DE1698629B1 - Verfahren zur differenzierung des ursprungsgewebes von in einer koerperfluessigkeit enthaltenen lactat-dehydrogenase - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Differenzierung des Ursprungsgewebes von in einer Körperflüssigkeit enthaltener Lactat-Dehydrogenase.

Lactat-Dehydrogenase ist ein in den meisten Säugetiergeweben vorkommendes Enzym, das die Umwandlung von L-Milchsäure zu Brenztraubensäure in Gegenwart von Nicotinamidadenindinucleotid katalysiert. Diese letztgenannte Verbindung kennt man auch früher unter den Namen »Co-Enzyml«, »Co-Zymase« oder Diphosphopyridinnucleotid und soll der Einfachheit halber nachstehend als NAD und, falls sie in reduzierter Form vorliegt, als NADH₂ bezeichnet werden. Man kann diese Umwandlungsreaktion durch die Gleichung

L(+)-Milchsäure + NAD =£= Brenztraubensäure + NADH₂

darstellen. Bekanntlich besteht dieses Enzym aus fünf verschiedenen Untereinheiten oderlso-Enzymen, deren Mengenverhältnis ausgeprägt je nach dem Ursprungsgewebe variieren. Die einzelnen Iso-Enzyme lassen sich durch ihre elektrophoretische Mobilität identifizieren. So besitzt beispielsweise aus Herzmuskelgewebe isolierte Lactat-Dehydrogenase, obwohl sie die gleiche Umwandlung katalysiert, ein anderes Iso-Enzymmuster als solche aus Skelettmuskelgewebe. Während bei einem gesunden Menschen diese Iso-Enzyme überwiegend im Gewebe festgehalten werden, findet man sie bei anormalem, krebsbildendem Gewebewachstum oder bei Leukämie oder sonstigen Krankheiten, wie beispielsweise Myokardinfarkten und Hepatitis, in merklicher Konzentration im Serum. Man glaubt annehmen zu können, daß der Enzymübergang aus einem anormalen Ursprungsgewebe im Serum vielleicht auf übermäßige Enzymproduktion in ersterem oder auf Änderungen der Permeabilität solcher anormaler Zellen und dadurch bedingten Enzymaustritt in extrazelluläre Flüssigkeit und weiterhin in den allgemeinen Kreislauf zurückzuführen ist. Folglich liefert die Bestimmung des Lactat-Dehydrogenasespiegels im Serum dem Kliniker wertvolle Information für die Diagnose verschiedenerKrankheiten. Infolge der Schwierigkeit jedoch, das Ursprungsgewebe des Enzyms mit Sicherheit genau auszumachen, verliert die Differentialdiagnose von Krankheiten, die eine Erhöhung des Lactat-Dehydrogenasespiegels im Serum hervorrufen, viel an Wert.

So berichten z.B. Vessel et al. in den Ann. New York Acad. Sc, 75 (1958), S. 286 bis 291, daß sie das Problem des Serum-Lactat-Dehydrogenaseursprungs mit elektrophoretischen Methoden studiert haben. Sie zeigen, daß mindestens vier bestimmte Serumfraktionen Lactat-Dehydrogenase-Aktivität zeigen. Die Bemühungen, auch noch das Ursprungsgewebe dieser verschiedenen Iso-Enzyme zu identifizieren, beruhten im allgemeinen auf der Anwendung von Gelelektrophorese mit anschließender Anfärbung der Iso-Enzyme nach histochemischen Verfahren oder Elution, wie sie beispielsweise von Yakulis in »The American Journal of Clinical Pathology«, Bd. 38, Nr. 4, S. 378 bis 382, beschrieben wird. Hierbei handelt es sich aber um ein langes und zeitraubendes Verfahren, das sich nicht für klinische Routineuntersuchungen oder in kleinen Kliniken oder klinischen Laboratorien mit nur wenig geschultem Personal eignet.

Aus den vorstehenden Darlegungen ergibt sich die Aufgabe, eine einfache und trotzdem genaue Methode zur Identifizierung des Ursprungsgewebes von Serum-Lactat-Dehydrogenase zu schaffen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man die Enzymaktivität in einem Substrat mit etwa 0,5- bis 2molarer L(+)-Lactat-Konzentration mißt und die so erhaltene Aktivität mit der Aktivität vergleicht, die vom Enzym in einem zweiten Substrat mit etwa 0,05- bis 0,002molarer L(+)-Lactat-Konzentration entwickelt wird.

Das Verfahren nach der Erfindung fußt auf der Entdeckung, daß die Aktivität der einzelnen in der Lactat-Dehydrogenase enthaltenen Iso-Enzyme in Abhängigkeit von der Lactat-Konzentration im Substrat ausgeprägt unterschiedlich stark ist. So besitzt beispielsweise Lactat-Dehyrogenase aus Herzmuskelgewebe ihre Höchstaktivität bei etwa 0,01- bis 0,2molarer L(+)-Lactat-Konzentration im Substrat, während solche aus Lebergewebe bei etwa 0,05- bis 0,5molarer l(+^Lactat-Konzentration maximal aktiv ist.

Diese verschiedenen Aktivitätsbereiche und die jeweiligen Konzentrationen bei maximaler Aktivität

sind aus den Aktivitätskurven ersichtlich. Man erhielt sie in der Weise, daß man die optische Absorption bei 530 ΐημ gegen ein Substrat mit Lactat-Konzentrationen zwischen 0,002- und l,0molar aufzeichnete. Die entsprechenden Proben beschaffte man durch Extraktion von Menschenherz, -leber oder -skelettmuskel bei der Autopsie mittels wäßrigen Lösungsmittels, da das Enzym am Ursprungsort am reichsten vorhanden ist. Die gewonnenen Extrakte wurden Blutansammlungsserum zugegeben und mit dem Lactat inkubiert. So bezieht sich also die mit »Serum & Herz« bezeichnete Kurve auf einen Herzextrakt, dem man Blutansammlungsserum zugesetzt hat, und die optischen Dichten, die mit verschiedenen Konzentrationen des Lactatsubstrats erhalten wurden. Andererseits besieht sich die »Serum«-Kurve auf Blutansammlungsserum ohne irgendwelche Extraktzusätze und dient zur Kontrolle.

Aus den Kurven sieht man nun deutlich, daß die Lactat-Dehydrogenase aus z. B. Herzmuskel in einem Substrat mit 0,05molarer L(+)-Lactat-Konzentration und diejenige aus Leber in einem Substrat von 0,20molarer L(+)-Lactat-Konzentration ihr Aktivitätsmaximum besitzen. Aus den Kurven erkennt man außerdem, daß Serum-Lactat-Dehydrogenase aus Herzmuskel bei sehr niedrigen Lactat-Konzentrationen viel stärker aktiv als solche aus Leber ist, dagegen bei hohen Laxtat-Konzentrationen stärker gehemmt ist. Lactat-Dehydrogenase aus Skelettmuskel liefert eine Aktivitätskurve, die insbesondere im Gebiet niedrigerer und höherer L(+)-Lactat-Konzentrationen der Leberkurve ähnlich ist. Daraus ergibt sich die Anregung, mit Hilfe von Serum-Lactat-Dehydrogenase-Bestimmungen eine Differentialdiagnose zu entwickeln, um festzustellen, ob sie aus dem Herzen, der Leber oder der Skelettmuskulatur stammt. Wenn man also bei einem Patienten einen erhöhten Serum-Lactat-Dehydrogenasespiegel feststellt, kann man diese wichtige Information dadurch erlangen, daß man die Lactat-Dehydrogenase-Aktivität in Gegenwart einer hohen L(+)-Lactat-Konzentration zu der in Gegenwart einer niedrigen Lactat-Konzentration ins Verhältnis setzt.

Wenn also der Fall eintritt, daß eine solche Differentialbestimmung in erfindungsgemäßer Art durchgeführt werden soll, dann inkubiert man 0,05 bis 0,2 ml vom Serum oder einer sonstigen Körperflüssigkeit, z. B. dem Liquor, des betreffenden Patienten bei 37° mit einer Lösung, die 0,2molares L(+)-Lactat, einen Puffer, wie Tris-hydroxymethylaminoäthan, um den pH-Wert des Substrats auf etwa 8 bis 9 zu halten, etwas Nicotinamidadenindinucleotid, einen geeigneten chromogenen Elektronenakzeptor, wie Jodnitrotetrazoliumchlorid (INT) oder Nitrotetrazoliumblau, als Indikator und einen Elektronenzwischenträger, wie Phenazinmethosulfat, enthält. Der Indikator existiert in oxydiertem Zustand in farbloser Form und wird durch Reduktion farbig, bei INT also beispielsweise rot. Nach 5 Minuten langer Inkubation bei 37° C stoppt man die Reaktion durch Zugabe von Säure, z. B. 0,lnormaler wäßriger Salzsäure, ab und mißt dann in einem geeigneten Kolorimeter die optische Dichte bei 530 πΐμ. Die Dichte der entstandenen Färbung ist dabei der in den untersuchten Körperflüssigkeiten enthaltenen Lactat-Dehydrogenase proportional. Die so erhaltene optische Dichte wird dann mit der einer Kontrollprobe verglichen.

Diese Kontrolle selbst stellt man in der Weise her, daß man eine Kontrollprobe der untersuchten Körperflüssigkeit mit Kalium- oder sonstwie geeignetem Oxalat an Stelle des Lactats und Dinatriumäthylendiamintetraessigsäure (EDTA) inkubiert. Dabei hemmt das Oxalat jegliche Lactat-Dehydrogenase-Aktivität, und die EDTA verhindert ein Ausfallen irgendwelchen Calciumoxalats, so daß eine Kontrollprobe mit sämtlichen Bestandteilen außer der Enzymaktivität zum optischen Vergleich zur Verfugung steht. Falls der Dichtenvergleich mit der Kontrollprobe das Vorhandensein eines überhöhten Lactat-Dehydrogenasespiegels anzeigt, wiederholt man die ganze Untersuchung in gleicher Art, aber mit zwei Parallelproben, von denen die eine eine hohe, z. B. l,0molare, und die andere eine niedrigere, z. B. 0,01molare, Lactat-Konzentration im Substrat aufweist. Nach der Inkubation werden die optischen Dichten der beiden Proben gemessen. Da, wie früher ausgeführt, das Enzym je nach seinem Ursprung unterschiedliche Substrataktivitätsmaxima aufweist, kann man aus dem Vergleich der beiden Dichtenwerte leicht den Enzymursprung feststellen.

Häufig ist es vorteilhaft, die Meßfärbung des Substrats durch Zugabe einer oberflächenaktiven Substanz, wie etwa 0,005 bis 0,5 Gewichtsprozent PoIyäthylenglykol-Sorbitanoleat, Albumin oder äthoxylierten Fettalkoholen, zu fixieren.

Bei der vorstehend geschilderten Arbeitsweise kann man als L(+)-Lactat Natrium-, Kalium-, Calcium- oder dergleichen Lactat verwenden. Falls das Substrat aus einem razemischen Gemisch aus dl-Lactat besteht, arbeitet man mit 0,2 n-Lösung.

Das nachstehende Beispiel erläutert noch weitergehend dies erfindungsgemäße Diagnoseverfahren.

Beispiel

Die verschiedenen Reagenzien, die bei der Bestimmung des Ursprungsgewebes von Lactat-Dehydrogenase benutzt werden, stellt man folgendermaßen her:

1. Das Farbreagens gewinnt man in der Weise, daß man notfalls unter auflösungserleichterndem Umrühren 50 mg INT in etwa 15 ml Wasser auflöst und die Lösung nach weiterer Zugabe von 125 mg NAD und 12,5 mg Phenazinmethosulfat im Meßkolben mit Wasser auf 25 ml auffüllt. Das Reagens muß wegen seiner Lichtempfindlichkeit ständig vor Licht geschützt werden, um seine Zersetzung zu vermeiden.

2. Das Pufferreagens stellt man so her, daß man 1,0 g äthoxylierten Oleylalkohol unter Erhitzen auf 95° C in 10 ml Wasser löst, die Lösung mit Wasser auf etwa 50 ml verdünnt, mit 12,1 g Trishydroxymethylaminomethan versetzt, den pH-Wert mit 3n-HCl auf 8,2 einstellt und schließlich durch weitere Wasserzugabe auf ein Endvolumen von 100 ml auffüllt.

3. Das Lactatsubstrat wird in der Weise auf eine l,lmolare Endkonzentration eingestellt, daß man 12 g Lösung von 5,0 ml einer 20%igen Milchsäurelösung in etwa 50 ml Wasser auflöst. Diese Lösung stellt man mit 1 n-Natronlauge auf einen pH-Wert von 5,5 ein und verdünnt sie mit Wasser auf 120 ml. Das Substrat wird unter Kühlung in Gegenwart einiger Tropfen Chloroform aufbewahrt.

4. Das Kontrollreagens wird in der Weise hergestellt, daß man 0,2 g Kaliumoxalat und 0,2 g Äthylendiamintetraessigsäuredinatriumdihydrat
in 100 ml Wasser auflöst.

Die Bestimmung der Enzymkonzentration geschieht in folgender Weise:

Testmethode

Man pipettiert je 0,1 ml Serum oder sonstige Körperflüssigkeit des Patienten in zwei Versuchsgläser, die je 0,2 ml Pufferreagens enthalten. In das eine Glas gibt man 0,5 ml Substrat und in das andere 0,5 ml Kontrollreagens. Nach sorgfältigem Durchschütteln werden beide Gläser bei 37° C inkubiert. Nach genau festgelegtem Zeitintervall werden je 0,2 ml Farbreagens zugesetzt und die Inkubation weitere 5 Minuten lang bei 37° C fortgesetzt. Anschließend gibt man 5 ml 0,1 n-HCl zu, schüttelt kräftig durch und stellt dann die Absorptionsunterschiede zwischen Kontrollprobe und Patientenserumsprobe fest. Durch Vergleich mit der Standardkurve bestimmt man die Bezugsnormalen mit gleichem Lactat-Dehydrogenasegehalt wie das Patientenserum und dessen Lactat-Dehydrogenase-Aktivität. Erfahrungsgemäß besteht lineare Proportionalität zwischen der vom Serum erzeugten Färbung und der Enzymkonzentration.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Differenzierung des Ursprungsgewebes von in einer Körperflüssigkeit enthaltener Lactat-Dehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, daß man die Enzymaktivität in einem Substrat mit etwa 0,5- bis 2molarer L(+)-Lactat-Konzentration mißt und die so erhaltene Aktivität mit der Aktivität vergleicht, die vom Enzym in einem zweiten Substrat mit etwa 0,05- bis 0,002molarer L(+)-Lactat-Konzentration entwickelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gegekennzeichnet, daß man ein erstes Substrat mit etwa lmolarer und ein zweites Substrat mit etwa 0,01molarer L(+)-Lactat-Konzentration verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Substrate verwendet, die einen pH-Wert von 8 bis 9 aufweisen und je geringe Mengen von Nicotinamidadenindinucleotid, eines chromogenen Elektronenakzeptors, eines Elektronenzwischenträgers und einer oberflächenaktiven Substanz enthalten, und daß man die optischen Dichten der beiden Substrate miteinander vergleicht.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktive Substanz Eialbumin, Polyäthylenglykol-Sorbitanoleat oder äthoxylierten Alkohol verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Elektronenzwischenträger Phenazinmethosulfat verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als chromogenen Elektronenakzeptor Iodnitrotetrazoliumchlorid oder Nitrotetrazoliumblau verwendet.