DE1673013A1

DE1673013A1 - Verfahren zur Bestimmung der Populationsdichte von Bakterienzellen in einer beliebigen Umgebung

Info

Publication number: DE1673013A1
Application number: DE19671673013
Authority: DE
Inventors: D Eustachio Anthony John
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1967-05-01
Filing date: 1967-09-29
Publication date: 1971-05-27
Also published as: FR1559446A; US3616253A; SE350842B; NL6716212A

Description

betreffend

Verfahren zur Bestimmung der Populationsdichte von Bakterienzellen in einer beliebigen Umgebung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Populationsdichte von Bakterienzellen in einer Umgebung. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bakterienzellen in einer wässrigen Suspension einer Probe einer Umgebung.

s/
Adenoinbrisphosphat, nachstehend mit ATP bezeichnet,

ist in allen lebenden Organismen vorhanden. Daher ist es durch Analysieren einer Probe einer Umgebung hinsichtlich ATP möglich, die mutmaßliche Anwesenheit von lebenden Organismen in dieser Umgebung festzustellen. Diese Analyse ist vor allem brauchbar zur Bestimmung der Anwesenheit

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von Bakterien in verschiedenartigen Umgebungen. Häufig ist eine qualitative Bestimmung erforderlich. Eine quantitative Bestimmung der Bakterien ist z.B. erwünscht bei der Bestimmung des Hintergrundspiegels (background level) von Bakterien in Umgebungen wie z.B. Luft, Brennstoffen, Wasser, Milch, Nahrungsmitteln, ärztlichem Bedarf, pharmazeutischen Präparaten, sauberen Bereitstellungsräumen, Krankenhausζimmern und keimfreien Bereichen; für den Nachweis erhöhter Verunreinigung oder Vergiftung in diesen Umgebungen; für den Nachweis von Infektionen, z.B. Niereninfektionen durch Urinanalyse; bei biomedizinischen Untersuchungen von Bakterienkulturen, bei der Kontrolle der Wirksamkeit von Bekämpfung von Verunreinigungen und von Sterilisationsverfahren sowie'schließlich bei der Sterilisation von Verbindungen und Vorrichtungen. Eine Möglichkeit der quantitativen Bestimmung ist das Auszählen von Bakterienzellenkolonien auf Agarplattenkulturen. Diese Arbeitsweise ist jedoch umständlich, da sie beträchtliche Zeit und Aufwand erfordert. Außerdem wird die Genauigkeit durch das Zusammenklumpen der Zellen eingeschränkt.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht nun eine praktische, schnelle und genaue Arbeitsweise zur quantitativen Bestimmung von Bakterien in einer gegebenen Umgebung. Diese Arbeitsweise umfaßt die folgenden Schritte:

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BAD ORIGINAL

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1. Abtrennen praktisch aller Nichtbakterienzellen aus einer wässrigen Suspension einer Probe einer Umgebung,

2. Abtrennen praktisch aller Bakterienzellen aus dieser Suspension,

3. Extrahieren der ATP aus den genannten Bakterienzellen und

k. Messen der Menge des extrahierten Aaenosintrisphosphat, wodurch die Populationsdichte der Bakterienzellen in der genannten Umgebung bestimmt wird.

Zum besseren Verständnis der Erfindung werden im folgenden verschiedene Ausführungsformen und die beigefügte Zeichnung erläutert. Diese ist das direkt ausgedruckte Ergebnis eines elektronischen Rechners von Daten, die in Übereinstimmung mit einer Ausführungsforal der Erfindung erhalten worden sind.

Biologisches Material, das Bakterienzellen enthält, kann u.a. aus tierischen Geweben, Suspensionen von Mikroorganismen, Blut, Urin, Wasser oder Getränken, von denen angenommen wird, daß sie verunreinigt sind, Ausscheidungen von Patienten, Luft oder Brennstoff, die möglicherweise Mikroorganismen enthalten sowie von Nahrungsmitteln u.a. verunreinigten Umgebungen gewonnen werden. Die Entnahme einer Probe aus einer Umgebung und ihre anschließende Lagerung vor der ATP-BeStimmung kann _t auf beliebig bekannte Weise erfolgen. Die Größe der

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BAD ORfGJNAL

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Probe wird bestimmt durch die Empfindlichkeit und den Bereich der Vorrichtungen, die zur Messung der in der Probe vorhandenen Menge an ATP angewandt werden. Die Probe kann, wenn sie nicht bereits in wässriger Form vorliegt, in sterilem Wasser, einer Pufferlösung oder einer Salzlösung suspendiert werden. Hierauf wird sie behandelt, um praktisch alle Nichtbakterienzellen zu entfernen, z.B. lebende Organismen, Leukozyten u.a.. Dies kann durch Zentrifugieren geschehen mit einer Kraft, die ausreicht, um ein Zentrifugat mit einer unteren praktisch bakterienzellenfreien und einer oberen (überstehenden) praktisch nichtbakterienzellenfreien Schicht zu erhalten. Vorzugsweise wird hierzu eine Kraft (Belastung) von etwa 15ο χ g bis etwa 25o χ g angewandt.

Nach dieser Abtrennung wird, wenn in der ersten Stufe zentrifugiert wurde, die überstehende,Bakterienzellen enthaltende Schicht einem weiteren Trennungsschritt unterworfen, worin die Bakterienzellen von praktisch allen extrazellularen wasserlöslichen Stoffen isoliert werden. Vorzugsweise werden die Zellen durch Durchleiten der überstehenden Lösung durch eine mikroporöse Membrane und anschließendes Waschen, z.B. mit steriler kalter Salzlösung, isoliert.

BAD ORIGINAL

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Es wurde festgestellt, daß die oben genannten extrazellularen wasserlöslichen Stoffe, z.B. verunreinigende Salze, Säuren und nichtbakterielle ATP, die Genauigkeit der anschließenden ATP-BeStimmung beeinträchtigt. Insbesondere führt die Anwesenheit von löslicher, nichtbakterieller ATP zu hohen unregelmäßigen Werten für intrazellulare ATP.

Die angegebene Reihenfolge der ersten zwei Schritte ist zweckmäßig. Es wurde festgestellt, daß beim Abtrennen der wasserlöslichen Stoffe vor dem Entfernen von Nichtbakterienzellen hohe Werte für die intrazellulare ATP erhalten werden können. Offensichtlich ist dies eine Folge der Anwesenheit von restlicher nichtbakterieller ATP in der zu untersuchenden Probe.!Qualitative Ergebnisse können durch unmittelbare Analyse der intakten Bakterienzellen erhalten werden. Pur exakte quantitative Untersuchungen sollte Jedoch die ATP aus den Zellen extrahiert werden. Typische Arbeitsweisen zur Durchführung dieser Extraktion schließen die Anwendung von z.B. heißem Wasser, Aceton, Dimethylsulfoxid, Perchlorsäure, Butanol, Äthylalkohol sowie das Zerreißen der Zellen durch Ultraschall ein. Vorzugsweise werden die Zellen durch Eintauchen in eine gepufferte wässrige Lösung von n-Butanol gemäß der USA-Anmeldung Ser. No. 55o,lo3 extrahiert. Die relativen Mengen von n-Butanol

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BAD ORIGINAL^ - : ^ ^i

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und Pufferlösung sind wesentlich. Es muß genügend n-Butanol angewandt werden, um die ve»· ATP freizusetzen und ausreichend Pufferlösung, um das gewünschte Volumen an wässriger Phase, die die aus den Zellen freigesetzte ATP trägt, zu erhalten.

Ein wässriger Extrakt von ATP kann hierauf gemäß der in der USA-Anmeldung Ser. No. 433,^88 beschriebenen Peuerfliegen - (Glühwürmchen, Leuchtkäfer) - Biolumineszensarbeitsweise untersucht' werden. Hierzu wird ein aliquoter Anteil des Extraktes in Gegenwart von Sauerstoff mit einem Reaktionsgemisch in Berührung gebracht, das Luciferin, Luciferase und ein Magnesiumsalz enthält und die Lichtemission beobachtet. Das wässrige Reaktionsmedium (Reaktionsgemisch und Extrakt) enthält im allgemeinen genügend Sauerstoff, damit die Reaktion ablaufen kann. Die Quantität oder die maximale Intensität des emittierten Lichtes ist ein Maß für die vorhandene intrazellulare ATP. Durch Anwendung der einzigen Korrelation, wie sie in der später diskutierten beigefügten Zeichnung gezeigt wird, kann diejPopulationsdichte der Bakterienzellen bestimmt werden.

Das Reaktionsgemisch kann unter Verwendung eines Extraktes der Leuchtorgane der Peuerfliege (Glühwürmchen, Leuchtkäfer) oder der einzelnen Bestandteile, die an der Biolumineszensreaktion teilnehmen, hergestellt

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BAD OR(GINAL

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werden. Vorzugsweise wird ein handelsüblicher lyophylisierter Leuchtorganextrakt der Feuerfliege in einer sterilen wässrigen Lösung vom pH-Wert 7_f^ aufgelöst, die o,ol m MgS(K und o_to5 m Kaliumarsenat enthält. Es können jedoch auch andere Puffer wie Tris(hydroxyraethyl)· aminomethan Anwendung finden.

Der Leuchtorganextrakt der Feuerfliege kann im Laboratorium auch aus getrockneten Feuerfliegenschwänzen erhalten werden. Die Feuerfliegenschwänze werden zunächst mit einer geringen Menge an gewaschener Kieselerde (SiOg) in einer Reibschale mit dem Pistill zu einem feinen Pulver verrieben. Das Pulver wird hierauf mit o,o5 m AsO^ (oder anderem) Puffer/ο,οΐ m MgSO₂₊ Lösung vom pH-Wert 7,^ extrahiert.

Das die einzelnen Bestandteile enthaltende Reaktionegemisch ist ein genau zusammengesetztes Gemisch von Luciferin, gereinigter Luciferase und einem Magnesiumsalz. Dieses Gemisch kann durch Auflösen von Luciferin, gereinigter Luciferase und MgSO^ in einer sterilen wässrigen Lösung erhalten werden. Arsenat und/oder andere Puffer können zugesetzt werden, um den pH-Wert 7,^ einzustellen.

Um die durch ein positives Ansprechen des zu unter- , suchenden Materials auf das Reaktionsgemisch erzeugten

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geringen Lichtmengen zu beobachten und quantitavive Messungen des emittierten Lichtes durchzuführen, können Instrumente verwendet werden, die die Intensität des emittierten Lichtes abtasten und aufzeichnen. Gemäß einer Arbeitsweise wird der erfindungsgemäß hergestellte wässrige ATP-Extrakt in eine Cuvette injiziert, die das Reaktionsgemisch enthält. (Es kann auch umgekehrt das Reaktionsgemisch in eine Cuvette, die den Extrakt enthält, injiziert werden). Der Extrakt wird mit Kaliumarsenatpuffer bei einem pH-Wert 7,^ gehalten. Das infolge der Reaktion zwischen etwa in dem wässrigen Extrakt enhaltener ATP und dem Reaktionsgemisch emittierte Licht fällt auf die lichtempfindliche Oberfläche eines Sekundärelektronenvervielfachers und löst ein elektrisches Signal aus, das entweder durch eine Schirmbildaufnahme oder von einem Koordinatenschreiber gemessen und aufgezeichnet werden kann.

Da das Ansprechen, d.h. die Lichtemission, beinahe sofort erfolgt, sollte das Reaktionsgemisch vor der Zugabe des Extraktes gegenüber dem Lichtdetektor aufgestellt werden. Auch sollen das Reaktionsgemisch und der Extrakt so schnell wie möglich miteinander vermischt werden. Das biolumineszente Ansprechen auf ATP wird durch Messen der maximalen Intensität des emittierten Lichtes bestimmt, die, nachdem sie ihren maximalen Wert

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erreicht hat, logarithmisch abfällt. Wenn alle anderen Faktoren konstant bleiben, ist die maximale Intensität direkt proportional der Konzentration an ATP.

Die zur quantitativen Messung der Biolumineszenz geeignete Vorrichtung kann aus einem Sekundärelektronenvervielfacher zur Umwandlung der Lichtenergie in ein elektrischeF Signal, einer Vorrichtung zur Bestimmung der Größe des Signales und einer Dunkelkammer bestehen, in der die Biolumineszenzreaktion dem Sekundärelektronenvervielfacher dargeboten wird.

In einer Ausführungsform besteht ein Teil der Gerätegruppe aus einer kombinierten Abtast- und Reaktionskammer, die einen Sekundärelektronenvervielfacher enthält, aus einer entsprechenden Schaltung, sowie einem drehbaren Zylinder, der derart in einem Aluminiumblock montiert ist, daß die Reaktionskammer entfernt werden kann, ohne den Vervielfältiger dem Licht auszusetzen. Ein Teil der Zylinderwand ist ausgeschnitten, um eine Cuvette in einem geeigneten Reflektor unterzubringen. Unmittelbar über dem Guvettenhalter ist eine kleine Injektionsöffnung, die durch einen herausnehmbaren, lichtabschließenden Gummistopfen verschlossen wird. Der gesamte Apparatesatz ist schwarz angestrichen, um die Lichtrefexion zu vermindern. Der Elektronenvervielfacher

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wandelt die Lichtenergie in ein elektrisches Signal um. Ein Oszilloskop, der die Größe des Signals aus dem Elektronenvervielfacher aufzeichnet, ist mit einer justierbaren, vertikalen Ablenkungsskala versehen, die eine Justierung des Abtastvermögens des ganzen Systems ermöglicht.

Am Eingang des Oszilloskopen befindet sich eine Mehrfachschaltvorrichtung, mit deren Hilfe das System in einfacher Weise auf O und auf Ausgleich eingestellt werden kann. Der differentielle Eingang des Oszilloskopen ist ein Mittel, um den von dem Elektronenverstärker ausgehenden Dunkelstrom auszugleichen. Die auf dem Schirm des Oszilloskopen dargestellte Ansprechbarkeit auf das Leuchtsystem der Peuerfliege wird mit einer Kamera aufgenommen, die unmittelbar auf der Vorderseite des Oszilloskopen montiert ist. Um die Reaktion zu beobachten und aufzuzeichnen, wird die die erforderlichen Reagentien enthaltende Cuvette in dem Cuvettenhalter angebracht, ohne den Elektronenverstärker zu exponieren. Durch Drehen der Trägervorrichtung wird die Cuvette gegenüber dem Elektronenverstärker aufgestellt. Der vermutlich ATP enthaltende Extrakt wird darauf durch die Injektionsöffnung zugegeben und das Ausmaß der Reaktion, wenn eine solche stattfindet, durch die Kamera aufgenommen.

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Zur Durchführung quantitativer ATP-BeStimmungen kann das zum Messen der Lichtreaktion verwendete Instrument unter Verwendung bekannter ATP-Konzentrationen kalibriert werden. Eine Kalibrierung kann aufgezeichnet werden, indem mit Hilfe einer Injektionsnadel l/looo cnr Portionen bekannter Konzentration an ATP durch die lichtabschließende Dichtung in die Cuvette eingebracht werden. Die Lichtantwort wird gegen die ATP Konzentration aufgetragen und eine lineare Funktion erhalten.

Für experimentelle Zwecke wurden 13 Bakterienarten, wie sie in verunreinigten Umgebungen häufig angetroffen werden, gezüchtet und gemäß der erfindungsgemäßen Arbeitsweise Proben zur Analyse entnommen. Folgendes Verfahren wurde bei jeder Bakterienkultur angewandt:

1. Ein 2 cnr Aliquot jeder Probe wurde durch eine mikroporöse Bakterienmembrane filtriert;

2. die auf der Membrane zurückgehaltenen Bakterienzellen wurden mit 2 cnr eines sterilen kalten o,o2 m ASO^Puffers gewaschen;

3. die gewaschenen Bakterienzellen wurden mit einem kalten Gemisch von 1 cnr o,o2 m ASO^Puffer und 5 cnr n-Butanol extrahiert;

*k das Volumen der wässrigen Phase wurde aufgezeichnet; 5. eine o,ol cnr Probe der wässrigen Phase wurde in eine ein Reaktionsgemisch enthaltende Reaktionskammer injiziert;

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6. ale Gesamtmenge an intracellularer ATP wurde aus dem infolge der Reaktion emittierten Licht berechnet;

7. die Gesamtanzahl Zellen in einem anderen Aliquot derselben Kultur wurde durch Plattenauszählen, korrigiert mit Bezug auf Zellenzusammenklumpen, bestimmt und schließlich

8. die Gesamtmenge ATP je Probe in Mikrogramm dividiert durch die Gesamtanzahl Zellen je gleich große Probe, um den Wert ATP/Zelle für die Bakterienkultur zu erhalten.

Das Reaktionsgemisch wurde hergestellt, indem 2o mg Luciferase, gelöst in 2 cnr kaltem sterilem Wasser mit 1,2 mg Luciferin, gelöst in 2 cm-⁷ kaltem o,o2 m ASO^f Puffer (pH-Wert 7,^) vermischt und 2 cm-³ o,ol m MgSO^ Lösung zugesetzt wurde.

Die erhaltenen Daten zeigten, daß eine sehr hohe Korrelation zwischen dem ATP Spiegel in einer Probe und der Zahl der Bakterienzellen der vorhandenen Arten besteht. Völlig unerwartet war die wichtige Entdeckung, daß der intracellulare ATP-Gehalt relativ konstant blieb, unabhängig von der Art der Bakterien oder ihrer Wachstumsphase .

Ein von einem Elektronenrechner ausgedrucktes Ergebnis dieser Daten ist in der beigefügten Zeichnung wieder-

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gegeben. Jede Zahl aus diesem Ausdruck zeigt die Zahl von Datenpunkten an, die diese Stellung einnehmen. Durch anschließende Berechnung wurde festgestellt, daß die statistische Korrelation zwischen log ATP und log Bakterienzellen o,92o4 betrug. Über die 13 Arten wurde ein Mittelwert von etwa 5 x Io °/Ug ATP/Zelle beobachtet. Jede der Arten wird nachstehend aufgeführt mit ihrem entsprechenden berechneten Wert für intercellulare ATP. Es sei darauf hingewiesen, daß jeder ATP Wert innerhalb einer ί 2-fachen Variation des Mittelwertes liegt.

/Ug ATP χ lo*"¹⁰/Zelle

Lactobacillus caseii	3,1
Pseudomonas fluorescens	3,9
Staphylococcus albus	3,1
Sarcina subflava	lo,3
Sarcina lutea	2,2
Bacillus cereus	6,4
Bacillus subtilis	9,9
Alkaligenes viscolactea	.3,0
Escherichia coli	M
Aerobacter aerogenes	2,4
Micrococcus flavus	4,5
Proteus vulgaris	3,ο
Streptococcus faecalis	4,9

Um die Anwendbarkeit dieses Verfahrens auf andere Bakterien als solche, die in reinen Kulturen existieren, zu prüfen, wurde das erfindungsgeraaße Verfahren mit dem

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bekannten Verfahren der Agarplattenzählweise verglichen. Zur Erläuterung sei ein typisches Protokoll für eine Bakteriuria Untersuchung wiedergegeben:

1. Io cnr einer kalten Urinprobe wurde bei 225 χ g

Q. ooo Upm bei Radius 133,5 mm (5 1/4 inch)J 5 min zentrifugiert;

2. 2 cnr der überstehenden Flüssigkeit wurden durch eine mikroporöse Bakterienmembrane filtriert;

3. die auf dem Membranfilter zurückgehaltenen Bakterienzellen wurden mit 2 cnr steriler kalter Salzlösung gewaschen;

4. die gewaschenen Bakterienzellen wurden mit einem kalten Gemisch von 1 cnr o,o2 m ASO^Puffer und 5 cnr n-Butanol extrahiert;

5. das Volumen der wässrigen Phase wurde aufgezeichnet;

6. eine o,ol cnr Probe der wässrigen Phase wurde in eine das Reaktionsgemisch gemäß Beispiel 1 enthaltende Reaktionskammer injiziert;

7. die Gesamtmenge extrahierte ATP wurde aus dem Gang des durch die Reaktion emittierten Lichtes berechnet und schließlich wurde

8. die Anzahl der Bakterienzellen mit Hilfe der Formel

X = Υ/5 χ Io ° berechnet, wobei X die Zahl der Bakterienzellen und Y die Menge extrahierter ATP, gemessen in ist.

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Die folgende Tabelle ist ein statistischer Vergleich von Bakterienauszählungen, wie sie aus verschiedenen Um-' weltproben durch dieses Versuchsprotokoll und auf die bekannte Weise der Agarplattenauszählung erhalten wurden.

Korrelations- Standard- I^ ,68 % 2 & ,95 % η verhältnis abweichung Vertrauens- Vertrauens-

3 bereich bereich

Urin Kolloidale Kieselerde "Ludox"	9ö	O.923
Wasser	12	0,987
Nahrungs mittel	13	I,o37
Milch Brennstoff	2o 12	1,2*1-8
reine Kulturen		I,oo9
Korrelations verhältnis	Verhält

0,069

0,1*12

o',13
0,068

l,2o-l,3o
0,82-1,08

o,97-l,25

o,198 o,72-l,12 o,52-l,32 0,072 0,92-1,06 0,85-1,13

o,99-l,l8 o,77-l,3o

1,15-1,35 0,69-1,21

i-l, 08 o,87-l,:

= Verhältnis von instrumenteller ATP Bakterienauszählung zu Agarplattenauszählung von Bakterienproben

= Anzahl der zur Bestimmung des Korrelationsverhältnisses durchgeführten Versuche.

Es wurde festgestellt, daß die unter Anwendung der vorliegenden Erfindung erhaltenen Bakterienauszählungen gültiger sind, als die durch die traditionelle Plattenmethode erhaltenen Auszählungen. Ein weiterer Vorteil der ATP Auszählung außer der Einfachheit und Geschwindigkeit des Meßvorganges liegt darin, daß keine Fehler infolge des Zusammenklumpens der Bakterienze11en oder der Beweglichkeit einiger Bakterienarten auftreten; diese

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beiden Paktoren können das bekannte Plattenauszählverfahren stark beeinflussen. Mit Hilfe der durch das erfindungsgemäße Verfahren ermöglichten instrumenteilen
Auszählung werden tatsächlich die einzelnen Bakterien
ausgezählt,und es kann sogar eine so geringe Anzahl wie 1 ob ο Organismen in weniger als 5 min bestimmt werden.

Selbstverständlich können die einzelnen Maßnahmen, Stoffe, Verfahrensstufen und ihre Reihenfolge usw.,
wie sie vorstehend zur Erläuterung der Erfindung näher beschrieben werden, in verschiedenster Weise abgewandelt werden, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.

Patentansprüche

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Claims

9O

TKLEFOK 82 0651 TELSOHAMMADBKSSE: PROTEOTPATENT MÜXCHBN

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Patentansprüche

Verfahren zur Bestimmung der Populationsdichte von Bakterienzellen in oder auf einem beliebigen Medium, dadurch gekennzeichnet , daß man eine abgemessene Probe in eine wässrige Suspension bringt, daraus alle Nichtbakterienzellen in üblicher Weise abtrennt, worauf man unter Entfernen alles extracellularen wasserlöslichen Materials die Bakterienzellen isoliert, aus diesen das Adenosintriphosphat extrahiert und die Menge an extrahiertem Adenosintriphosphat bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man die Suspension zur Abtrennung der Nichtbakterienzellen zentrifugiert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man mit einer solchen Kraft zentrifugiert, daß man ein Zentrifugat mit einer unteren, praktisch bakterienzellenfreien Schicht und einer oberen bakterienzellenhaltigen Schicht erhält.

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4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3» dadurch gekennzeichnet , daß man mit einer Kraft von etwa 15o χ g bis etwa 25ο χ g zentrifugiert.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man die Suspension zur Abtrennung aller Bakterienzellen durch ein Bakterienmembranfilter leitet.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man zur quantitativen Adenosintriphosphat-BeStimmung das extrahierte Adenosintriphosphat mit Luciferin und Luciferase umsetzt und das emittierte Licht mißt.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man die Anzahl der Bakterienzellen in der Probe durch die Formel X = Y/5 x lo" ermittelt, wobei X die Zahl der Bakterienzellen und Y die Menge des extrahierten Adenosintriphosphates in ist.

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