DE3502200C2

DE3502200C2 -

Info

Publication number: DE3502200C2
Application number: DE3502200A
Authority: DE
Inventors: Umberto Savino-Arezzo It Basagni; Francesco Trento E Trieste It Bonicolini
Original assignee: Menarini Industrie Farmaceutiche Riunite SRL
Current assignee: Menarini Industrie Farmaceutiche Riunite SRL
Priority date: 1984-01-27
Filing date: 1985-01-24
Publication date: 1991-02-21
Also published as: IT1177513B; BE901570A; DE3502200A1; CA1263934A; GR850181B; FR2558849A1; NL8500181A; US5077199A; ATA20785A; FR2558849B1; ES8607554A1; LU85734A1; CH664160A5; ES539583A0; IT8447603A0

Description

Die Erfindung betrifft ein gebrauchsfertiges, flüssiges Reagens zum Bestimmen des Glucosegehaltes von Blut nach dem Trinderverfahren.

Zum Bestimmen des Glucosegehaltes von Blut (Plasma oder Serum (werden meistens das Trinder-Verfahren oder dessen Abwandlungen benutzt. Bei diesen Verfahren wird der Glucosegehalt von Blut mit Hilfe der Glucoseoxydase und der Trinder-Farbreaktionen in den folgenden Schritten durchgeführt:

Das Reagens besteht aus einer für die Glucoseoxydase bzw. Peroxydase geeignet gepufferten Enzymkomponente und einem Chromogen, insbesondere 4-Aminophenazon und Phenol oder dessen Derivaten. Die Reagenzien müssen bei Gebrauch rekonstituiert, d. h. zur ursprünglichen Konzentration gelöst werden. Das gebrauchsfertige Reagens besitzt nach seiner Rekonstitution nur noch eine begrenzte Stabilität. Es ist mit dem Nachteil behaftet, nicht länger als 60 Tage und durchschnittlich 30 Tage haltbar zu sein.

Zur Rekonstitution sind die beiden folgenden Verfahren bekannt:

I. Hinzufügen von Wasser zu einem Enzym-Chromogengemisch.
II. Mischen der Enzymkomponente und des Chromogens, die in diesem Fall getrennt aufbewahrt werden.

In beiden Fällen ist der Benutzer gezwungen, das gebrauchsfertige Produkt selbst anzusetzen. Bei dieser, wenn auch einfachen, Zubereitung treten jedoch häufig technisch bedingte Fehler auf. Im einen Fall wird destilliertes Wasser von einer solch hohen Reinheit benötigt, wie es nur selten zur Verfügung steht. Das in den Labors für klinische Tests zur Verfügung stehende deionisierte Wasser enthält häufig noch Spuren von Chlor, und seine Reinheit ist besonders im Sommer ungenügend. Beim Mischen führt hingegen ein Verschütten der Komponenten oder ungenügendes Ausfließen der Reagenzien aus den Flaschen zu einer anderen als der gewünschten Konzentration. Außer diesen beiden Fehlerquellen kann es auch zu einem inhomogenen Mischen von gelöstem Stoff und Lösungsmittel kommen, wenn das Enzym aus einem wasserfreien Pulver besteht und zusammen mit einem schlecht löslichen Puffer wie z. B. Phosphatpuffer genutzt wird.

Bei pulverförmigen Reagenzien kommt es häufig vor, daß das Mischungsverhältnis der Pulverbestandteile selbst innerhalb einer Fabrikationsserie in einem weiten Bereich schwankt und daraus eine unvollkommene Homogenität resultiert. Bei lyophilisierten Enzymen besteht die Gefahr, daß die Enzymaktivität abhängig von der Lage der einzelnen Flasche und ihrem Platz auf der Platte während der Lyophilisation unterschiedlich zufällig reduziert wird und sich somit unterschiedliche Konzentrationen bzw. Aktivitäten ergeben. Außer den oben erwähnten die Reproduzierbarkeit beeinträchtigenden Nachteile verursachen die bekannten Reagenzien aus den folgenden Gründen sehr hohe Produktionskosten.

Die bekannten Reagenzien zum Bestimmen des Glucosegehaltes von Blut liegen entweder als wasserfreie Pulver oder als Lyophile vor. Die Produktion von wasserfreien Pulvern erfordert feuchtigkeitsgesteuerte Räume, in denen die Beschäftigten infolge der starken Beanspruchung ernsten Risiken ausgesetzt sind. So kann es bei der Verwendung von Enzymenpulvern insbesondere in Verbindung mit Natriumazid oder anderen Puffern zu manchmal irreversiblen Schäden an den Atmungsorganen der Beschäftigten kommen, wenn sie längere Zeit diesen Substanzen ausgesetzt sind. Außerdem kann der jahrelange Umgang mit solchen Enzymen zu einer Sensibilisierung und daraus folgenden Körperschäden führen.

Die zur Lyophilisation benötigten Anlagen erfordern hingegen neben hohen Investitionskosten einen hohen Verbrauch an elektrischer Energie und Wasser.

Darüber hinaus ist aus der deutschen Offenlegungsschrift 21 63 421 ein Verfahren zum Bestimmen der Glucose in Körperflüssigkeiten bekannt, bei dem ein eine Fettsäurekomponente tragender Lösungsvermittler einem für die Trinderreaktion geeigneten Reagens zugesetzt wird, um das bei hohen Glucosekonzentrationen bedingt lösliche Chromogen zur Vermeidung von ergebnisverfälschenden Trübungen vollständig zu lösen. Der Lösungsvermittler erzeugt selbst bei sehr hohen Glucosekonzentrationen klare echte Lösungen, hat jedoch keinen Einfluß auf die Stabilität des Reagenzes.

Darüber hinaus ist aus der US-Patentschrift 39 53 295 ein ein anionisches Oberflächenagens enthaltendes enzymatisches Reagens zum Bestimmen von Glucose bekannt, das dem Zweck dient, das bereits erwähnte, wasserlösliche Pulver zur Aufbewahrung zu stabilisieren.

Aus den sowjetischen Erfinderscheinen 1 95 414 und 2 04 962 ist ersichtlich, wie sich katalasefreier GOD herstellen läßt. Hierzu wird Katalase an Aluminiumoxyd bzw. Kaolin absorbiert und anschließend extrahiert. Katalasefreie Glucose-Oxidase entsteht als Restflüssigkeit.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Reagens zu schaffen, das nicht mit den oben genannten Nachteilen behaftet ist und ohne lange Rüstzeiten (Mindestzeit für den Ansatz der Reagens) auskommt.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine katalasefreie Glucoseoxydase (GOD) und ein nichtionisches oberflächenaktives Agens als Stabilisator gelöst. Diese Kombination ergibt ein stabiles, homogenes und gebrauchsfertiges Flüssigreagens Die homogene Konzentration der Enzymaktivitäten der Einzelkomponenten ist besonders vorteilhaft, weil die Reaktionsgeschwindigkeit ΔA/Δt (A = Absorption oder Extinktion) des fabrigen Chromogens in einer bestimmten Beziehung zum Verhältnis U/l Glucoseoxydase steht, wobei U (GOD-Einheit) die Enzymmenge ist, die unter Testbedingungen die Umsetzung von 1 µmol Glucose in einer Minute bei 25°C und einem pH-Wert von 7,0 (Natriumphosphatpuffer) bewirkt.

Dies ist der Grund dafür, daß sich bei den herkömmlichen Reagenzien teilweise erhebliche Aktivitätsunterschiede ergeben, selbst wenn die Flaschen aus einem Los stammen. Demzufolge ergeben sich Probleme bei der sogenannten Festzeittechnik.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Reagenzes besteht darin, daß es wegen der Gleichheit aller Flascheninhalte für die erwähnte Festzeittechnik geeignet ist. Bei dieser Technik muß die Glucoseoxydation durch GOD in bezug auf die β-Glucose einer Pseudo-Erster-Ordnung-Kinetik folgen. Das verursacht eine Reihe von Kettenreaktionen, auf die das Kinetikprinzip der Festzeittechnik-Messungen angewendet werden kann. Das erfindungsgemäße Reagens ist auch besonders für schnelle Analysierer geeignet.

Vorzugsweise besteht das erfindungsgemäße Reagens aus 9000 bis 40 000 U/l GOD und 5 mg/l bis 50 g/l eines nichtionischen oberflächenaktiven Agenzes. Als nichtionisches oberflächenaktives Agens eignet sich vorzugsweise Polyoxyäthylen (POÄ), beispielsweise POÄ-Tridecylalkohol und POÄ-Nonylphenol (RENEX), POÄ-Oktylphenol (TRITON C₈H₁₇-C₆H₄- (OCH₂CH₂)_n-OH) und POÄ Lauryl-, Zetyl-, Stearyl-, Oleylalkohol (BRIJ). Ebenfalls sehr gute Ergebnisse zeitigen die folgenden oberflächenaktiven Agenzien: Hydrooxypolyäthylen- Äthoxydodekan (C₁₂H₂₅-(O-C₂H₄)_n-OH) oder der Lauryläther des Polyoxyäthylenglycols (THESIT).

Eine katalasefreie Glucoseoxydase wurde bisher weder von Trinder noch von anderen Autoren in Erwägung gezogen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen des näheren beschrieben. In der Zeichnung zeigt:

Fig. 1 ein Reaktionsdiagramm zweier erfindungsgemäßer Reagenzien A und B;

Fig. 2 ein Reaktionsdiagramm eines gealterten Reagenzes A im Verhältnis zu einem Reagens mit Standardkonzentration und

Fig. 3 die Abhängigkeit der Absorption von der Standardkonzentration des erfindungsgemäßen Reagenzes.

In Fig. 1 ist die Reaktionskinetik der Reagenzien A und B dargestellt, deren Zusammensetzung sich aus der nachfolgenden Tabelle ergibt:

Tabelle
Zusammensetzung A
1000 ml von REAGENS
GOD
18 513 Einheiten
Peroxidase	1023 Einheiten
4 Aminoantipyrine	0,4 mml
Phenol	8,23 mml
Phosphatpuffer	pH -7,4
Brÿ-35 Poe-Lauril-Alkohol	mg 10

Zusammensetzung B
1000 ml von REAGENS
GOD
18 513 Einheiten
Peroxidase	1023 Einheiten
4 Aminoantipyrine	0,4 mml
Phenol	8,23 mml
Phosphatpuffer	pH -7,4
Triton-X100-POETTIL-PHENOL	mg 10

Im Diagramm der Fig. 1 ist die Abhängigkeit der Absorption (Ordinate) von der Reaktionszeit (Abszisse) der beiden Reagenzien A und B dargestellt. Die nach Perkin-Elmer gemessenen und geplotteten Reaktionskinetiken der Reagenzien A und B sind nahezu gleich, obwohl die oberflächenaktiven Agenzien verschieden waren.

Um die Konstanz der Produktqualität zu demonstrieren, ist im Diagramm der Fig. 2 die Absorption einer Probe der Zusammensetzung A mit einer Konzentration von 490 mg/dl dargestellt, die im Februar 1983 zubereitet und im Januar 1984 getestet wurde. Im Vergleich hierzu wird die Absorption einer Probe der Zusammensetzung A in der Konzentration 100 mg/dl gezeigt. Die Abhängigkeit der maximalen Absorption in Abhängigkeit von der Konzentration eines Reagenzes der Zusammensetzung A kann der Fig. 3 entnommen werden.

Nach den Diagrammen der Fig. 1 und 2 wird jeweils nach einer Reaktionszeit von 10 Min. das Absorptionsmaximum erreicht; außerdem besteht auch bei hohen Konzentrationen von 500 mg/dl hinsichtlich des Kurvenverlaufs Übereinstimmung mit der Theorie.

Die in den Fig. 1 und 2 dargestellten Ergebnisse wurden unter extremen Bedingungen erreicht. So wurde statt des normalerweise erforderlichen undurchsichtigen Gefäßes ein transparentes Gefäß benutzt, das zudem öfter geöffnet und wieder verschlossen wurde. Für die Absorption von weiß gegen H₂O wurde ein Wert von 0,128 gemessen, der durchaus akzeptabel ist, wenn man berücksichtigt, daß die Absorption eines Reagenzes bei direktem Licht ansteigt.

Bei einem Versuch ergab sich das Diagramm der Fig. 3, in dem die Absorption eine Probe der Zusammensetzung A als Funktion der Konzentration einer Standardprobe dargestellt ist. Das Diagramm wurde mittels eines Computers aufgrund von Standardproben mit einer Konzentration von 25, 50, 100, 200, 400 und 500 mg/l geplottet; es zeigt die absolute Linearität bis hin zu einer Maximalkonzentration von 500 mg/l. Das Verhältnis Reagens/Probe betrug 1000 µl/10 µl, die Reaktionszeit 10 Minuten und die Farbe blieb für etwa 1 Stunde stabil.

Claims

1. Gebrauchsfertiges flüssiges Reagens zum Bestimmen des Glucosegehaltes von Blut nach dem Trinderverfahren, gekennzeichnet durch eine katalasefreie Glucoseoxydase und ein nichtionisches, oberflächenaktives Agens als Stabilisator.

2. Reagens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch 9000 bis 40 000 U/l Glucoseoxydase und 5 mg/l bis 50 g/l nichtionisches, oberflächenaktives Agens.

3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtionische oberflächenaktive Agens aus Polyoxyäthylen besteht.

4. Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtionische oberflächenaktive Agens aus Polyoxyäthylen-Laurylalkohol besteht.

5. Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtionische Agens aus Polyoxyäthylen-Octylphenol besteht.