DE2728456C2 - Verfahren zur Feststellung pathogener Mikroorganismen in den menschlichen Atemwegen - Google Patents

Abstract

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Description

Gegenstand der Erfindung ist die quantitative Analyse pathogener Mikroben in den menschlichen Atemwegen. Sie beruht auf einer neuartigen Methode der Verflüssigung von Sputumproben durch ein Schleim hydrolysierendes Saponin.

Die Lungenentzündung beim Menschen umfaßt im allgemeinen einen akuten entzündlichen Zustand eines oder beider Lungenflügel, der durch pathogene Mikroorganismen, wie Bakterien oder Viren, sowie durch chemische Reizmittel oder Fremdstoffe verursacht werden kann. Zur Feststellung der Ursache und der Diagnose sind daher Proben von Lungenflüssigkeit erforderlich. Ideale Proben von Lungenflüssigkeit bestehen aus homogenen Proben, die man durch chirurgische Eingriffe, z. B. transtracheale Aspiration erhalten kann. Selbstverständlich sind chirurgische Eingriffe zeitraubend und stellen für den Patienten ein Risiko dar. In bezug auf transtracheale Aspirationen werden lebensbedrohliche Reaktionen berichtet. Zum Beispiel sind Patienten, die an entkräftenden Krankheiten, wie Blutdyscrasie leiden, für schwerwiegende Komplikationen bei der transtrachealen

Aspiration besonders anfällig.

Die meisten Ärzte greifen daher auf Sputumproben vom morgendlichen Aushusten als Proben von Lungenflüssigkeit zurück. Diese Maßnahme ist einfach und sehr üblich. Die durch Aushusten erhaltene Sputumprobe kann jedoch leicht durch die normale Flora im Mund, der Nase, im hinteren Rachenraum und im Magen verunreinigt sein. Hinzu kommt, daß Sputumproben von an Lungenentzündung erkrankten Patienten sehr viskos und in ihrer Beschaffenheit heterogen sind und sich daher nur schwer in reproduzierbarer Weise dispergieren lassen. Eine quantitative Analyse des Sputums ist bei sehr viskosem heterogenen Sputum nicht möglich, da es bei einer quantitativen Analyse von Proben, wie Sputum, im allgemeinen notwendig ist, die Proben zu verdünnen und darauf kleinere Anteile der Proben auf verschiedene Wachstumsmedien auszustreichen und dann die Art und Anzahl der Kolonien der Mikroorganismen auf den Medien zu bestimmen. Im allgemeinen beträgt die maximale Anzahl der Kolonien, die auf einer Petrischale wirksam ausgezählt werden kann, etwa 300. Ferner nimmt man an, daß normale Sputumproben verunreinigende Mikroorganismen in Mengen bis zu 10[hoch]5; je ml enthalten können, während die die Lungenentzündung verursachenden Mikroorganismen in Mengen von im allgemeinen mehr als etwa 10[hoch]6; je ml vorhanden sind. Bevor daher eine Sputumprobe quantitativ analysiert werden kann, muß sie in solcher Weise verdünnt werden, daß die pathogenen Mikroorganismen gleichmäßig in der erhaltenen verdünnten Probe dispergiert sind. Wenn darum ein kleinerer Anteil dieser verdünnten Sputumprobe quantitativ auf die Art und Anzahl der pathogenen Mikroorganismen analysiert wird, läßt sich die genaue Anzahl der

pathogenen Mikroorganismen je ml Sputumprobe genau errechnen.

Um das Problem der Verunreinigung von außen und der heterogenen Beschaffenheit der Sputumprobe zu verringern und eine quantitative Sputumanalyse zu ermöglichen, wurden bereits mehrere Versuche gemacht, die Sputumprobe enzymatisch oder chemisch zu hydrolysieren. Es wurden schon mehrere solcher hydrolysierender Mittel untersucht, die jedoch alle einen oder mehrere der folgenden Nachteile hatten: sie waren kostspielig, sie ließen sich nicht lange aufbewahren, sie waren temperaturempfindlich, toxisch in bezug auf einige oder viele pathogene Mikroorganismen, oder sie erforderten eine lange Hydrolysezeit. Zum Beispiel wurde eine Reihe proteolytischer Enzyme sowohl in eitrigem als auch schleimigem Sputum

untersucht. Von diesen Enzymen erschienen Trypsin, Elastase und Chymotrypsin als am wirksamsten, während Enzyme, wie Bromelain, Ficin oder Papain nur in extrem hohen Konzentrationen wirksam waren und Plasmin keinen nachweisbaren Effekt auf die Viskosität von Sputum hatte. Alle diese proteolytischen Enzyme scheinen bei schleimigen Sputumproben wirksamer zu sein als bei eitrigen Sputumproben. Die am häufigsten für quantitativer Sputumanalysen angewandten hydrolytisch wirkenden Mittel sind wäßrige Lösungen von N-Acetylcystein und Cleland's Reagenz (1,4-Dithio-mesoerythrit). Im allgemeinen zeigt bei niedrigeren Konzentrationen Cleland's Reagenz eine größere schleimlösende Wirkung als N-Acetylcystein, jedoch verliert Cleland's Reagenz in wäßriger Lösung seine schleimlösende Wirksamkeit gewöhnlich in verhältnismäßig kurzer Zeit. Außerdem sind beide Reagentien in Konzentrationen, die für eine rasche Hydrolyse des Sputums erforderlich sind, gegenüber pathogenen Mikroorganismen etwas toxisch.

Demzufolge werden die meisten Sputumproben unter Anwendung einer nicht-quantitativen Ausstreichmethode

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untersucht, die im allgemeinen darin besteht, daß man die heterogene Sputumprobe auf verschiedene Wachstumsmedien ausstreicht. Diese Methode führt zu einer wesentlichen Anzahl falscher positiver Kulturen und in vielen Fällen zu einem Überwachsen der pathogenen Organismen durch verunreinigende Mikroorganismen.

Es wurde nun gefunden, daß bestimmte gereinigte Saponine mucolytische Wirkung besitzen, und in wirksamer Weise sowohl eitrige als auch schleimige Sputumproben abbauen und damit die pathogenen Mikroorganismen gleichmäßig dispergieren, ohne sie zu beeinträchtigen.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird daher eine Sputumprobe mit einer wirksamen schleimlösenden Menge eines nichttoxischen Saponins in Berührung gebracht, damit diese in einen Zustand von im wesentlichen gleichmäßiger Viskosität übergeführt wird. Beim Mischen der Probe werden die in ihr enthaltenen pathogenen Mikroorganismen einheitlich verteilt. Anschließend wird die so erhaltene Probe quantitativ analysiert.

Das erfindungsgemäß verwendbare nicht-toxische Saponin kann nach dem in der US-PS 38 83 425 beschriebenen Verfahren, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird, gereinigt werden.

Saponine sind Glycoside, die vielfach in Pflanzen angetroffen werden und Öl-in-Wasser-Emulsionen zu bilden vermögen. Sie wirken als Schutzkolloide. Jedes Saponinmolekül besteht aus einem Sapogenin, das den Agluconbestandteil des Moleküls darstellt, und aus einem Zucker.

Das Sapogenin hat entweder die Struktur eines Triterpenoids (d. h., es weist gewöhnlich einen Fünfring auf, wie Quillaja Sapogenin), oder eine Steroidstruktur (gewöhnlich mit einer Spiro-Acetalseitenkette, wie in Diosgenin). Der Zuckeranteil der Saponinglucoside umfaßt einen oder mehrere Zucker, wie Glucose, Saccharose, Xylose, eine Pentose oder Methylpentose oder andere Zucker. Bei der Hydrolyse ergeben die Saponine das Sapogenin und einen oder mehrere dieser Zucker.

Im Handel erhältliche Saponine bestehen aus einem weißen bis braunen amporphen stechenden Pulver mit unangenehmen Geruch und Geschmack. Dieses Pulver ist in Wasser sehr gut löslich und schäumt, wenn es mit Wasser geschüttelt wird, sehr stark.

Die im Handel erhältlichen Saponine werden dadurch hergestellt, daß man Pflanzengewebe mit Wasser und/oder anderen organischen Lösungsmitteln, wie Alkohol, extrahiert und das Saponin durch Fällung, Umkristallisation und dergleichen gewinnt. Saponine sind in Pflanzen weit verbreitet. Zum Beispiel treten Saponine sehr verbreitet in der Pflanzenfamilie Caryophyllaceae auf. Spezifische Beispiele für Saponinquellen sind Quillaria saponaria, Panamaholz, Bäume der Familie Sapindaceae, Glycyrrhiza glabra Pflanzen und dergleichen. Ein spezifisches Beispiel für ein Verfahren zur Herstellung von im Handel erhältlichem Saponin ist in Kingzette's Chemical Encyclopedia, D. H. Hey, 9. Auflage (1966) beschrieben, bei

dem entweder gepulverte Quillaria saponaria mit heißem Alkohol extrahiert oder ein wäßriger Extrakt von pulvriger trockener Quillaria saponaria mit Alkohol zum Sieden erhitzt wird, worauf man das Saponin aus dem Alkohol beim Abkühlen auskristallisieren läßt.

Saponine sind bei oraler Verabreichung an Menschen praktisch nicht toxisch, stellen jedoch, wenn sie in den Blutstrom injiziert werden, starke Haemolytica dar, die die roten Blutkörperchen auflösen. Wegen dieser Eigenschaft werden die Saponine üblicherweise in Laboratorien für die Auflösung von roten Zellen verwendet, wenn ihre Gegenwart andere Verfahren beeinträchtigt, z. B. bei Haemoglobinbestim-mungen und der Zählung von weißen Zellen.

In der oben genannten US-PS 38 83 425 ist ein Verfahren zur Entfernung mikrobieller Toxine aus durch Extraktion von Pflanzen erhaltenen Saponinen beschrieben, bei dem aus einer wäßrigen Lösung dieser Saponine die Bestandteile mit einem scheinbaren Molekulargewicht von weniger als etwa 600, z. B. einer Molekulargröße in wäßriger Lösung zwischen etwa 140 und etwa 600 entfernt werden. Eine in dieser Patentschrift angegebenen Technik besteht in der Herstellung einer wäßrigen Lösung eines im Handel erhältlichen Saponinextrakts von Pflanzen, worauf diese Lösung durch eine Filtermembran mit Mikroporen einer mittleren Porengröße von nicht unter etwa 11 und nicht über etwa 24 Angström im Durchmesser geführt wird. Die wäßrige Lösung, die die Filtermembran passiert hat, enthält das antimikrobielle Toxin, während das Saponin vom Filter zurückgehalten wird.

Es wurde nun gefunden, daß diese gereinigten Saponinextrakte aus Pflanzen wirksame mucolytische Mittel darstellen, die alle Arten von Sputum abbauen und die mikrobiellen Pathogene in ihm dispergieren, ohne sie zu beeinträchtigen.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Sputumprobe in herkömmlicher Weise entnommen. Danach wird das Sputum mit einer kleinen aber wirksamen mucolytischen Menge des oben beschriebenen nicht-toxischen Saponins vermischt. Vorzugsweise befindet sich das Saponin in wäßriger Lösung, wenn es mit dem Sputum gemischt wird. Die wäßrige Lösung kann jede geeignete Konzentration haben, so daß, wenn die gewünschte Menge der Lösung mit dem Sputum vermischt wird, ausreichend Saponin zum Abbau des Sputums vorhanden ist. Im allgemeinen sind in der gebildeten Mischung aus Saponin und Sputum 0,1 bis 20 Gew.-% und vorzugsweise 1,0 bis 10 Gew.-% und noch besser 5 bis 10 Gew.-% Saponin

notwendig.

Außerdem ist es vorteilhaft, der erhaltenen Mischung aus Saponin und Sputum 0,1 bis 20 Gew.-% und insbesondere 5 bis 10 Gew.-% eines Antischaummittels zuzufügen, das für die mikrobiellen Pathogene nicht schädlich ist. Solche geeigneten Antischaummittel werden z. B. unter dem Warenzeichen Dow X Antischaummittel B und Dow X H 10 vertrieben. Diese Mittel enthalten chemische Polymere von Dimethylsiloxan und ein sterilisierbares, z. B. autoclavierbares, nichtionisches Emulgiermittel, z. B. ein unter dem Warenzeichen Triton X vertriebenes. Ein bevorzugtes Antischaummittel ist Dow X H 10, da es gegenüber der Sterilisation durch Autoclavieren sehr beständig ist. Das Saponin baut in wirksamer Weise sehr

rasch alle Arten von Sputum, sowohl schleimiges als auch eitriges Sputum ab und bildet eine gleichmäßig viskose Mischung.

Die Sputumprobe wird dann sorgfältig gemischt, um eine gleichmäßige Dispergierung der in ihr enthaltenen Mikroorganismen zu bewirken.

Falls gewünscht, können Anteile der gebildeten abgebauten Sputumprobe

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direkt auf verschiedene Medien aufgestrichen werden, um eine bessere qualitative Sputumanalyse zu ermöglichen, die nicht der großen Anzahl falscher positiver Kulturen und dem Überwachsen pathogener Flora durch verunreinigende Mikroorganismen unterworfen ist, wie die herkömmliche qualitative Analyse ohne Verwendung abgebauten Sputums.

Für die Durchführung der verbesserten quantitativen Sputumanalyse gemäß der Erfindung wird die mit Saponin behandelte Sputumprobe mit phosphatgepufferter normaler Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 oder einem anderen geeigneten Verdünnungsmittel, welches die Analyse nicht beeinträchtigt und gegenüber den mikrobiellen Pathogenen nicht toxisch ist, in gewünschter Weise verdünnt, z. B. im Verhältnis 1 : 100 bis 1 : 1000. Die erhaltene verdünnte Probe wird zur gleichmäßigen Verteilung der mikrobiellen Pathogene in der Lösung sorgfältig gemischt. Dann werden Proben der verdünnten Lösung herkömmlichen Wachstumsmedien zugefügt und bebrütet. Zunächst werden alle auf den Medien gebildeten Kolonien identifiziert und gezählt. Da man den Verdünnungsgrad der Sputumprobe kennt, läßt sich die Gesamtmenge der verschiedenen Arten mikrobieller Pathogene leicht errechnen. Falls gewünscht, kann alternativ die nicht verdünnte Probe einer mikroskopischen Untersuchung unterzogen werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

In diesem Beispiel ist die Toxizität verschiedener bekannter mucolytischer Mittel mit der von Saponin verglichen. In jedem Fall wurden Stämme der in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführten Bakterien über Nacht in den angegebenen Medien gezüchtet. Die Trübung der erhaltenen Kulturmedien wurde mit steriler Kochsalzlösung auf einen Bariumsulfatstandard von annähernd 10[hoch]8 Bakterien je ml gebracht. Darauf wurde die gebildete Brühe im Verhältnis 1 : 200 mit Nährbrühe verdünnt. Zunächst wurde eine 40 Gew.-%ige Lösung von Saponin, das gemäß dem Verfahren

in der US-PS 38 83 425 zur Entfernung toxischer Verunreinigungen mit einem scheinbaren Molekulargewicht von weniger als etwa 600 in wässriger Lösung gereinigt worden war, zu den in der Tabelle 1 angegebenen Wachstumsmedien für die verschiedenen Bakterien gegeben. Darauf wurde 1 ml jeder Bakterienkultur-Suspension zu 1 ml der oben beschriebenen Saponinlösung gegeben, um eine Endkonzentration von 20 Gew.-% Saponin zu erhalten. Darauf wurde über Nacht bei 37°C bebrütet. Auf reichem Agar mit einem Gehalt von 1 Gew.-% Glucose, oder Blutagar wurde auch eine Kontroll- und Testsuspension ausgestrichen.

Die anderen auf ihre Toxizität untersuchten Verbindungen bestanden aus Cleland's Reagenz (1,4-Dithio-mesoerythrit), N-Acetylcystein und Natriumlaurylsulfat. Diese mucolytischen Mittel wurden in den Konzentrationen und in den Wachstumsmedien für die einzelnen Mikroorganismen, wie in der Tabelle 1 angegeben, hergestellt und auf die gleiche Weise wie das Saponin auf ihre Toxizität geprüft.

Wenn die einzelnen Bakterien in der die angegebene Menge mucolytisches Mittel enthaltenden Brühe wuchsen, wurde der Versuch wiederholt, um zu sehen, ob sich das Wachstum in einem zweiten Versuch reproduzieren ließ. Wenn entweder beim ersten oder beim zweiten Mal kein Wachstum erhalten wurde, wurde ein dritter Versuch zur Erzielung von Wachstum der Bakterien durchgeführt. In einigen Fällen führte man einen dritten Versuch durch, auch wenn die Bakterien in den beiden vorhergehenden Versuchen wuchsen. Entsprechend zeigt in der Tabelle ein Pluszeichen erfolgreiches Wachstum und ein Minuszeichen negatives Wachstum an, nämlich:

+++ = Wachstum in allen drei Versuchen

--- = kein Wachstum in allen drei Versuchen

--+ = Wachstum in einem der drei Versuche

-++ = Wachstum in zwei der drei Versuche.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengestellt:

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Tabelle 1

*)

1 - Wachstum in reicher Brühe mit 1 Gew.-% Glucose

2 - Wachstum in Todd-Hewett Brühe, nachfolgend auf Blut ausgestrichen

3 - Wachstum in reicher Brühe mit 1 Gew.-% Glucose, nachfolgend auf Blut

ausgestrichen

4 - Wachstum in reicher Brühe mit 1 Gew.-% Glucose, nachfolgend auf Blut

in einem CO[tief]2 Gefäß ausgestrichen

5 - Wachstum in einer Pepton-Hefe-Glucose-Maltose Brühe, nachfolgend auf Blut

in einem unter anaeroben Bedingungen gehaltenen Gefäß ausgestrichen

6 - ursprüngliches Wachstum in einer PPLO-Brühe, nachfolgend auf PPLO-Agar

in einem CO[tief]2 Gefäß ausgestrichen

NT - nicht untersucht

Aus der obigen Tabelle 1 ist ersichtlich, daß die relativ hohe Konzentration des gereinigten Saponins die untersuchten Mikroorganismen nicht abtötete oder ihr Wachstum hemmte. Dagegen verhinderten alle übrigen untersuchten mucolytischen Mittel das Wachstum mehrerer Mikroorganismen bei viel geringerer Konzentration als der des Saponins. Es ist auch festzustellen, daß sogar bei der empfohlenen Anwendungskonzentration der gegenwärtig verwendeten mucolytischen Mittel (0,5% N-Acetylcystein und 0,1% Cleland's Reagenz) Toxizität gegenüber verschiedenen Organismen festgestellt wurde.

Beispiel

Mehrere Sputumproben wurden klinisch analysiert, nachdem die Proben in nicht-toxischem Saponin gelöst worden waren. Die erzielten Ergebnisse wurden mit solchen verglichen, die in herkömmlichen Routine-Sputumuntersuchungen in einem Krankenhaus erhalten worden waren. Zu Anfang wurden am frühen Morgen Sputumproben genommen, und es wurden Naßpräparate und Abstriche hergestellt, um die Art des Sputums und charakteristische Eigenschaften, z. B. Sporen, festzustellen. Die Sputumproben wurden wie folgt mit den Bewertungen 1 bis 4 versehen:

Bewertung 1: Speichel - schaumig, klar, farblos, hauptsächlich Epithelzellen auf einem 40X Feld

Bewertung 2: schleimig - farblos, klar bis durchscheinend, überwiegend Eosinophile und Macrophagen, polymorphonukleare Zellen weniger als 60%,

weniger als die Hälfte eines 40X Feldes mit Zellen.

Bewertung 3: schleimig-eitrig - farblos bis grünlich, leicht durchscheinend, annähernd die Hälfte des Feldes gefüllt mit Zellen

Bewertung 4: eitrig - gelb oder grünlich, wolkig, polymorphonukleare Zellen mehr als 70%, mehr als die Hälfte des Feldes bedeckt mit Zellen.

Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengestellt.

Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß die herkömmliche und die erfindungsgemäße quantitative Sputumanalyse, die durch Saponin abgebautes Sputum verwendet, an 80 Sputumproben durchgeführt wurde, wobei 29 Ergebnisse voneinander abwichen. In 26 Fällen führte die erfindungsgemäße quantitative Analyse zu einem positiven Ergebnis, die herkömmliche Methode jedoch nicht. In 3 Fällen wurde mit der herkömmlichen Methode ein positives Ergebnis erzielt, dessen Bewertungen jedoch nicht hoch genug waren, um nach dem quantitativen Standard als positiv zu gelten. Besonders bemerkenswert ist, daß bei 7 Patienten mit der quantitativen Methode

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auf Schokolade-Platten Haemophilus influenzae in einer Bewertung von mehr als 10[hoch]7 je ml gefunden wurde, dieser jedoch mit der herkömmlichen

Methode infolge von Überwachsungen nicht entdeckt wurde. Dieser besondere Organismus ist bei der Lungenentzündung von großer klinischer Bedeutung. Auch wurden in 4 Fällen andere Organismen, die Doppelinfektionen verursachten, überwachsen und mit der herkömmlichen klinischen Laborationsmethode nicht entdeckt. Die meisten Unterschiede in den in der Tabelle angegebenen Ergebnissen traten bei Hefen auf, die mit der quantitativen Methode als positiv ermittelt wurden, mit der herkömmlichen klinischen Methode jedoch nicht ermittelt oder nur in Form von leichtem Wachstum festgestellt wurden.

Die abgebaute Sputumprobe wurde auf die folgenden Platten ausgestrichen: BA, CHOC, EMB, MAN, MAN-PEN und SDA-GENT. Darauf wurden aus einem Teil des abgebauten Sputums zwei 1 : 100 Verdünnungen hergestellt, um 10[hoch]2 und 10[hoch]4 Verdünnungen zu erhalten, z. B. wurde für die 10[hoch]2 Verdünnung 0,1 ml Sputum in 9,9 ml Kochsalzlösung und für die 10[hoch]4 Verdünnung 0,1 ml der 10[hoch]2 Verdünnung in 9,9 ml Kochsalzlösung gegeben. Dann wurde eine 0,01 ml Schleife zum Ausstreichen der 10[hoch]4 Verdünnung auf die folgenden Platten verwendet: BA, CHOC, EMB, MAN, MAN + PEN und SDA-GENT, um eine endgültige definierte Verdünnung von 10[hoch]6 zu erhalten. Darauf wurde eine weitere 0,01 ml Probe auf SDA + GENT aus der 10[hoch]2 Verdünnung ausgestrichen, um eine Verdünnung von 10[hoch]4 zu ergeben. Alle diese Platten wurden bebrütet und nach 24 und 48 Stunden untersucht. Die SDA Platten wurden ferner nach einer Woche untersucht. Die Auswertung wurde in folgender

Weise vorgenommen:

a) normale Flora (normale Menge und Art von Mikroorganismen im Nasen-Rachenraum für Alpha Streptococcus und Neisseria sowie Diphtherie

hervorrufende Mikroorganismen im Bereich von 10[hoch]6 und 10[hoch]7.

b) Positive Infektion für alle anderen nicht-Hefe Organismen (andere als oben

unter a) angegeben) im Bereich von 10[hoch]6 und mehr.

c) 10[hoch]5, 1 bis 5 Organismen, beliebig gefunden auf einem Satz von Platten, als möglich positiv.

d) 103 und mehr, 1 bis 5 Organismen, beliebig gefunden auf einem Satz von Platten, als möglich positiv für Candida albicans und als positiv für alle übrigen Hefen.

In jedem Fall wurde die Zelldichte in der Weise bestimmt, daß man beobachtete, welcher Prozentsatz eines 40X Feldes auf einer Naßprobe mit Zellen gefüllt ist. Die Cytologie wurde durch Anfärben eines Objektträgers (Papanicolaou), Auszählen von 200 Zellen der Probe und Identifizieren der polymorphonuklearen Zellen (PMN), der Eosinophilen, der Basophilen, der Macrophagen, der Monocyten und der Lymphocyten bestimmt.

Nachdem jede Sputumprobe bewertet war, wurde eine Routineanalyse durchgeführt, die 6 halbquantitative Ausstriche umfaßte. Ein Teil der Sputumprobe wurde auf einer Blut-Agar Platte (BA), ein Teil auf einer Schokolade-Agar Platte (CHOC), ein Teil auf einer Eosin-Methylenblau Platte (EMB), ein Teil auf einer Mannitsalz Platte (MAN), ein Teil auf einer Mannitsalz Platte, die Penicillin enthielt (MAN-PEN) und ein Teil auf einer Sabouraud + Gentamicin Platte (SDA-GENT) ausgestrichen, worauf man die Bakterien wachsen ließ und sie danach identifizierte. Der restliche Teil jeder Probe wurde mit der gleichen Menge 10gew.-%igem Saponin, das gemäß der US-PS 38 33

425 gereinigt worden war, und 0,1 m Natriumcitrat und einem Antischaummittel (Antifoam B Emulsion - Dow Corning) versetzt, um eine Endkonzentration von 5 Gew.-% Saponin zu erhalten. Anschließend wurde die Saponin-Sputum Mischung mindestens 30 Sekunden umgewirbelt.

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Tabelle 2

Klinische Ergebnisse der Sputumuntersuchung auf herkömmliche und erfindungsgemäße quantitative Weise

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Um eine Beziehung zwischen den Laboratoriumsergebnissen und den Krankengeschichten herzustellen, zeigt die Tabelle 3 einige Beziehungen zwischen quantitativen Sputumanalysen und Halsbefunden sowie Lungenautopsien.

Tabelle 3

*) Quantitative Sputumanalyse

Aus der Tabelle 3 ist ersichtlich, daß in einigen Fällen die Halsbefunde die gleichen Organismen ergaben wie das Sputum, was bedeutet, daß der Patient entweder Kolonien aufwies oder unter Umständen eine orale Verunreinigung der Sputumprobe vorlag. Wiederholte Kultivierungen und Beobachtungen bei Änderung der Auszählungen könnten den Arzt befähigen, zwischen diesen beiden zuletzt genannten Möglichkeiten zu unterscheiden. Falls Kolonien festgestellt werden, könnte man dann Vorsichtsmaßnahmen treffen, um eine Lungeninfektion zu verhindern. Weiterhin zeigt die erfindungsgemäße quantitative Sputumanalyse in vielen Fällen eine schwere Infektion an, während die Analyse der Halsprobe dies nicht tut. Im letzteren Fall würden die erhaltenen Werte den Schluß stützen, daß eine minimale nasopharyngale Verunreinigung vorliegt und in diesem Fall eine

Lungeninfektion sehr wahrscheinlich ist.

Beispiel 3

Dieses Beispiel veranschaulicht die mucolytische Wirkung, d. h. die Fähigkeit zur Verringerung der Viskosität von Saponin bei klinischen Sputumproben. Die Sputumprobe bestand aus 2 ml mit der Bewertung 2 gemäß dem obigen Beispiel 2. Zur Messung der Viskosität der Probe wurde ein kleines Viskosimeter, wie es in "A Simple Method of Measuring Sputum Viscosity", von A. O. Jenssen, in Scand. J. Resp. Dis., Band 54 (1973), Seite 290 bis 296 beschrieben ist, zusammengebaut. Dieses Viskosimeter besteht aus einem einzigen Kunststoffblock, dessen Grundfläche plan geschliffen ist. In diese Grundfläche wird ein im Schnitt halbkreisförmiger Gang ausgebohrt, der in einer senkrechten Bohrung endet, die oben eine Y-förmige Vorrichtung aufzunehmen vermag, deren einer Zweig über einen Kunststoffschlauch mit einem Luftflußregulator und der andere über einen

Kunststoffschlauch mit einem Wassermanometer verbunden ist. In die senkrechte Bohrung wurde gerade über dem Gang ein Luftauslaß ausgebohrt. Druckveränderungen wurden als Absinken der Höhe der Wassersäule im Manometer gemessen. Die Zeit, die bis zur Leerung des Viskosimeters erforderlich war, wurde in Sekunden festgehalten.

Zur Messung der Viskosität einer gegebenen Probe wurde Sputum auf eine Glasplatte gebracht. Das Viskosimeter wurde bei konstantem Luftfluß auf das Sputum gestellt, das den Gang des Viskosimeters füllte. Der Luftauslaß an der Seite des Viskosimeters wurde geschlossen. Die Zeit bis zur Leerung des Viskosimeters und dem maximalen Absinken der Höhe der Wassersäule wurde notiert. Die Veränderung der Höhe der Wassersäule in ml wurde durch Multiplizieren mit 0,00881 in mmHg (Druck) umgewandelt. Nach dem Aufsatz von Jenssen ergibt sich: Druck × Sekunden × K = Viskosität, wobei K eine Kalibrierungskonstante für das Viskosimeter darstellt.

Das Viskosimeter wurde gegen ein Oswald Viskosimeter unter Verwendung von Glycerin als Primärstandard kalibriert. Für dieses Viskosimeter gilt K = 13,5 × 10[hoch]3. Die mit dem Sputum der Bewertung 2 erhaltenen Viskositäten bei und ohne Zugabe des im Beispiel 1 und 2 beschriebenen gereinigten Saponins sind in der Tabelle 4 zusammengestellt:

Tabelle 4

Mucolytische Wirkung von Saponin auf eine klinische Sputumprobe

Beschaffenheit des Sputums: 2 ml mit der Bewertung 2,0

A. Viskosität von 5 verschiedenen Anteilen vor der Zugabe von Saponin:

Centipoise

881

1,332

14,295

19,929

6,962

X = 8678

s. d. = 8306

B. Viskosität von 4 verschiedenen Anteilen nach der Zugabe von 0,1 ml 13%igen Saponin:

166

177

161

172

X = 169

s. d. = 7

Man sieht, daß das Saponin das Sputum wirksam löst und zu einer im wesentlichen gleichmäßigen Viskosität aller Anteile führt.

Claims (5)

1. Verfahren zur Feststellung pathogener Mikroorganismen in den Atemwegen, bei dem eine Probe Lungenflüssigkeit genommen, mit einer wirksamen Menge mucolytischen Reagens versetzt, die erhaltene Probe mit im wesentlichen einheitlicher Viskosität sorgfältig vermischt und dann auf die Gegenwart phatogener Mikroorganismen untersucht wird, dadurch gekennzeichnet, daß man als mucolytisches Reagenz ein nicht-toxisches Saponin verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das nicht-toxische Saponin mit der Probe der Lungenflüssigkeit in einer Menge von 0,1 bis 20 Gew.-% der Mischung aus Lungenflüssigkeit und Saponin versetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das nicht-toxische Saponin mit der Probe der Lungenflüssigkeit in einer Menge von 5 bis 10 Gew.-% der Mischung aus Lungenflüssigkeit und Saponin versetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das nicht-toxische Saponin als wäßrige Lösung verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung des nicht-toxischen Saponins eine kleinere Menge eines für die pathogenen Mikroorganismen nicht-toxischen Antischaummittels enthält.