daß diese Fasern als kriti scher bezüglich einer Langzeitexposition im Organismus anzusehen sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt erstmalig ein Mittel zur Verfügung, die Langzeit-Einwirkung von Stoffen (Stäuben, Fasern, Xenobiotika, andere Inhala tionen, Noxen) auf Organismen in vitro zu untersuchen. Das Verfahren ist einfach und schnell durchführbar und führt zu aussagekräftigen Ergebnissen, die auf die in-vivo Situation zu übertragen sind. Es ist preisgünstig und spart auf wendige und ethisch bedenkliche Tierversuche ein. Bei Verwendung immortali sierter Zellinien, wie im Beispiel angegeben, werden keine Tiere für die Gewin nung von Zellen benötigt. Das Verfahren könnte von Produzenten chemischer Stoffe eingesetzt werden, um verschiedene Langzeitwirkungen bei der Entwick lung neuer Stoffe abschätzen zu können.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von biologischen Langzeitwirkungen eines Stoffes, die von seiner Löslichkeit abhängen, mit folgenden Schritten:

A) Mischen einer vorbestimmten Menge des Stoffes mit einem Volu men eines Mediums für eine erste vorbestimmte Zeit zur Bildung einer ersten Probe,
B) Mischen einer vorbestimmten Menge des Stoffes mit zumindest einem zweiten Volumen des Mediums für zumindest eine zweite vorbestimmte Zeit zur Bildung zumindest einer zweiten Probe;
C) Getrenntes Zugeben der Proben zu Ansätzen geeigneter Zellen zum Hervorrufen von mit der biologischen Wirkung korrelierten, meß technisch erfassbaren Reaktionen der Zellen;
D) Messen der hervorgerufenen Reaktionen der Zellen;
E) Vergleichen der Reaktionen zur Abschätzung der biologischen Langzeitwirkung in Abhängigkeit von der Löslichkeit des Stoffes.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestim mende biologische Langzeitwirkung die Toxizität des Stoffes ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Toxizität des Stoffes auf seinem Vermögen beruht, eine Initiation einer Sauerstoff radikalfreisetzung aus den Zellen zu bewirken.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Stoff ein lungengängiger Staub ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Stoff (Mineral)fasern, Stäube, Xenobiotika und weitere (potentiel le) Inhalationsnoxen umfasst.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen von Zellen mit "respiratory burst"-Aktivität entstammen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen vor Verwendung bereits über "respiratory burst"-Aktivität verfügen oder zur Erlangung dieser Eigenschaft ausdifferenziert werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Phagozyten sind oder einer immortalisierten Tumorzellinie entstammen.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die hervorgerufene Reaktion eine Chemilumineszenz der Zellen ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Chemilumi neszenz mit Luminol oder Lucigenin verstärkt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der Chemilumineszenz mit einem Biolumineszenzanalysator oder mittels Elektronenspinresonanz-Spektrometrie erfolgt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die erste vorbestimmte Zeit so bemessen ist, daß der zu untersuchen de Stoff in dem Volumen des Medium gerade suspendiert ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest zweite vorbestimmte Zeit so bemessen ist, daß der zu untersuchende Stoff in dem Volumen des Medium für eine längere Zeit gemischt wird, so daß zumindest ein Teil des Stoffes Veränderungen unterworfen sein kann.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium in seiner Fähigkeit zur Dispension des Stoffes einer Körperflüssigkeit entspricht.

15. Kit zur Bestimmung einer biologischen Langzeitwirkung eines Stoffes, die von seiner Löslichkeit abhängt, aufweisend Zellen, die bei Exposition mit dem Stoff eine meßtechnisch erfassbare Reaktion zeigen, welche mit der biologischen Langzeitwirkung des Stoffes korreliert ist, und ein Medium zum Suspendieren und/oder Lösen des Stoffes

16. Kit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende biologische Langzeitwirkung die Toxizität des Stoffes ist.

17. Kit nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Toxizität des Stoffes auf seinem Vermögen beruht, eine Initiation einer Sauerstoff radikalfreisetzung aus den Zellen zu bewirken.

18. Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Stoff ein lungengängiger Staub ist.

19. Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Stoff (Mineral)fasern, Stäube, Xenobiotika und weitere (potentielle) Inhalationsnoxen umfasst.

20. Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen über "respiratory-burst"-Aktivität verfügen, insbesondere einer immortalisierten Zellinie entstammen oder Phagozyten sind.

21. Kit nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen vor Ver wendung ausdifferenziert sind.

22. Kit nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Makropha gen sind.

23. Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion eine Chemilumineszenz der Zellen ist.

24. Kit nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Kit weiterhin Luminol oder Lucigenin zur Verstärkung der Chemilumineszenz umfasst.

25. Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium in seiner Fähigkeit zur Dispension des Stoffes einer Körper flüssigkeit nahekommt oder entspricht.