DE1940816B2

DE1940816B2 - Verfahren und diagnostisches mittel zur enzymatischen be stimmung von glucose

Info

Publication number: DE1940816B2
Application number: DE19691940816
Authority: DE
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1969-08-11
Filing date: 1969-08-11
Publication date: 1972-01-05
Also published as: US3778350A; CH534357A; NL168049B; IL35072A; SE361362B; JPS544280B1; NL7011769A; FR2056563A5; HU162212B; DE1940816C3; IL35072A0; GB1276230A; IT961363B; DE1940816A1; NL168049C; ZA705481B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Glucose, bei dem man in gepufferter Lösung die Glucose mittels Adenosintriphosphat und Hexokinasc in Glucose-6-phosphat überführt, dieses mittels Nicotinamid-aclenin-dinucleotidphosphat in Gegenwart von Gliicose-6-phosphatdehyclrogenase zu Glucona' o-phosphat unter Bildung von reduziertem Nicotifiamid-adenin-dinucleotidphosphfll oxydiert und letzleres spektrophotometrisch bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man der gepufferten Lösung ein Azid zusetzt.

Nach einem bekannten Verfahren kann in., η Glucose enzymatisch bestimmen, indem man m-j mittels Adenosintriphosphat und Hexokinase in Glucose-6-phosphat überführt. Das entstehende Gh:- cose-6-phosphat wird mittels Nicotinamid-adenindicnucleotidphosphat (NADP) in Gegenwart von Glucose-d-phosphatdehydrogenase (G-6-PDH) in GIu-

iQ conat-6-phosphat überführt. Dabei entsteht eine dein Glucose-6-phosphat äquivalente Menge an reduziertem Nicotinamid - adenin - dinucleotidphosphat (NADPH). Letzteres kann sehr leicht ohotometrisch bestimmt werden. Dieses Verfahren ist sehr zuverlässig, spezifisch und praktisch wenig störanfällig und bewährte sich besonders bei der Bestimmung von Glucose in biologischen Flüssigkeiten sowie in. Lebensmitteln. Ein Nachteil des Verfahrens liegt jedoch darin, daß die Lösungen der Einzelreagenzien

Puffer, ATP. NADP sowie Magnesiumsulfat einzeln pipettiert werden müssen, weil Lösungen von ATP in den bisher verwendeten Mischungen von Triäthanolamin-hydrochlorid, Natronlauge und Magnesiumsulfat nicht stabil sind und nach einiger Zeit starke Trübungen aufweisen.

Es wurde nun gefunden, daß man ATP, Triäthanolaminhydrochlorid, Natronlauge und Magnesiumsulfat gemeinsam in Lösung halten kann, wenn man der Lösung ein Azid zusetzt. Eine Trübung tritt dann nicht auf.

Das bekannte Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Glucose kann somit erfindungsgemäß dadurch verbessert werden, daß man der gepufferten Lösung ein Azid zusetzt. Vorzugsweise besteht der Puffer aus einer Mischung von Triäthanolamin-hydrochlorid. Natriumhydroxyd bzw. Natriumcarbonat und Natriumazid.

Durch das erfindimgsgemäße Verfahren wird es möglich, die für die Reaktion benötigten Reagenzien — außer den Enzymen und NADP — zusammen in Lösung zu bringen und in dieser Form einzusetzen. Lösungen, die ATP. Magnesiumsulfat. NaOH bzw. Na₂CO₃. Triäthanolaminhydrochlorid und Natriumazid enthalten, weisen auch nach /jber 3monatiger Lagerung bei 33 C noch keine Trübung sowie keinen Abfa'l des ATP-Gehaltes auf. während die bisher üblichen Lösungen, die kein Natriumazid enthalten, im Höchstfall nur bis zu 14 Tagen im Kühlschrank gelagert werden können. Bei längerem Lagern dieser bekannten Lösungen nimmt die Konzentration an ATP so stark ab. daß bei Verwendung derarliger Präparate fehlerhafte Resultate erhalten werden.

Die durch die Erfindung ermöglichten neuen Reaktionsgemische können auch in fester Form als

ss homogene Pulvergemische in luft- und feuchtigkeitsdicht verschlossenen Flaschen bei Raumtemperatur gelagert werden, so daß man sie in dieser Form verschicken kann. Überraschenderweise stört das Azid auch die enzymatischen Reaktionen nicht.

Häufig ist es günstig, beim erfindungsgemäßen Verfahren auch einen oberflächenaktiven Stoff zuzusetzen, vorzugsweise Digitonin oder «in Äthylenoxydaddukt. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein diagnostisches Mittel zum enzymatischen Nachweis von Glucose, bestellend aus Heaokinase und Glucose· 6-phosphatdehydrog'?nase sowiie Adenosintriphosphat, Magnesiumsulfat, Nicotinamid-adenin-dinticleotidphosphat und einem Puffer, der ein Azid enthüll·

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Vorzugsweise sind bei dem erlindiingsgemäßen diagnostischen Mittel Adenosintriphosphat, Magnesiumsulfat. Nicotinamid-adenin-dinucleüiidphosphat, PuI'-lerr,ubstanz. Digitonin und Azid als homogenes Pulvergemisch abgepackt, während die Enzyme Hexo-Ivinase und Glucose-d-phosphatdehydrogenase gehindert in Form einer Suspension in Ammonium-Milfatlösung vorliegen. Die Puffersubstanz besteht hierbei günstig aus Triäthanolamin-hydrochlorid und Natriumhydroxyd bzw. Natriumcarbonat, wobei in iu diesem Falle das Azid als Natriumsalz vorliegt. Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen diagnostischen Mittels liegen Adenosintriphosphat. Magnesiumsulfat, das Puffergemisch Digitonin und Azid in Form einer wäßrigen Lösung, Nicotinamidadcnin-dinucleotidphosphat in fester Form iz. B. als Tablette verpreßt) und die Enzyme Hexokinase und Cilucoie-o-phosphatdehydrogenase wiederum gesondert als Suspension in Ammoniumsulfatlösung vor.

Zur Durchführung der Glucosebestimmung mit jo dem erfindungsgemäßen diagnostischen Mittel wird dieses, falls es in Form eines Pulvergemisches vorliegt, \or Gebrauch einfach in der entsprechenden Menge destilliertem Wasser gelöst, wobei die unverbrauchte Menge gewünschtenfalls wochenlang ohne Qualitätseinbüße im Kühlschrank aufbewahrt werden kann. Anschließend wird in üblicher Weise die glucosehaltige Probe (z. B. Vr llblut) zugesetzt und die Extinktion bestimmt, worauf man das Enzymgemisch Hexokinase/Glucose-6-phosphatdehyurogenase zufügt und erneut die Extinktion mißt. Dl·- Enzymsuspension ist ohne besondere Vorsichtsmaßnahmen, insbesondere bei kühler Lagerung, ebenfalls jahrelang haltbar. Das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße diagnostische Mittel ermöglichen damit eine äußerst einfache Handhabung des Glucosebestimiiiiingsverfahrens und beseitigen die Notwendigkeit, für jede einzelne Bestimmung zahlreiche Einzelreagenzien zu pipettieren und laufend neue Lösungen anzusetzen. ₊₀

Die durch die Erfindung erzielte überlegene Stabilität von Adenosintriphosphat in wäßriger Lösung geht aus den nachstehend beschriebenen Vergleichsvcrsuchen hervor. Hierbei wurde eine wäßrige Lösung des erfindungsgemäßen diagnostischen Mittels, welche +5 Adenosintriphosphat als Dinatriumsalz. Magnesiumsulfat. Triäthanolamin-hydrochlorid, Natriumcarbonat. Digitonin und Natriumazid enthielt, mit einer in gleicher Weise zusammengesetzten Lösung verglichen, die kein Natriumazid enthielt. Hierbei wurden folgende Ergebnisse erhalten:

	Konzentration	mg, ml	Abnahme	der ATP*-	ohne
Zeil	ΛΤΡ* ir	ohne	Konzentration in " „	Azid
	mit	Azid	mit
	A/id	0,450	Azid	0
Beginn	0.425	0,450		-62
nach 10 Tagen	0,425	0,170	0	-91
nach 20 Tagen	0.420	0.040	— 1 2	-100
nach 50 Tagen	0,418	0,000	-L6
nach 90 Tagen	0,390	-8

* Adenosintriphosphat.

Die Werte der obigen Tabelle zeigen die ausgeprägte Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. diagnostischen Mittels.

Durch die Erfindung wird es möglich, die Glueosebestimmung auf höchst einfache Weise durchzuführen. Das bisher erforderliche häufige Pipettieren und ständige Neuansetzen von Einzellösungen wird damit überflüssig. Gleichzeitig können die Reagenzien nunmehr voll aufgebraucht werden, was einer Verminderung des Reagenzienbedarfes entspricht.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Folgende Komponenten werden zu einem homogenen Pulver vermischt:

11,0 g Triäthanolamin-hydrochlorid.
3,5 g Natriumcarbonat,
0,2 g Magnesiumsulfat-heptahy'rat,
0,1 g Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat,
0,1 g Adenosinö'-triphosphat. Dinatriumsalz,

Trihydrat,
0,3 g Natriumazid,
0,02 g Digitonin.

Je 150 mg dieses Gemisches werden in luftdicht verschließbare Frischen eingewogen. Der Inhalt der Flaschen wirci vor dem Gebrauch durch Zugabe von 2,0 m! Wasser unter kurzem Umschütteln in Lösung gebracht und mit 0,005 bis 0,2 ml der zu untersuchenden Probe (Harn. Blut, Serum usw.) versetzt. Die Extinktion E₀ wird bei 366 bzw. 3 ',0 nm mit einem geeigneten Photometer gemessen. Danach gibt man 1 Tropfen einer Enzymgemischsuspension zu, die etwa 150 Einheiten Hexokinase und 75 Einheiten Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase pro Milliliter 3molarer Ammoniumsulfatlösung enthält.

Man wartet etwa 5 bis 10 Minuten, bis sich ein konstanter Extinktionswert E_x eingestellt hat. Die Extinktionsdifferenz .1 E = E₁ — E₀ wird mit einem Berechnungsfaktor multipliziert und ergibt unmittelbar die Konzentration an Glucose in der Probe.

Die unverbrauchte Lösung ist monatelang haltbar und kann jederzeit ohne Änderung im Verfahrensgang wieder verwendet werden.

Durch die Verwendung der digitoninhaltigen Reagenzlösung ist es möglich. Blut direkt in den Testansatz einzusetzen, ohne eine vorhergehende Enteiweißung bzw. Entfernung der die optische Messung störenden roten Blutkörperchen durchzuführen. In diesem Fall ist eine Blutmenge von nur 0.005 bis 0.01 ml erforderlich.

Beispiel 2

2.5 ml einer Lösung, enthaltend:
0.140 g Triäthanolamin-hydrochlorid.
0.020 g Adenosin-5'-triphosphat.
0.003 g Magnesiumsulfat-heptahydrat.
0,016 g Natriumcarbonat,
0.0025 g Natriumazid,
0,00025 g Digitonin,

werden in eine Meßküvette pipettiert, eine NADP-Tablette wird darin gelöst und 0,01 ml Vollblut zugegeben. Die durch das vorhandene Digitonin bewirkte Haemolyse ist praktisch sofort beendet. Dann wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, Extinktion E₀ abgelesen und die Reaktion mit dem Enzymgemisch wie im Beispiel 1 gestartet. Messung und Auswertung erfolgen wie im Beispiel 1.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur cr.zsnuttischen Bestimmung von Glucose, bei dem man in gepufferter Lösung die Glucose mittels Adenosiiitriphosphat und Hexokinase in Glucose-6-phosphat überführt, dieses mittels Nicotinainid-adenin-dinucleotidphobphat in Gegenwart von GIucose-6-phosphatdehydrogenase zu Gluconat-6-phosphat unter Bildung \on reduziertem Nicotinamid-adenin-dinticleotidphosphat oxydiert und letzteres spektrophotometrisch bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man der gepufferten Lösung ein Azid zusetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Puffer eine Mischung von Triäthanolaminhydrochlorid. Natronlauge bzw. Natriumcarbonat und Natriumazid verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man alle für die Reaktion benötigten Reagenzien außer den Enzymen zusammen in Lösung bringt und in dieser Form einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine geringe Menge Digitonin. vorzugsweise 10 mg/100 ml Reagenslösung gemeinsam mit den Reagenzien in Lösung bringt.

5. Diagnostisches Mittel zum enzymatischen Wachweis von Glucose, bestehend aus Hexokinase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase sowie Adenosiiitriphosphat. Magnesiumsulfat. Nicotinamidadenm-dinudeotidphosphat und einem Puffer, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer ein Azid enthält.

6. Diagnostisches Mitlei nach Anspruch 5. dadurch gekennzeichnet, daß Adenosintriphosphat. Magnesiumsulfat. Nicotinamid-adenin-dinucleotidpliosphat. Puffersiibstanz und Azid als homogenes Pulvergemisch und die Enzyme Hexokinase und Glucose-fvphosphat-dehvdrogenasc gesondert in Form einer Suspension in Ammoniumsulfatlösung vorliegen.

7. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 5 oder 6. dadurch gekennzeichnet, daß die Puffersubstanz aus Triäthanolamin-hydrochlorid und Natriumin drowd bzw. Natriumcarbonat besteht und das Azid als Natriumsalz vorliegt.

<S. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 5 oder 7. dadurch gekennzeichnet, daß Adenosintriphosphat. Magnesiumsulfat. i)a> Puffergemisch. Digitonin und Natriuma/id in Form einer wäßrigen Lösung. Nicotinamiil-adcnin-dinuclcotidphosphat in fester form und die Fnz>mc llcxokiniisc und Glucose-6-phospliat-dchydrogcnase gesondert in Form einer Suspension in Ammoniumsulfatlösung vorliegen.