DE3048705C2

DE3048705C2 -

Info

Publication number: DE3048705C2
Application number: DE3048705A
Authority: DE
Inventors: Tamotsu Nara Jp Kohumura; Masayoshi Toyonaka Osaka Jp Tsunekawa; Sadayuki Suta Jp Yuhda
Original assignee: Sanki Industrial Co Ltd
Current assignee: Sanki Industrial Co Ltd
Priority date: 1979-12-31
Filing date: 1980-12-23
Publication date: 1992-10-01
Also published as: GB2066074B; CA1161345A; DE3048705A1; JPS5696700A; AU6559680A; AU541130B2; GB2066074A; US4397944A; JPS5728273B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Reagenz zum Nachweis von Zahnkaries. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Reagenz, das es gestattet, sofort den Zustand von Zahnkaries aus dem Zahnbelag eines Patienten zu bestimmen, und zwar mittels einer Farbreaktion ähnlich dem Schneider-Test.

Bei der Entstehung und Entwicklung von Zahnkaries spielen anscheinend drei Faktoren eine Rolle, nämlich kariogene Bakterien, Zucker und Dentin; vgl. Ind. Dent. J., Bd. 12 (1962), S. 443. Zur genauen Kenntnis der Entstehung und der Entwicklung von Zahnkaries sollte diese Faktoren berücksichtigt werden. Es ist jedoch schwierig, gleichzeitig diese Faktoren zu bestimmen.

Es sind schon verschiedene Untersuchungen durchgeführt worden, um Verfahren zur Bestimmung von Zahnkaries zu entwickeln. Beispiele für diese Testverfahren sind der Lactobacillus-Zelltest im Speichel, der Schneider-Test, der Test zur Bestimmung der Zahnschmelzauflösung, der Test zur Bestimmung der säurebildenden Aktivität von Speichelflüssigkeit und ein Test zur Bestimmung der Pufferaktivität von Speichelflüssigkeit. Diese Testverfahren befriedigen jedoch nicht, da sie komplitziert sind, komplexe Vorrichtungen und Einrichtungen erfordern und nicht rasch durchgeführt werden können. Außerdem läßt sich keine gleichmäßige Beziehung mit der Aktivität der Zahnkaries erreichen, was von besonderer Bedeutung ist. Deshalb haben diese Tests keinen allgemeinen Eingang in die Praxis gefunden.

Aus der JP-OS 15 89/75 ist bereits ein Test zur Bestimmung von Zahnkaries bekannt, bei dem eine wäßrige Lösung, die eine Kohlenstoffquelle (Saccharose), eine Stickstoffquelle, (Tryptose) sowie einen Farb-Indikator und einen Inhibitor für opportunistische, für die Zahnkaries nicht ursächliche Keime enthält, mit Zahnbelag beimpft, die beimpfte Lösung für einen bestimmten Zeitraum inkubiert und sodann das Ausmaß der Zahnkaries aus der Verfärbung der Kulturlösung bestimmt. Das Verfahren läßt sich zwar einfach durchführen und ermöglicht eine genaue Bestimmung der Zahnkaries, doch erfordert es wegen der Züchtung der Bakterien eine zu lange Zeit.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Reagenz zum raschen und genauen Nachweis von Zahnkaries aufgrund einer Farbreaktion mit dem Zahnbelag zu entwickeln. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich ferner aus der nachstehenden Beschreibung.

Die Fig. 1 bis 3 zeigen den Einfluß der Zugabe der wasserlöslichen Substanzen auf den pH-Wert. Fig. 4 zeigt schematisch die Beziehung der Auswertung unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Tests zur Bestimmung der Zahnkaries (JP-OS 15 89/75) und dem Reagenz der Erfindung.

Das Reagenz der Erfindung zum Nachweis von Zahnkaries besteht aus einer wäßrigen Lösung von Polyvinylalkohol, Polyethylenglykol, Glycerin, Diglycerin oder deren Gemischen, sowie von mindestens einem Indikator-Farbstoff mit einem Farbumschlag-Bereich von 7,5 bis 5,0.

Der in der JP-OS 15 89/75 beschriebene Test besteht in der Auswertung einer Farbreaktion, die bei Änderung des pH-Werts auftritt, aufgrund der Säuren, die bei der Züchtung kariogener Bakterien gebildet werden. Weitere Untersuchungen haben ergeben, daß die Azidität von Zahnbelag in unmittelbarer Beziehung zur Zahnkaries steht. Dies bedeutet, daß es möglich ist, die Zahnkaries unmittelbar und ohne Züchtung kariogener Bakterien zu bestimmen, und zwar durch Zusatz von Zahnbelag zu einer wäßrigen Lösung, die einen Indikator- Farbstoff enthält. Aufgrund der vorhandenen Säuren im Zahnbelag erfolgt eine Änderung des pH-Wertes, die sich durch einen Farbumschlag zu erkennen gibt. Da im Zahnbelag die Säuren in sehr geringer Menge vorliegen, ändert sich der pH-Wert der wäßrigen Lösung nur in einem sehr engen Bereich, wie dies aus Fig. 1 bis 3 hervorgeht. Es ist deshalb schwierig, eine genaue Farbreaktion zu erhalten und gleichzeitig den richtigen Indikator-Farbstoff auszuwählen. Um das Verfahren in der Praxis durchführen zu können, muß die zu bestimmende Menge an Säure erhöht werden, um den Bereich der Änderung des pH-Wertes zu verbreitern.

Es wurde festgestellt, daß in den Zellen kariogener Bakterien Säuren in ziemlich großer Menge vorliegen und daß diese Säuren durch Änderung des osmotischen Druckes aus den Zellen herausgelöst werden können. Mittels des Reagenz der Erfindung ist es möglich, die intrazellulären Säuren in kariogenen Bakterien zu eluieren. Deren Menge zusammen mit der Menge der Säuren im Zahnbelag, d. h. den extrazellulären Säuren, wird durch die Farbreaktion des Reagenz der Erfindung bestimmt. Auf diese Weise wird die Farbreaktion genauer.

Als Substanzen zur Erhöhung des osmotischen Druckes werden erfindungsgemäß wasserlösliche Substanzen verwendet, die einen höheren osmotischen Druck erzeugen, als den physiologischen Druck. Andererseits dürfen diese Substanzen keine Pufferwirkung entfalten, um die Farbreaktion nicht zu stören. Für diesen Zweck kommen die verschiedensten wasserlöslichen Substanzen in Betracht, doch sind bevorzugt Polyvinylalkohol, Polyethylenglykol, Glycerin und Diglycerin. Außerdem können Stärke, Agar, Gelatine oder Carboxymethylcellulose verwendet werden. Diese Substanzen können entweder allein oder als Kombination von mindestens zwei Substanzen verwendet werden. Die optimale Konzentration der jeweils verwendeten wasserlöslichen Substanzen in der wäßrigen Lösung hängt von der Art der wasserlöslichen Substanzen ab. Im Fall von Polyvinylalkohol liegt die Konzentration im Bereich von 0,1 bis 1%, im Fall von Polyethylenglycol im Bereich von 5 bis 50%, im Fall von Glycerin im Bereich von 10 bis 50% und im Fall von Diglycerin im Bereich von 5 bis 50%. In den Fig. 1 bis 3 ist graphisch die Wirkung dargestellt, die durch Zusatz der wasserlöslichen Substanz zur Lösung erhalten wird. Fig. 1 zeigt die Beziehung zwischen dem pH-Wert der Testlösung und der Zeit, wobei 5×10⁶/ml Streptococcus mutans KIR in 2 ml der Testlösung suspendiert worden sind. In Fig. 2 wurden 5×10⁹/ml Lactobacillus casei in der Testlösung suspendiert. In Fig. 3 wurden 0,02 ml einer Suspension von Zahnbelag in physiologischer Kochsalzlösung der Testlösung einverleibt. Es ist ersichtlich, daß der Bereich der Änderung des pH- Wertes im Falle einer reinen wäßrigen Lösung eng ist. Der pH-Wert ist beträchtlich niedriger als der Anfangswert bei Verwendung einer Testlösung der Erfindung, die eine wasserlösliche Substanz zur Erhöhung des osmotischen Druckes enthält. Diese Tendenz ist annähernd gleich bei Verwendung bakterieller Zellen (Fig. 1 und 2) und bei Verwendung von Zahnbelag (Fig. 3). Die Verwendung einer Substanz mit Pufferwirkung, wie Kaliumcitrat, gestattet keine Bestimmung der Zahnkaries, da der pH-Wert der Testlösung sich nicht mehr verändert.

Ferner zeigt die Verwendung einer Saccharose-enthaltenden Testlösung in den Fig. 1 bis 3, daß sich auch nach etwa 0,5 bis 2 Stunden noch kein stabiler pH-Wert innerhalb des pH-Bereiches von 7,5 bis 5,0 einstellt.

Bei Verwendung der entsprechenden Indikator-Farbstoffe im Reagenz der Erfindung ist es möglich, die Zahnkaries genau und innerhalb kurzer Zeit durch eine Farbreaktion zu bestimmen. Hinsichtlich der zu verwendenden Indikator-Farbstoffe bestehen keine Einschränkungen, sofern sie bei einem pH-Wert im Bereich von 7,5 bis 0,5 einen gut erkennbaren Farbumschlag ergeben und sich bei der Lagerung nicht ändern. Typische Indikator-Farbstoffe sind Bromthymolblau, Methylrot, Chinablau und Alizarinblau. Diese Indikator- Farbstoffe können allein oder als Gemisch von mindestens zwei Farbstoffen verwendet werden. Das Reagenz der Erfindung kann zur Erhöhung der Haltbarkeit noch ein Antibiotikum, wie Chloramphenicol, oder ein Antiseptikum, wie Natriumazid, enthalten.

Nachstehend werden Rezepturen zur Herstellung von Reagentien der Erfindung gegeben:

(1) Polyethylenglykol, mittleres Molekulargewicht 400
10 Gew.-%
Natriumazid	0,03 Gew.-%
Bromthymolblau	0,005 Gew.-%
destilliertes Wasser	Rest
pH-Wert (eingestellt mit 0,1 n NaOH) Beim pH-Wert 7,2 ist das Reagenz blau, bei pH 6,6 grün, bei pH 6,0 gelbstichiggrün und bei pH 5,4 gelb	7,2
(2) Polyvinylalkohol (P=500)	0,16 Gew.-%
Natriumazid	0,03 Gew.-%
Bromthymolblau	0,005 Gew.-%
Methylrot	0,003 Gew.-%
destilliertes Wasser	Rest
pH-Wert (eingestellt mit 0,1 n NaOH) Beim pH-Wert 7,2 ist das Reagenz blau, bei pH 6,6 gelbstichig grün, bei pH 6,0 gelb und bei pH 5,4 rotstichig-orange	7,2

Die vorstehend aufgeführten Rezepturen für Reagentien der Erfindung sind lediglich beispielhaft gegeben. Entscheidend ist, daß die wäßrige Lösung mindestens eine wasserlösliche Substanz enthält, die den osmotischen Druck erhöhen kann, jedoch nicht bei der Farbreaktion teilnimmt und keine Pufferwirkung ausübt. Ferner muß die Lösung mindestens einen Indikator-Farbstoff enthalten, der bei einem pH-Wert im vorstehend angegebenen Bereich eine gut sichtbare Farbe zeigt.

Die Menge der verwendeten Zusätze läßt sich durch einfache Vorversuche bestimmen.

Nachstehend werden einige Ergebnisse klinischer Versuche mitgeteilt.

Zahnbelag von 50 Kindern wird mittels eines Wattebausches entnommen und in 1 ml der Testlösung (1) gegeben und homogen dispergiert. 30 Minuten später wird der pH-Wert bestimmt. Der Status der Zahnkaries wird aufgrund der Verfärbung der Lösung bestimmt; vgl. Tabelle I. Sodann werden diese Meßergebnisse mit dem tatsächlichen Zustand der Zahnkaries verglichen; vgl. Tabelle II. Die Befunde sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Farbreaktion und Auswertungskriterien
Farbe
Auswertung
gelb
+++
gelbstichig grün	++ @	grün	+ @	blau	-

Tabelle II

Bestimmung des Schweregrads der Zahnkaries

Tabelle III

Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß offensichtlich eine Beziehung zwischen dem Schweregrad der Zahnkaries bei der visuellen Untersuchung und den Ergebnissen der Auswertung sowie den pH-Werten bei Verwendung des Reagenz der Erfindung besteht. Somit ist es mit dem Reagenz der Erfindung möglich, den Status der Zahnkaries mittels einer Farbreaktion und ohne visuelle Untersuchung der Zähne genau zu bestimmen.

Vergleichsversuche wurden an 60 Kindern durchgeführt, um eine mögliche Beziehung zwischen den Werten zu finden, die mit dem Reagenz der Erfindung bzw. dem in der JP-OS 1 589/75 beschriebenen Mittel erhalten wurden.

Die Werte mit dem bekannten Mittel der in Tabelle IV ange gebenen Zusammensetzung und nach 48stündiger Bebrütung werden verglichen mit den mit dem Reagenz der Erfindung er haltenen Werten, um eine mögliche Beziehung zwischen den beiden Mitteln festzustellen. Der Vergleich wurde anhand des pH-Wertes der jeweiligen Lösungen durchgeführt, um eine genaue Beziehung beobachten zu können.

Zusammensetzung des bekannten Mittels
Saccharose
20 Gew.-%
Tryptose
1,8 Gew.-%
Natriumchlorid	0,6 Gew.-% @	Natriumazid	0,03 Gew.-% @	Bromkresolgrün	0,001 Gew.-% @	Bromkresolpurpur	0,002 Gew.-% @	destilliertes Wasser	Rest

Es wurden die in Fig. 4 wiedergegebenen Beziehungen ermittelt. Bei Aufstellung einer Regressionsgleichung Y = 3,0143+0,5972 X mit dem pH-Wert im Falle des bekannten Mittels (X) und dem pH-Wert im Falle des Reagenz der Erfindung (Y) aufgrund der in Fig. 4 mitgeteilten Ergebnisse, wurde ein Regressionskoeffizient γ=0,568 erhalten. Dies bestätigt das Vorliegen einer bestimmten Beziehung. Die Analyse des vierten Grad-Kriteriums zur Auswertung mit dem bekannten Mittel durch Anwendung der Regressionsgleichung ergibt die in Tabelle V mitgeteilten Ergebnisse.

Tabelle V

Auswertungskriterien

Aus den Vergleichsversuchen ist ersichtlich, daß Zahnkaries mit dem Reagenz der Erfindung ebenso genau bestimmt werden kann wie mit dem bekannten Mittel, jedoch ohne Züchtung kariogener Bakterien.

Claims

1. Reagenz zum Nachweis von Zahnkaries, bestehend aus einer wäßrigen Lösung von Polyvinylalkohol, Polyethylenglykol, Glycerin, Diglycerin oder deren Gemischen, sowie von mindestens einem Indikator-Farbstoff mit einem Farbumschlag-Bereich von 7,5 bis 5,0.

2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung den Polyvinylalkohol in einer Konzentration von 0,1 bis 1% enthält.

3. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung ein Polyethylenglykol in einer Konzentration von 5 bis 50% enthält.

4. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung Glycerin in einer Konzentration von 10 bis 50% enthält.

5. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung Diglycerin in einer Konzentration von 5 bis 50% enthält.

6. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator-Farbstoff Bromthymolblau, Methylrot, Chinablau oder Alizarinblau oder ein Gemisch aus mindestens zwei dieser Farbstoffe ist.

7. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch einen zusätzlichen Gehalt an einem Antibiotikum und/oder einem Antiseptikum.

8. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator-Farbstoff einen Farbumschlag- Bereich von 7,2 bis 5,87 hat und der pH-Wert der wäßrigen Lösung auf einen Wert oberhalb 7 eingestellt ist.

9. Verwendung einer wäßrigen Lösung von Polyvinylalkohol, Polyethylenglykol, Glycerin, Diglycerin oder deren Gemischen, sowie von mindestens einem Indikator-Farbstoff mit einem Farbumschlag-Bereich von 7,5 bis 5,0 als Reagenz zum Nachweis von Zahnkaries.