CH632938A5

CH632938A5 - Procedimento per individuare la presenza di organismi patogeni in campioni di fluido polmonare.

Info

Publication number: CH632938A5
Application number: CH738377A
Authority: CH
Inventors: Gordon Lee Dorn
Original assignee: Wadley Res Inst & Blood Bank
Priority date: 1976-06-28
Filing date: 1977-06-15
Publication date: 1982-11-15
Also published as: FR2356403A1; IT1079722B; GB1533835A; CA1094933A; DE2728456A1; JPS533515A; AU2559577A; BR7704186A; FR2356403B1; DE2728456C2; US4053363A; AU510958B2; JPS60996B2

Description

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per individuare la presenza di organismi patogeni in campioni di fluido polmonare, rispettivamente di espettorato, analizzando dei terreni di cultura inoculati con detti campioni.

Lo stato di polmonite in un paziente umano comprende generalmente una condizione infiammatoria acuta di un polmone o dei polmoni, che può essere dovuta a microbi patogeni, ad esempio batteri o virus come pure a sostanze chimiche irritanti o corpi estranei. Per determinare l'agente che provoca in un paziente con presunta diagnosi di polmonite uno stato infiammatorio è necessario disporre di campioni di fluido polmonare.

I campioni ideali di fluido polmonare sono campioni omogenei che possono ottenersi per intervento chirurgico 5 per esempio per aspirazione transtracheale. Comunemente le tecniche di intervento chirurgico richiedono tempo e presentano un rischio per il paziente. E' risaputo che possono verificarsi reazioni letali dovute ad aspirazione transtracheale. Ad esempio pazienti ipotossici e pazienti che soffrono io di malattie delibitanti, come discrasia del sangue, sono particolarmente inclini a gravi complicazioni in seguito all'aspirazione transtracheale.

Di conseguenza, la maggior parte dei medici, ricorre, come mezzo per ottenere campioni di fluido polmonare, allo 15 sputo o espettorato dalla prima tosse della mattina. Questa tecnica è semplice e molto comune. Sfortunatamente i campioni di sputo espettorato con la tosse possone essere facilmente contaminati dalla flora normale che si trova nella bocca, nel naso, nella faringe posteriore e nello stomaco. 20 Inoltre gli espettorati da pazienti con polmonite sono molto viscosi e di natura eterogenea e quindi difficili da disperdere in maniera riproducibile. Non è possibile effettuare analisi quantitative su espettorati molto viscosi ed eterogenei poiché in genere per l'analisi quantitativa è necessario diluire 25 li campione di espettorato e quindi spalmare (piate) piccole porzioni del campione su vari terreni di cultura e poi determinare il tipo ed il numero delle colonie di organismi microbici che risultano sui terreni di cultura. Generalmente il numero massimo di colonie che si può contare su una sca-30 tola Petri è di circa 300. Inoltre si è accertato che i campioni di sputo normali possono contenere microorganismi contaminanti fina a IO5 per millilitro, mentre, nel caso della polmonite, i microorganismi che la provocano sono in genere presenti in quantità superiori a circa IO6 per millilitro. 35 Quindi, prima che un campione di espettorato pòssa venire analizzato quantitativamente, esso deve essere diluito in maniera tale che i microbi patogeni siano dispersi uniformemente nel campione diluito che ne risulta. Perciò, se si analizza quantitativamente una piccola parte dell'espettorato 40 diluito, per determinare il tipo ed il numero di microbi patogeni presenti, si potrà calcolare accuratamente l'esatto numero di microbi patogeni per millilitro del campione di espettorato.

Quindi, allo scopo di ridurre il problema di contamina-45 zione esterna e di eterogeneità del campione di espettorato e fornire una'nalisi quantitativa dell'espettorato si è cercato in diversi modi di digerire il campione di espettorato con digestori enzimatici e chimici. Si sono sperimentati a tutt'oggi diversi tipi di digestori e tutti presentano uno o più dei se-50 guenti svantaggi: alto costo, breve vita di conservazione, sensibilità alla temperatura, tossicità per uno o più organismi patogeni; essi richiedono inoltre un lungo periodo di digestione. Per esempio si sono esaminati numerosi enzimi proteolitici in espettorato sia purulento sia mucoide. Tra 55 tali sostanze enzimatiche, le più efficaci sembrano la tripsina, l'elastase e la chimotripsina; ed enzimi come la bromelaina, la ficina o la papaina erano efficaci solo in concentrazioni estremamente alte mentre la plastilina non ha effetto riscontrabile sulla viscosità dell'espettorato. Sembra che tutti questi 60 enzimi proteolitici siano più efficaci con espettorati mucoidi che con espettorati purulenti. I digestori più largamente usati per analisi quantitative dell'espettorato sono soluzioni acquose di N-acetil-cisteina ed il reagente di Cleland (1,4 ditio-mesoeritrite). In generale il reagente di Cleland pre-65 senta una attività mucolitica superiore a quella della N-ace-tilcisteina a concentrazioni minori, ma il reagente di Cleland perde generalmente la sua attività mucolitica entro periodi di tempo relativamente brevi in soluzione acquosa. Inoltre,

3

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ambedue questi reagenti sono leggermente tossici per i microbi patogeni alle concentrazioni necessarie per una rapida digestione dell'espettorato.

Di conseguenza la maggior parte dei campioni d'espettorato viene trattata con una tecnica di striscio non quantitativa, che consiste generalmente nello strisciare il campione d'espettorato eterogeneo su diversi terreni di cultura. Queste tecniche portano a un notevole numero di culture positive fittizie e, in molti casi, ad una sovracrescita o crescita sovrapposta (overgrow) degli organismi patogeni dovuta a microorganismi contaminanti.

Con la presente invenzione è stato scoperto che certe saponine purificate presentano attività mucolitica e possono agire efficacemente degradando campioni di sputo o espettorato, comprendenti sputi sia purulenti sia mucoidi, e microbi patogeni dispersi uniformemente in essi senza pericolo per i patogeni.

Il procedimento secondo la presente invenzione è pertanto caratterizzato dal fatto che detti campioni di fluido polmonare, rispettivamente di espettorato vengono liquefatti uniformemente con una saponina atossica.

Secondo una preferita forma di realizzazione il procedimento in oggetto prevede la miscelazione del campione di fluido polmonare rispettivamente di espettorato, con una saponina non tossica in quantità tale da agire come efficace mucolitico, così da impartire al campione di fluido polmonare la viscosità desiderata, praticamente uniforme, e la successiva intima miscelazione del campione risultante così da disperdere uniformemente i microbi patogeni contenutivi prima del moment oin cui il campione viene analizzato.

La saponina non tossica o atossica che è utilizzabile nell'ambito della presente invenzione può essere purificata col procedimento descritto nel brevetto U.S.A. 3 883 425.

Le saponine sono glucosidi, largamente distribuiti nelle piante e sono capaci di formare emulsioni del tipo olio-in-acqua, e agiscono come colloidi protettori. Ogni molecola di saponina consiste di una sapogenina, che costituisce la parte di aglucone della molecola, e di uno zucchero.

La sapogenina è una struttura triterpenoido (di solito con una struttura pentaciclica, come l'acido quillaico), oppure una struttura di steroide (avente una catena laterale spiroacetalica come quella nella diosgenina). La parte costituita da uno zucchero del glucoside saponina comprende uno o più zuccheri come glucosio, saccarosio, xilosio, un pentosio o un metilpentosio, oppure altri zuccheri. Per idrolisi, le saponine danno la sapogenina e uno o più di questi zuccheri.

Saponine disponibili in commercio comprendono una polvere, amorfa, da bianca a bruna, che è pungente ed ha un sapore e un odore sgradevoli. Questa polvere è molto solubile in acqua e forma schiuma molto resistente quando viene scossa con acqua.

Le saponine commerciali vengono preparate mediante estrazione del tessuto della pianta con acqua e/o con solventi organici, come alcole, ed isolamento della saponina mediante precipitazione, ricristallizzazione e simili. Le saponine sono largamente distribuite nelle piante. Per esempio, le saponine sono molto largamente distribuite nella famiglia delle cariofillacee. Esempi specifici di fonti di saponina comprendono la quillaria saponaria, il «legno di panama» (panama wood), il frutto di certe piante del genere Sapindus, liquerizia e simili. Un esempio specifico di un procedimento per produrre saponina commerciale è descritto nella Enciclopedia chimica di Kingzette (Kingzette's Chemical Encyclopedia), d.H. Hey, 9na edizione, (1966) che comprende sia l'estrazione della corteccia di saponaria polverizzata (Quillaja saponaria) con alcole caldo o mediante ebollizione dell'estratto acquoso essiccato, polverizzato di tale pianta con alcole, e cristallizzazione della saponina dell'alcole col raffreddamento.

Le saponine praticamente non sono tossiche per l'uomo in seguito ad ingestione orale, ma agiscono come potente emolitico quando vengono iniettate nella corrente sanguigna, dissolvendo in tal modo i corpuscoli rossi del sangue. Per questa caratteristica le saponine sono state usate convenzionalmente nei laboratori ematologici per la lisi delle cellule rosse (eritrociti) dovunque la loro presenza interferisca con altri procedimenti, per esempio determinazioni dell'emoglobina e conteggio delle cellule bianche (linfociti).

Come esposto nel brevetto citato, U.S.A. 3 883 425, si fornisce una tecnica per allontanare tossine microbiche da saponina, estratta da una sorgente vegetale, allontanando i costituenti da una soluzione acquosa di questa saponina, che abbia un peso molecolare apparente inferiore a circa 600, per esempio una dimensione molecolare in soluzione acquosa tra circa 140 e circa 600. Una delle tecniche descritte in tale brevetto consiste nel formare una soluzione acquosa di un estratto di saponina commerciale da piante e successivamente far passare la soluzione attraverso una membrana microporosa di un filtro, che abbia una dimensione media effettiva dei pori che non sia inferiore ad un diametro di circa 11 angström e non sia superiore ad un diametro di circa 24 angström. La soluzione acquosa, che passa attraverso la membrana microporosa del filtro, conterrà la tossina antimicrobica ed il filtro escluderà il materiale sapo-ninico.

E' stato ora trovato che questi estratti vegetali di saponina, purificati, sono agenti mucolitici efficaci in quanto degradano efficientemente tutti i tipi di espettorato e disperdono microbi patogeni contenutivi senza danneggiare i patogeni.

Il procedimento secondo la presente invenzione è pertanto caratterizzato dalla parte caratterizzante della rivendicazione 1.

Nell'esecuzione del procedimento secondo la presente invenzione il campione di espettorato viene raccolto secondo una qualunque tecnica convenzionale. Successivamente esso viene mescolato con una quantità mucolitica piccola, ma efficace, della saponina non-tossica su descritta. Di preferenza la saponina si trova in soluzione acquosa quando viene mescolata con l'espettorato. La soluzione acquosa può essere di qualunque concentrazione conveniente, tale che, quando si mescoli la quantità desiderata di soluzione col campione di sputo, sia presente una quantità di saponina sufficiente a degradarlo. In generale, è necessario che sia contenuto da circa 0,1 %, in peso, a circa 20%, in peso, e, di preferenza, da circa 1,0% in peso a circa 10% in peso ed ancor meglio da circa 5% in peso a circa 10% in peso di saponina nella miscela risultante di saponina ed espettorato.

Inoltre, ë preferibile aggiungere alla miscela risultante di saponina ed espettorato da circa 0,1 % in peso a circa 20% in peso e meglio ancora da circa 5 % in peso a circa 10% in peso, di un antischiumogeno, che non sia deleterio per i microbi patogeni. Agenti antischiuma di questo tipo adatti comprendono materiali venduti col nome di fabbrica di Dow X Antifoam B e Dow X H 10. Questi agenti contengono polimeri chimici di dimetilsilossano e di un emulsionante sterilizzabile, per esempio trattabile in autoclave, non-ionico, come il tipo venduto col nome di fabbrica di Triton X. Il materiale venduto col nome di fabbrica di Dow X H 10 può essere preferito in quanto è molto stabile alla sterilizzazione mediante trattamento in autoclave. La saponina degrada efficacemente tutti i tipi di espettorato, sia mucoide sia purulento, molto rapidamente formando una miscela di viscosità uniforme.

5

io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

632 938

4

Il campione di espettorato viene poi mescolato intimamente così da disperdere uniformemente in esso i microorganismi. Se lo si desidera, si possono spalmare direttamente su vari terreni porzioni del campione di espettorato degradato risultante in modo da ottenere un'analisi dell'espettorato qualitativa perfezionata, che non è esposta al notevole numero di culture positive fittizie e alla sovra-crescita di flora patogena in seguito all'azione di microorganismi contaminanti come avviene nella tecnica quantitativa convenzionale, che non utilizza espettorato degradato.

Nell'esecuzione dell'analisi quantitativa perfezionata dell'espettorato secondo la presente invenzione, l'espettorato trattato con saponina viene diluito a piacere, per esempio, a 1 : 100 - 1 : 1000, con soluzione salina normale, tamponata con fosfato, pH 7,2 o con qualunque altro diluente adatto, che non interferisca nella tecnica analitica e non sia tossico per i microbi patogeni. Il campione diluito risultante viene mescolato intimamente così da assicurare una distribuzione uniforme dei microbi patogeni in tutta la soluzione. Successivamente si aggiungono campioni della soluzione diluita a terreni di cultura convenzionali e si fa incubare. Successivamente si possono identificare sui terreni le colonie risultanti e conteggiarle e, conoscendo l'entità della diluizione del campione di espettorato, è possibile in tal modo calcolare facilmente la quantità totale di tipi differenti di microbi patogeni. Oppure, se lo si desidera, si possono sottoporre ad esame microscopico i campioni non diluiti.

Gli esempi che seguono vengono presentati per illustrare più in particolare la presente invenzione.

Esempio I

In questo esempio, si confrontò la tossicità di vari agenti mucolitici noti con quella della saponina. In ciascun caso i ceppi di batteri, riportati nella tabella 1, che segue, vennero fatti crescere per una notte nei terreni di cultura indicati nella tabella 1 e si regolò con soluzione salina sterile, la torbidità dei terreni di crescita risultanti di fronte ad uno standard di solfate di bario approssimativamente a IO8 batteri per millilitro. Successivamente il brodo risultante venne diluito a 1 : 200 in brodo nutriente. Quindi si aggiunse una soluzione 40 % in peso di saponina, che era stata purificata secondo il procedimento esposto nel brevetto U.S.A. 3 883 425 (allo scopo di allontanare da essa i contaminanti î tossici, che avevano un peso molecolare apparente inferiore a circa 600 in soluzione acquosa), al tipo di brodo di cultura adatto per i particolari batteri indicati nella tabella 1. Successivamente, si aggiunse un millilitro di ciascuna sospensione di brodo di cultura batterica ad 1 millilitro della soluto zione di saponina sopra descritta, così da ottenere una concentrazione finale di 20% in peso di saponina e successivamente si fece incubare per una notte a 37°C. Si fece pure uno striscio con sospensione di confronto e di prova su agar ricco contenente 1 % in peso di glucosio o agar sangue. 15 Gli altri composti di cui si determinò la tossicità erano il reagente di Cleland (1,4-ditio-mesoeritrite), N-acetilcisteina, e sodio laurilsolfato. Questi agenti mucolitici vennero preparati nelle concentrazioni e nel brodo di cultura per ciascun microorganismo come indicato nella tabella 1 e se ne 20 esaminò la tossicità nello stesso modo descritto sopra per la saponina.

Se i particolari batteri crescevano nel brodo contenente la quantità indicata di agente mucolitico, si ripeteva l'operazione per vedere se la crescita poteva venire raddoppiata 25 in una seconda marcia. Se non si otteneva crescita nel primo e nel secondo tempo, si rifaceva l'operazione in un terzo tempo nel tentativo di far crescere i batteri. In alcuni casi, una terza marcia viene effettuata anche se i batteri crescevano nelle prime due. Perciò, nella tabella un più indica 30 una marcia con crescita positiva e un meno indica una marcia con crescita negativa. Più in particolare:

+ + + = crescevano tre volte su tre

= non crescevano nemmeno una volta su tre

35

1- = crescevano una volta su tre

—h+ = crescevano due volte su tre.

I risultati sono esposti nella tabella 1 che segue:

5

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Tipo del Agente mucolitico e concentrazione percentuale

Organismo brodo di Saponina di Cleland N-acetilcisteina Laurilsolfato sodico cultura0 20% 0,1% 0,5% 0,5% 5,0% 2,5% 10,0%

Escherichia coli 1

1

+

+ +

+

- + +

+ - +

+ + +

Staphylococcus XIII

1

+

+ +

+

+ + -

Pseudomonas species

1

+

+ +

+

+ + -

+ - +

H 1"

Candida species

1

+

+ +

+

-+ +

+ + +

+

Torulopsis glabrata

1

+

+ +

+

- + -

+ + +

Streptococcus pyogenes

2

+

+ +

+ -

Streptococcus pneumoniae

3

+

+ +

Citrobacter freundii

1

+

+ +

+

+ + +

- + +

+ + +

Klebsiella pneumoniae

1

+

+ +

+

- + +

+ + +

Enterobacter aerogenes

1

+

+ +

+

- + +

+ + +

Salmonella cholerasuis

1

+

+ +

+

- + +

+

+ + +

Proteus mirabilis

1

+

+ +

+

- + +

+ + +

Listeria monocytogenes

4

+

+ +

+

+ + -

+

Neisseria meningitidis

4

+

—

-

—

-

—

Brucella suis

4

+

- +

+ -

Bacteroides fragilis

5

+

+ +

+ -

Clostridium perfringins

5

+

+ +

+ -

-

—

Propionibacterium shermanii

5

+

+ -

Mycoplasma hominis

6

+

NT

° 1 - cresceva in brodo ricco contenente 1% in peso di glucosio

2 - cresceva in brodo Todd-Hewett e veniva strisciato successi vamente su sangue

3 - cresceva in brodo ricco contenente 1% in peso di glucosio e veniva successivamente strisciato su sangue

4 - cresceva in brodo ricco contenente 1% in peso di glucosio e veniva successivamente strisciato su sangue in un contenitore con CO2

5 - cresseva in un brodo di peptone, lievito, glucosio, maltosio e veniva successivamente strisciato su sangue in un contenitore (jar) anaerobico

6 - cresceva originariamente in un brodo PPLO e successiva mente veniva strisciato su agar PPLO in un contenitore con C02

NT - non analizzato.

Come si può osservare dalla tabella 1 su riportata, la concentrazione relativamente elevata della saponina purificata non uccideva o inibiva la crescita di alcuno dei microorganismi esaminati. Invece, ciascuno degli altri agenti mucolitici esaminati impediva la crescita di parecchi dei microorganismi a concentrazione molto più bassa di quella della saponina. Si dovrebbe pure notare che anche alla concentrazione d'uso raccomandata degli agenti mucolitici attualmente usati (0,5% N-acetilcisteina e 0,1% del reagente di Cleland) si verificò tossicità di fronte a parecchi organismi.

Esempio II

Si effettuarono analisi cliniche di parecchi campioni di espettorato dopo che i campioni erano stati disciolti in saponina non tossica e si confrontarono i risultati con la normale analisi di laboratorio dell'espettorato che si conduce convenzionalmente in un comune ospedale. Inizialmente si raccolse un campione di espettorato emesso il mattino presto e si effettuarono un preparato umido e una spalmatura (prep

50 and smear) per graduare l'espettorato ed osservarne le caratteristiche, come spore. Si graduarono gli espettorati da 1 a 4 secondo le seguenti caratteristiche:

Grado 1: saliva - schiumosa, limpida, incolore, per la mag-55 gior parte con celle epiteliali su un campo di 40X

Grado 2: mucoide - incolore, da limpida a translucida, in maggioranza eosinofili e macrofagi, cellule poli-morfonucleari meno di 60%, e meno di di un 60 campo di 40X avente cellule.

Grado 3: mucopurulento - da incolore a verdastro, leggermente translucido e approssimativamente y2 del campo riempito con cellule.

65

Grado 4: purulento - da giallo a verdastro, torbido, cellule polimorfonucleari più di 70%, e più di l/i del campo ricoperto con cellule.

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6

In ciascun caso venne determinata la densità cellulare osservando quale percentuale di un campo di 40X era riempita con cellule su un preparato di campione bagnato. Si determinò la citologia colorando (Papanicolaou) un vetrico, conteggiando 200 cellule del campione e identificando le cellule polimorfonucleari (PMN), eosinofili, basophili, macrofagi, monociti e linfociti.

Dopo la graduazione di ciascun campione di espettorato, si effettuò su di esso un'analisi di routine o analisi normale, che comprende l'operazione di sei strisci semiquantitativi con parte del campione di espettorato su una piastra di agar-sangue (BA); su una piastra di agar di cioccolata (CHOC); su una piastra di blu di metilene eosina (EMB); su una piastra di sali di mannitolo (MAN); su una piastra di penicillina contenente sali di mannitolo (MAN-PEN); e su una piastra di Sabourand + gentamicina (SDA-GENT), e lasciando crescere eventuali batteri sulla piastra e successivamente identificandoli. La parte residua di ciascun campione venne successivamente fatta digerire con una quantità uguale di saponina 10% in peso (che era stata purificata secondo il brevetto U.S.A. 3 833 425) e citrato sodico 0,1 M, e un agente antischiuma (Antifoam B Emulsion - Dow Corning), così da ottenere una concentrazione finale di 5 % in peso di saponina in essa. Succesivamente la miscela di saponina-espettorato venne sottoposta a movimento vorticoso per almeno 30 secondi.

Successivamente, l'espettorato originale, digerito, venne strisciato sulle seguenti piastre: BA; CHOC; EMB; MAN; MAN-PEN; e SDA-GENT. Successivamente si effettuarono.

due diluizioni 1 : 100 da una porzione dell'espettorato digerito in bottiglie contenenti soluzione salina così da ottenere diluizioni 10z e IO4, per esempio si introdussero 0,1 millilitri di espettorato in una soluzione salina di 9,9 millilitri per 5 la diluizione di IO2 e si introdussero 0,1 millilitri della diluizione IO2 in 9,9 millilitri di soluzione salina per ottenere la diluizione IO4. Successivamente, si usò un anello di 0,01 millilitri per lo striscio dalla bottiglia di diluizione IO4 sulle piastre seguenti: BA; CHOC; EMB; MAN; MAN+PEN; io ed SDA+GENT, così da ottenere una diluizione finale definita di IO6. Successivamente si strisciò un altro campione di 0,01 millilitri su gentamicina SD A dalla bottiglia di diluizione IO2 così da ottenere una diluizione definita di IO4. Tutte le piastre vennero incubate e lette in 24-48 ore. Le 15 piastre SDA vennero pure lette dopo una settimana. Le piastre vennero interpretate come segue:

(a) un'interpretazione della flora normale (livello e tipo normale di microorganismi trovati in passaggi nasofaringei) per Alpha Streptococcus e Neissera e difteroidi che com-

20 paiono nel campo di 10s e IO7.

(b) infezione positiva per tutti gli altri organismi non lieviti [diversi da quelli esposti sopra in (a)] che compaiono nel campo di IO6 e in un campo superiore.

(c) IO5 si interpretò come 1-5 organismi trovati casualmente 25 su una serie di piastre come eventualmente positivi.

(d) IO3 e più che corrisponde a 1-5 organismi trovati casualmente su ima serie di piastre rappresenta una possibilità di presenza positiva per Candida Albicans, e positiva per tutti gli altri lieviti.

30 I risultati sono esposti nella tabella 2 che segue.

TABELLA 2

Risultati clinici di analisi ed espettorato mediante analisi di routine e quantitativa

Caso n.

Grado dello sputo

Analisi normale (di routine)

Conclusione

Analisi quantitativa

Conclusione

1

2

Scarsa presenza di Enterococcus, Klebsiella penumoniae, Staphylo-coccus epidermidis, Pseudomonas

Flora normale

2

4

Scarsa presenza di Staphylococcus aureus

Flora normale

2X107 Neisseria perflava

Eventualmente positiva per Neisseria perflava

3

1

Moderata presenza di Serratia marcescens, scarsa presenza di Pseudomonas

Crescita significativa di Serratia marcenscens

1X IO6 Pseudomonas aeruginosa, IX IO5 Serratia marcescens

Positiva per Pseudomonas aeruginosa, eventualmente positiva per Serratia marcenscens

4

2

Flora normale

5

2

Flora normale

6

2

Flora normale

7

1

Scarsa presenza di Pseudomonas, e Candida albicans

Flora normale

1X IO5 Pseudomonas aeruginosa

Eventualmente positiva per Pseudomonas aeruginosa

8

4

Notevole presenza di Klebsiella pneumoniae, scarsa presenza di Candida tropicalis, Enterococcus

Positiva per Klebsiella pneumoniae

2,5 X IO5 lievito (Candida krusei e Torniopsis glabrata), 1X IO8 Klebsiella pneumonia,

Positiva per lievito, Klebsiella pneumoniae e Enterococcus (D)

4X107 Enterococcus

7

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TABELLA 2 (Continuazione)

Caso n.

Grado dello sputo

Analisi normale (di routine)

Conclusione

Analisi quantitativa

Conclusione

9

4

Moderata presenza di Candida albicans

Positiva per Candida albicans

TNTC Hansenula poly-morpha, 1X IO5 Klebsiella pneumoniae

Positiva per lievito, eventualmente positiva per Klebsiella pneumoniae

10

1

Flora normale

1X IO5 Staphylococcus aureus

Flora normale

11

3

Moderata presenza di Klebsiella pneumoniae, scarsa presenza di Candida albicans

Positiva per Klebsiella pneumoniae

1X IO6 Klebsiella pneumoniae,

1X IO5 Candida albicans

Positiva per Candida albicans, eventualmente positiva per Klebsiella pneumoniae

12

1

Scarsa presenza di Pseudomonas fluore-scens, Candida albicans

Flora normale

1X IO6 Candida albicans, 1X IO6 Pseudonomas fluorescens, 1X IO5 Klebsiella pneumoniae

Positiva per Candida albicans e Pseudomonas fluorescens, eventualmente positiva per Klebsiella pneumoniae

13

2

Flora normale

14

3

Moderata

Klebsiella pneumoniae, scarsa presenza di Candida albicans

Positiva per Klebsiella pneumoniae

1X IO6 Candida albicans,

Positiva per Candida albicans

15

2

Scarsa presenza di Staphylococcus aureus, Candida albicans

Flora normale

1X 10e Candida albicans, 1X IO6 Staphylococcus aureus

Positiva per Candida albicans e Staphylococcus aureus

16

2

Candida albicans

Positiva per Candida albicans

1X IO3 Candida albicans

Eventualmente positiva per Candida albicans

17

2

Scarsa presenza di Beta Streptococcus, Staphylococcus aureus, Candida albicans e Candida tropicalis

2X105 rorutopsis magii, 4X IO5 Candida albicans

Positiva per Torulopsis magii e Candida albicans

18

4

Haemophilus influenzae

Positiva per

Haemophilus influenzae

6X108 Haemophilus influenzae,

IX IO3 Torulopsis glabrata

Positiva per Haemophilus influenzae, eventualmente positiva per Torulopsis glabrata

19

1

Flora normale

20

3

Notevole presenza di Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epider-midis

Positiva per Enterbacter cloacae, Klebsiella pneumoniae e Staphylococcus epi-dermidis

> IO8 Klebsiella pneumoniae,

> IO8 Enterobacter cloacae,

IO5 Candida krusei, IO5 Torulopsis glabrata, IO4 Candida tropicalis

Positiva per Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Candida krusei, Torulopsis glabrata e Candida tropicalis

21

3

Flora normale

1 Pénicillium humulii

Flora normale

22

2

Flora normale

23

2

Flora normale

Flora nonnaie

24

2

Scarsa presenza di Candida tropicalis

Flora normale

2,5X IO4 Candida tropicalis, 1,5X IO4 Torulopsis glabrata

Positiva per Candida tropicalis e Torulopsis glabrata

25

4

Scarsa presenza di Klebsiella pneumoniae, 3 col. Staphylococcus aureus

Flora normale

—IO5 Klebsiella pneumoniae

Eventualmente positiva per Klebsiella pneumoniae

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8

TABELLA 2 (Continuazione)

Caso n.

Grado dello sputo

Analisi normale (di routine)

Conclusione

Analisi quantitativa

Conclusione

26

3

Flora normale

27

4

Scarsa presenza di Candida tropicalis

Flora normale

IO6 Escherichia coli IO3 Torulopsis glabrata

Eventualmente positiva per Escherichia coli e Torulopsis glabrata

28

4

Flora normale

6X10' Haemophilus, 1X IO3 Torulopsis glabrata

Eventualmente positiva per Haemophilus e Torulopsis glabrata

29

2

Flora normale

30

3

Moderata presenza di Acinetobacter calcoaceticus (H)

Positiva per Acinetobacter calcoaceticus (H)

2X IO8 Acinetobacter calcoaceticus (H), 1X IO8 Haemophilus

Positiva per Acinetobacter e calcoaceticus Haemophilus

31

4

Flora normale

1X IO8 Diplococcus

Positiva per Diplococcus

32

3

Flora normale

33

2

Candida albicans

Positivo per Candida albicans

1X IO5 Candida albicans

Positivo per Candida albicans

34

2

Flora normale

35

3

Scarsa presenza di Enterobacter cloacae

Flora normale

IO6 Pseudomonas aeruginosa,

IO5 Proteus mirabilis

Eventualmente positivo per Pseudomonas aeruginosa e Proteus mirabilis

36

3

Scarsa presenza di Proteus vulgaris

Flora normale

1X IO6 Proteus vulgaris

Eventualmente positivo per Proteus vulgaris

37

3

Scarsa presenza di Candida albicans

Flora normale

38

2

Flora normale

1X103 Candida Albicans

Eventualmente positivo per Candida albicans

39

3

Moderata presenza di Klebsiella pneumoniae, scarsa presenza di Enterococcus e Candida tropicalis

Positivo per Klebsiella

105 Klebsiella pneumoniae,

105 Enterococcus 105 Candida albicans

Positivo per Candida albicans, eventualmente positivo per Enterococcus e Klebsiella pneumoniae

40

3

Notevole presenza di Candida albicans, scarsa presenza di Klebsiella pneumoniae

Positivo per Candida albicans

109 Klebsiella pneumoniae,

> 105 Candida albicans

Positivo per Klebsiella pneumoniae Candida albicans

41

4

10e Haemophilus

Eventualmente positivo per Haemophilus

42

2

Flora normale

43

4

Scarsa presenza di Candida albicans

Flora normale

105 Candida albicans

Positivo per Candida albicans

44

4

Notevole presenza di Candida albicans

Positivo per Candida albicans

> 106 Candida albicans, 105 Serratia liquefaciens, 105 Pseudomonas

Positivo per Candida albicans, eventualmente positivo per Serratia liquefaciens e Pseudomonas

45

2

Flora normale

46

4

Proteus mirabilis e cocci gram positivi (impossibile isolare)

Positivo per Proteus mirabilis

106 Proteus mirabilis

Eventualmente positivo per Proteus mirabilis

9 632938

TABELLA 2 (Continuazione)

Caso n.

Grado dello sputo

Analisi normale (di routine)

Conclusione

Analisi quantitativa

Conclusione

47

4

Scarsa presenza di Klebsiella pneumoniae

Flora normale

IO7 Klebsiella pneumoniae, Basisdiomycetes

Positivo per Klebsiella pneumoniae

48

3

Staphylococcus aureus

Flora normale

49

4

Notevole presenza di Klebsiella pneumoniae

Positivo per Klebsiella pneumoniae

1X IO8 Klebsiella pneumoniae

Positivo per Klebsiella pneumoniae

50

2

Flora normale

51

3

Scarsa presenza di Klebsiella pneumoniae, Beta Streptococcus, moderata presenza di Citrobacter freundii

Positivo per Citrobacter freundii

1X IO6 Pseudomonas putida

Eventualmente positivo per Pseudomonas putida

52

3

Flora normale

53

4

Moderata presenza di Candida albicans

Positivo per Candida albicans

2 X IO5 Candida albicans e Candida tropicalis

Positivo per Candida albicans e Candida tropicalis

54

3

Scarsa presenza di Candida albicans

Flora normale

1X IO3 Candida albicans

Eventualmente positivo per Candida albicans

55

2

Notevole presenza di Klebsiella pneumoniae, scarsa presenza di Escherichia coli

Positivo per Klebsiella pneumoniae

1X IO8 specie Neisseria, 1 specie Fusarium

Eventualmente positivo per la specie Neisseria

56

3

Scarsa presenza di Klebsiella pneumoniae, Candida tropicalis

Flora normale

—3 X105 Candida para-psilosis

Positivo per Candida para-psilosis

57

3

Scarsa presenza di Haemophilus, Candida albicans

Flora normale

1X IO3 Candida albicans, 1X IO8 Haemophilus

Positivo per Haemophilus eventualmente positivo per Candida albicans

58

4

Moderata presenza di Haemophilus

Positivo per Haemophilus

1,0 X IO8 Haemophilus

Positivo per Haemophilus

59

2

Notevole presenza di Klebsiella pneumoniae, scarsa presenza di Escherichia coli

Positivo per Klebsiella pneumoniae

1X IO6 Klebsiella pneumoniae

Eventualmente positivo per Klebsiella pneumoniae

60

4

Scarsa presenza di Haemophilus

Flora normale

>3X108 Haemophilus

Positivo per Haemophilus

61

2

Scarsa presenza di Klebsiella pneumoniae

Flora normale

1X IO6 Klebsiella pneumoniae, 1X IO3 Candida albicans

Positivo per Klebsiella pneumoniae, eventualmente positivo per Candida albicans

62

4

Flora normale

63

4

Haemophilus

Positivo per Haemophilus

1X IO7 Haemophilus

Positivo per Haemophilus

64

2

Scarsa presenza di Serratia liquefaciens

Flora normale

65

4

Flora normale

66

3

Flora normale

632938

10

TABELLA 2 (Continuazione)

Caso

Grado dello sputo

Analisi normale (di routine)

Conclusione

Analisi quantitativa

Conclusione

67

68

69

70

73

74

75

76

77

71 2

72 3

2 4

78 3

79 2

80 3

Notevole presenza di Klebsiella pneumoniae, scarsa presenza di Enterococcus

Flora normale

Moderata presenza di Staphilococcus aureus, scarsa presenza di Alpha Streptococcus

Notevole presenza di Serratia liquefaciens, scarsa presenza di Alpha Streptococcus

Flora normale

Moderata presenza di Enterobacter aerogenes

Flora normale

Scarsa presenza di Klebsiella pneumoniae, e di Enterococci

Enterobacter,

Candida albicans

Enterobacter aerogenes, Candida albicans

Scarsa presenza di Klebsieila pneumoniae (2)

Flora normale

Alpha Streptococcus, Neisseria

Positivo per Klebsiella pneumoniae

Flora normale

Positivo per Staphylococcus aureus

Positivo per Serratia liquefaciens

Flora normale

Positivo per Enterobacter aerogenes

Flora normale Flora normale

Flora normale

Flora normale Flora normale Flora normale

1X IO7 Enterococcus (D) 3 X IO8 Klebsiella pneumoniae

Flora normale

IX IO7 Staphylococcus aureus

> IO8 Serratia liquefaciens

Flora normale

1X IO7 Enterobacter aerogenes, 1X 10c Serratia liquefaciens

1X IO7 Serratia liquefaciens

Flora normale

1X IO4 Candida albicans

> 1X IO8 Enterobacter cloacae, 1,5X IO5 Candida albicans

1X IO8 Haemophilus, 1X IO6 Klebsiella pneumoniae e Specie Hor-modendrum, 1X IO6 Pasteur ella

Flora normale

IX10® Haemophilus, 1X IO7 Klebsiella pneumoniae

Positivo per Enterococcus (D) e Klebsiella pneumoniae

Flora normale

Positivo per Staphylococcus aureus

Positivo per Serratia liquefaciens

Flora normale

Positivo per Enterobacter aerogenes, eventaul-mente positivo per Serratia liquefaciens

Positivo per Serratia liquefaciens

Flora normale

Positivo per Candida albicans

Positivo per Enterobacter cloacae e Candida albicans

Positivo per Haemophilus, eventualmente positivo per Klebsiella pneumoniae e Pasteur ella

Flora normale

Positivo per Haemophilus e Klebsiella pneumoniae

Come si può osservare nella tabella 2, il metodo clinico normale o di routine e il metodo quantitativo (che utilizzava

10 stadio di digestione con saponina) vennero applicati a 80 campioni di espettorato e 29 risultati differivano. In 26 casi,

11 metodo quantitativo valutò un positivo quando il metodo clinico comune di laboratorio non lo riscontrava ed in tre casi il metodo clinico comune di laboratorio valutò un positivo i cui numeri non erano sufficientemente elevati da essere considerato un positivo da standard o norme quantitativi/ e. Si è notato in particolare che in 7 pazienti venne trovato 1'Haemophilus influenzae con il metodo quantitativo su piastre a cioccolata superiore a IO7 per millilitro e non era stato riscontrato dal metodo clinico comune di laboratorio a causa della sovracrescita. Questo particolare orga-

55 nismo ha una grande importanza clinica nella polmonite. Inoltre, in quattro occasioni, presentavano sovracrescita o crescita sovrapposta altri organismi che costituivano doppie infezioni e non erano stati rilevati con l'analisi clinica normale di laboratorio. La maggior parte delle differenze nei 60 risultati esposti nella tabella si trovavano nei lieviti, indicati come positivi dal procedimento quantitativo e non rilevati o considerati di scarsa crescita col metodo clinico comune di laboratorio.

La maggior parte delle differenze dei risultati esposti 65 nella tabella si ebbe per i lieviti, indicati come positivi, dal procedimento quantitativo e non rilevati o considerati di scarsa crescita dal metodo clinico comune di laboratorio.

Qui di seguito, per mettere in relazione i ritrovati di

11

632938

laboratorio con la storia del paziente, la tabella 3 mostra alcune correlazioni da autopsie della gola e dei polmoni. I risultati di queste correlazioni sono esposti nella tabella 3 che segue:

TABELLA 3

TABELLA 3 (Continuazione)

Paziente n.

Cultura

Risultati

I

Gola

Espettorato*

Scarsa presenza di Candida albicans

1 X IO5 Candida albicans, 1X IO5 Proteus e Pseudomonas aeruginosa

II

Gola

Espettorato

Flora normale

IO8 Haemophilus, IO6 Klebsiella pneumoniae, 10e Pas tur ella

III

Espettorato Gola

1X IO9 Klebsiella pneumoniae Moderata presenza di Candida albicans

IV

Gola

Espettorato

Scarsa presenza di Pseudomonas aeruginosa

1X IO5 Pseudomonas aeruginosa

V

Gola

Espettorato Autopsia dei polmoni

Staphylococcus, Streptococcus Beta, scarsa presenza di Klebsiella pneumoniae

IO5 Klebsiella pneumoniae Notevole presenza di Klebsiella pneumoniae

VI

Gola

Espettorato

Scarsa presenza di Candida albicans

> IO6 Candida albicans, IO5 Serratia liquefaciens, IO5 Pseudomonas

VII

Gola

Espettorato

Enterococcus, Escherichia coli Fora normale

Vili

Espettorato Autopsia dei polmoni

Fora normale Enterobacter aerogenes

IX

Bocca Gola Lingua Espettorato

Notevole presenza di Klebsiella pneumoniae e Candida tropicalis Notevole presenza di Klebsiella pneumoniae e Candida tropicalis Notevole presenza di Klebsiella pneumoniae e Candida tropicalis IO8 Klebsiella pneumoniae, IO7 Enterococcus

X

Gola

Espettorato

Lactobacillus e Candida albicans IO8 Klebsiella pneumoniae, IO8 Enterobacter cloacae, 155 Candida kruseii, IO4 Candida tropicalis, IO5 Torulopsis glabrata

XI

Gola

Espettorato

Moderata presenza di Staphylococcus aureus

1X IO7 Staphylococcus aureus io

15

Paziente n.

Cultura

Risultati

XII

Gola

Notevole presenza di Klebsiella pneumoniae e Enterobacter aerogenes, Candida albicans

Espettorato

IO8 Enterobacter aerogenes e IO5 Candida albicans

Autopsia

Enterobacter aerogenes e Pseudo

del sangue monas

XIII

Gola

Flora normale

Espettorato

IO4 Candida tropicalis, IO4 Torulopsis glabrata

' Analisi quantitativa dell'espettorato.

20

Come appare dalla tabella 3, in alcuni casi la gola ha gli stessi organismi dell'espettorato, ciò che significa che il paziente era colonizzato o eventualmente c'era una contamina-25 zione orale nel campione di espettorato. Culture ripetute e osservazioni su conteggi varianti eventualmente metterebbero in grado il medico di differenziare fra queste due possibilità. Se si è osservata colonizzazione si dovrebbero prendere allora precauzioni per impedire l'instaurazione di un'in-30 fezione dei polmoni. Inoltre, in molti casi, l'analisi quantitativa dell'espettorato rivela una forte infezione mentre l'analisi del campione prelevato dalla gola non lo fa, in quest'ultimo caso i dati dovrebbero supportare la conclusione che c'è una minima contaminazione nasofaringea e che è 35 molto probabile in questo caso un'infezione dei polmoni.

Esempio III

Questo esempio viene presentato per illustrare l'azione mucolitica (capacità di degradare la viscosità) della saponina 40 su un campione di espettorato clinico. Il campione di espettorato era di 2 millilitri di un espettorato di grado 2 come definito nel precedente esempio II. Per misurare la viscosità del campione si costruì un piccolo viscosimetro come descritto in «Un semplice procedimento per misurare la 45 viscosità dell'espettorato», A.O. Jenssen, Scand. J. Resp. Dis.; 54, 290-296 (1973). Questo viscosimetro comprendeva un unico blocco di materiale plastico, la cui faccia inferiore faceva da base. In questa faccia inferiore si praticò un canale, di sezione semicircolare, terminante in un foro Verso ticale tale da inserirsi in un raccordo ad Y, un ramo del quale era collegato tramite una manichetta di plastica ad un regolatore del flusso d'aria mentre l'altro ramo del raccordo ad Y era collegato con manometro ad acqua tramite un tubo di plastica. Un'apertura per lo scarico dell'aria ven-55 ne praticata nel foro verticale poco al di sopra del canale. Si misurarono variazioni della pressione, come abbassamento di altezza della colonna d'acqua nel manometro. Il tempo richiesto per vuotare il viscosimetro venne registrato in secondi. Per misurare la viscosità di un dato campione, si 60 collocò l'espettorato su di una piastra di vetro. Il viscosimetro, a flusso d'aria costante, venne collocato sull'espettorato che riempiva il canale del viscosimetro. Si chiuse una apertura di sfogo dell'aria sul lato del viscosimetro. Si registrò il tempo necessario per vuotare il viscosimetro e la 65 massima deflessione di altezza della colonna d'acqua. La variazione nell'altezza in millilitri della colonna d'acqua venne convertita in millilitri di mercurio (pressione) moltiplicando per 0,00881. Allora, secondo l'articolo di Jenssen,

632938

12

la pressione x secondi x K = viscosità, in cui K è una costante di calibrazione per il viscosimetro.

11 viscosimetro venne calibrato rispetto ad un viscosimetro di Oswald usando glicerina come standard primario. Per questo viscosimetro K = ì'3,5 x IO3. Le viscosità ottenute con espettorato di grado 2, con e senza aggiunta della saponina purificata, descritta negli esempi I e II, sono riportate nella seguente tabella 4:

TABELLA 4

Azione mucolitica della Saponina su un campione dell' espettorato clinico

5

Natura dell'espettorato: 2 mi di un espettorato di grado 2,0

Centipoise

A. Viscosità di 5 differenti porzioni prima 881

io dell'aggiunta di saponina: 1.332

14.295 19.929 6.962

X = 8678 s.d. = 8306

166 177 161 172

X = 169 s.d. = 7

25

Come si può osservare, l'azione della saponina digeriva efficacemente l'espettorato e dava luogo ad una viscosità praticamente uniforme di tutte le porzioni.

B. Viscosità di 4 differenti porzioni dopo l'aggiunta di 0,1 mi di saponina 13%:

20

v

Claims

632938

1. Procedimento per individuare la presenza di organismi patogeni in campioni di fluido polmonare rispettivamente espettorato, analizzando dei terreni di cultura inoculati con detti campioni, caratterizzato dal fatto che questi vengono liquefatti uniformemente con una saponina atossica.

2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato da ciò che la saponina atossica comprende saponina estratta da piante e resa atossica mediante allontanamento dei costituenti tossici da una soluzione acquosa dell'estratto di saponina, che ha un peso molecolare apparente interiore a 600 nella soluzione acquosa.

2

RIVENDICAZIONI

3. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato da ciò che la saponina atossica viene mescolata col campione di fluido polmonare in quantità che vanno da 0,1 a 20%, in peso, delle miscele di fluido polmonare e saponina.

4. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato da ciò che la saponina atossica viene mescolata col campione di fluido polmonare in quantità da 5 a 10% in peso della miscela di fluido polmonare e saponina.

5. Procedimento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato da ciò che la saponina atossica è contenuta in una soluzione acquosa.

6. Procedimento secondo la rivendicazione 5, caratterizzato da ciò che la soluzione acquosa di saponina atossica comprende inoltre una piccola quantità efficace di un agente antischiuma, che è atossico verso i microbi patogeni.

7. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato da ciò che la miscelazione del campione di espettorato con la saponina atossica viene fatta in quantità tale da degradarne la viscosità prima del momento in cui il campione viene analizzato.

8. Procedimento secondo la rivendicazione 7, caratterizzato da ciò che la saponina atossica comprende saponina estratta da piante e resa atossica mediante allontanamento dei costituenti tossici da una soluzione acquosa dell'estratto di saponina, che ha un peso molecolare apparente inferiore a 600 nella soluzione acquosa.

9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, caratterizzato da ciò che la saponina atossica viene mescolata col campione di espettorato in quantità da 0,1 a 20% in peso della miscela di espettorato e saponina.

10. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato da ciò che la saponina atossica viene mescolata col campione di espettorato in quantità che vanno da 5 a 10% in peso della miscela di espettorato e saponina.

11. Procedimento secondo la rivendicazione 8, caratterizzato da ciò che la saponina atossica è contenuta in una soluzione acquosa.

12. Procedimento secondo la rivendicazione 11, caratterizzato da ciò che la soluzione acquosa di saponina atossica comprende inoltre una piecoia quantità, efficace, di un agente antischiuma, che è atossico per i microbi patogeni.