CN102141568B - 一种稳定的液体单试剂血糖试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稳定的液体单试剂血糖试剂盒。本发明提供的试剂盒包括50mmol/l-300mmol/l，pH＝6-9的缓冲液、葡萄糖氧化酶3ku-40ku、过氧化物酶0.8ku-40ku、4-氨基安替比林0.1-30mmol/l、色原0.1mmol/l-30mmol/l、防腐剂0.01％-5％、防止冻融后出沉淀并抗干扰的稳定剂A和稳定剂B，其中稳定剂A可以是非离子表面活性剂和两性表面活性剂的组合物。本发明具有抗Vc干扰，开盖存放1个月不用定标以及抗冻等优点。

Description

一种稳定的液体单试剂血糖试剂盒

技术领域

本发明涉及医学检验领域中的一种分析试剂，具体涉及一种用于测定葡萄糖含量的葡萄糖氧化酶单一液体测定试剂。

背景技术

本发明糖尿病是以持续高血糖为基本生化特征的一种综合病症。目前全球糖尿病患者已超过1.2亿人，我国患者人群规模也已超过5000万，占总人口的4％左右。

由于糖尿病是终身性疾病，对于已确诊糖尿病的患者，为控制和延缓病情的发展、减少并发症的发生，必须定期、不定期测量血糖，作为医院血常规项目之一，如何快速、准确检测血液中葡萄糖含量有着积极意义。

血液中葡萄糖含量酶法测定方法主要有：己糖激酶法、葡萄糖脱氢酶法、氧化酶法、酶电极、血糖仪等。应用酶学方法测定血液葡萄糖是临床化学中的主流方法。最常用的酶学方法有葡萄糖氧化酶法和己糖激酶法。其特点是具有较高的灵敏度、准确度和精密度，使用温和的反应条件，操作简单方便，适用于自动分析仪，其中，己糖激酶法、葡萄糖脱氢酶法试剂存在价格昂贵(氧化酶法的2-3倍)的问题。

葡萄糖氧化酶法的测定方法有极谱分析法和比色法两类。但二者的初始反应都是在葡萄糖氧化酶的催化下，葡萄糖被氧化成葡萄糖酸，同时消耗溶液中的氧，产生过氧化氢。极谱分析法使用氧电极检测溶液中氧的消耗量。氧消耗量与葡萄糖浓度呈正比。比色分析法使用葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的偶联反应系统。初始反应中过氧化氢的生成量与葡萄糖浓度呈正比。在辣根过氧化物催化下，过氧化氢和各种色原反应，生成有色化合物，可进行比色测定。该法的缺点如下：

1、易受还原性物质如抗坏血酸干扰。(参考《全国临床检验操作规程》)第三版，P359，卫生部医政司编制，东南大学出版社2006年11月出版；检验医学与临床2008年8月第5卷第15期，P946，维生素C对血糖检测的影响)

2、常见的以苯酚为色原的葡萄糖氧化酶法混合试剂很不稳定，酶酚混合剂在冰箱只能存放1个月(参考《全国临床检验操作规程(第3版)))，P360-361卫生部医政司编制，东南大学出版社2006年11出版)。

3、有医院反映，血糖为医院血常会项目之一，试剂的需求量很大，未使用的试剂要放在4度冰柜里，试剂存放时如有贴冰箱壁的时间长了试剂会被冻，在复融后会出现试剂中部分酶失活，使试剂不能再使用。冬季向我国东北部寒冷地区的医院送货过程中试剂也会被冻，复融后也会出现酶失活现象，试剂不能使用。使得在经济上造成损失，在运输过程中也造成了不便。

发明内容

本发明的目的是解决原有技术存在的缺陷，发明的目的在于提供一种可以简便快捷并可以快速检验血清或血浆中血糖含量的液体单试剂血糖试剂盒。采用该试剂盒中的试剂，能够利用紫外、可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪测定出血清、血浆中血糖含量，测定过程中不受血清中Vc的干扰。稳定性强，测定速度快。准确度高，便于运输及存放。所应用的检测原理为葡萄糖氧化酶法：

现有技术中的酶法试剂基本不使用阴离子、阳离子以及两性表面活性剂，认为这些对试剂中的部分酶有影响，会影响酶活，导致测值不准确。但是，发明人发现在试剂盒中采用了非离子表面活性剂和两性表面活性剂的组合使得试剂在抗胆红素干扰方面比较突出；试剂盒中还可添加VC氧化酶，在抗VC效果上比较突出。在试剂中加入了两种表面活性剂以及抗VC氧化酶可能会影响试剂稳定性，因此还可加入稳定剂使得试剂稳定。发明人还发现本发明的试剂盒既解决了抗冻，又保证了空白吸光度、定标吸光度稳定性及测值准确性。

因此，本发明一方面提供一种稳定的液体单试剂血糖试剂盒，包括：50mmol/l-300mmol/l，PH＝6-9的缓冲液、葡萄糖氧化酶3ku-40ku、过氧化物酶0.8ku-40ku、4-氨基安替比林0.1-30mmol/l、色原0.1mmol/l-30mmol/l、防腐剂0.01％-5％、防止冻融后出沉淀并抗干扰的稳定剂A和稳定剂B。

本发明中使用的稳定剂A包括非离子表面活性剂和两性表面活性剂的组合物。

优选地，本发明中使用的非离子表面活性剂选自月桂醇、胆酸钠、正辛基葡萄糖苷、聚乙二醇单十二醚、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯十二烷基醚中的一种或几种，其重量百分含量为0.1％-10％。

优选地，本发明中使用的两性表面活性剂选自烷基二甲基胺醋酸甜菜碱、烷基羟磺基甜菜碱、月桂酸酰胺丙基甜菜碱、烷基羧甲基羟乙基咪唑甜菜碱中的一种或几种，其重量百分含量为0.01％-5％。

优选地，本发明中使用的稳定剂B选自蛋白类稳定剂、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、甘氨酸盐、组氨酸盐、葡萄糖酸盐中的一种或几种。优选地，稳定剂B选用谷氨酸盐、甘氨酸盐、葡萄糖酸盐、牛血清蛋白中的的两种或两种以上组合使用。稳定剂B的重量百分含量可以是0.5％-5％。

优选地，本发明的试剂盒中还可含有1-100ku/l的抗坏血酸氧化酶。

由于酶反应需要合适的PH的、有一定离子缓冲能力的缓冲液。优选地，本发明中使用的缓冲液选自Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、GOOD’S缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中的一种或几种。最适PH在6-9之间。

优选地，本发明中使用的防腐剂选自迭氮钠，迭氮锂、PC300、烷基糖苷、MIT中的一种，浓度为0.01％-5％。

优选地，本发明中使用的色原为苯酚。其浓度在0.1mmol/l-30mmol/l，最优推荐浓度为0.3-10mmol/l。苯酚的价格要比一些高敏色原便宜很多，在试剂的性能上使用苯酚作为色原也可以达到高敏色原所能达到的性能，灵敏度可以达到进口试剂标准。试剂使用苯酚作为色原可以在成本上有很大降低，这也使得病人在做此项检测时费用降低，减轻了经济压力。

本发明具有下列一方面或多方面的优点：

1、抗干扰效果：可采用非离子表面活性剂和两性表面活性剂的组合使得试剂在抗胆红素干扰方面比较突出。

2、可加入了VC氧化酶，消除了Vc的干扰，解决了血清中Vc使测值偏低，临床判断不准确问题。

3、本发明加入稳定剂后是试剂稳定剂得到了改善，可以在4度存放18个月，开盖再试机舱中可放置一个月无需重新定标。

4、本发明解决了放置或运输过程中试剂冻融后不能使用的问题，减少了经济损失。

5、可采用价格低廉的苯酚作为色原，试剂灵敏度可以达到进口试剂标准，降低了试剂成本上，使病人减少了经济负担。

6、本发明为单试剂，节省仪器试剂位，提高了仪器的利用率。

附图说明

图1：本发明试剂盒的开盖稳定性。

图2：本发明试剂与对照试剂冻融三次测值比较：低值质控比较结果。

图3：本发明试剂与对照试剂冻融三次测值比较：高值质控比较结果。

图4：本发明试剂与市售A、市售B试剂相关性实验结果。A，与市售A相关性实验结果；B，与市售B相关性实验结果。

图5：研发试剂高值线性。

图6：研发试剂低值线性。

图7：市售A高值线性。

图8：市售A低值线性。

图9：市售B低值线性。

图10：市售B高值线性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例。不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。

本发明中使用的缩略语含义为：

4-AAP：4-氨基安替比林；GOD：葡萄糖氧化酶；

POD：过氧化物酶；ASO：抗坏血酸氧化酶；

MIT：甲基异噻唑啉酮。

实施例1：

成分        浓度

苯酚        5mmol/l

4-AAP       3mmol/l

GOD         3ku

POD         0.8k

ASO         3ku/l

磷酸缓冲液  60mmol/l，PH＝6-9

迭氮钠0.5％

谷氨酸盐20g/l

葡萄糖酸盐15g/l

聚氧乙烯烷基醚0.5％

烷基二甲基胺醋酸甜菜碱0.5％

实施例2：

成分        浓度

苯酚        5mmol/l

4-AAP       3mmol/l

GOD         3ku/l

POD         0.8ku/l

ASO         5ku/l

Tris缓冲液  60mmol/l，PH＝6-9

MIT 0.5％

牛血清蛋白30g/l

甘氨酸盐15g/l

正辛基葡萄糖苷(n-Octylglucoside)5％

烷基羟磺基甜菜碱0.5％

实施例3：

成分          浓度

苯酚          5mmol/l

4-AAP         3mmol/l

GOD           10ku/l

POD           10ku/l

ASO           30ku/l

碳酸钠缓冲液  60mmol/l，PH＝6-9

迭氮锂0.5％

牛血清蛋白30g/l

葡萄糖酸盐15g/l

聚氧乙烯十二烷基醚5％

烷基羧甲基羟乙基咪唑甜菜碱0.5％

实施例4：

成分          浓度

苯酚          5mmol/l

4-AAP         3mmol/l

GOD           10ku/l

POD           10ku/l

ASO           30ku/l

碳酸钠缓冲液  60mmol/l，PH＝6-9

迭氮锂0.5％

谷氨酸盐30g/l

甘氨酸盐15g/l

月桂醇5％

月桂酸酰胺丙基甜菜碱1％

实施例5：

成分          浓度

苯酚          5mmol/l

4-AAP         3mmol/l

GOD           10ku/l

POD           10ku/l

ASO           30ku/l

碳酸钠缓冲液  60mmol/l，PH＝6-9

迭氮锂0.5％

天门冬氨酸盐30g/l

葡萄糖酸盐15g/l

聚乙二醇单十二醚(Polidocanol)5％

烷基羧甲基羟乙基咪唑甜菜碱0.5％

适用本发明在奥林帕斯AU400机器上操作方式：

计算方法：

可计算血清中葡萄糖的浓度。

本发明试剂与现有试剂的比较结果如下：

市售A：不添加表面活性剂厂家，无抗坏血酸氧化酶

组分                    浓度

磷酸盐缓冲液(pH 7.5)    100mmol/L

葡萄糖氧化酶            15KU/L

过氧化物酶              3KU/L

4-氨基安替比林          0.5mmol/L

苯酚                    5mmol/L

市售B：添加非离子表面活性剂厂家，无抗坏血酸氧化酶

组分              浓度

酚                10mmol/l

磷酸缓冲液        50mmol/L

MOPS缓冲液        50mmol/L

4-氨基胺替吡啉    0.77mmol/L

GOD               2KU/L

POD               2KU/L

TX-100            1.5g/L

通过本发明的试剂测定结果如下：(除另有具体说明，本文中“GLU研发试剂”和“研发试剂”均是指本发明实施例1的试剂，使用实施例2-5的试剂也取得了类似的实验结果)：

由于有报道指出血清中的Vc会对血糖的测值有影响，会使试剂测值偏低，影响临床判断。本发明中加入了可以消除血清中Vc的抗坏血酸氧化酶，其浓度在1-100ku/l，最优推荐浓度为3-30ku/l。可确保临床判断。

本发明所提供的是一种单试剂的血糖检测试剂盒，有文献公开常见的以苯酚为色原的葡萄糖氧化酶法混合试剂很不稳定，酶酚混合剂在冰箱只能存放1个月(参考《全国临床检验操作规程(第3版)))，P360-361卫生部医政司编制，东南大学出版社2006年11出版)。为了改善此缺陷，本发明中需要加入可是使试剂可以稳定的稳定剂B，其选自蛋白类稳定剂、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、甘氨酸盐、组氨酸盐、葡萄糖酸盐。由于试剂中存在的酶种类较多，为了确保每种酶能在试剂中以液体形式稳定存在，最优选用谷氨酸盐、甘氨酸盐、牛血清蛋白或葡萄糖酸盐中的的两种或两种以上组合使用。这样就可以保证试剂的稳定性，本发明可以在4度冰柜里存放18个月，开盖在仪器试剂舱里放置一个月不用重新定标(图1)。

有医院反映，血糖为医院血常会项目之一，试剂的需求量很大，未使用的试剂要放在4度冰柜里，试剂存放时如有贴冰箱壁的时间长了试剂会被冻，在复融后会出现试剂中部分酶失活，使试剂不能再使用。冬季向我国东北部寒冷地区的医院送货过程中试剂也会被冻，复融后也会出现酶失活现象，试剂不能使用。使得在经济上造成损失，在运输过程中也造成了不便。另外，血清还存在胆红素等干扰成分，为了解决此问题，发明人发现加入了稳定剂A可以有效消除干扰并解决复融的问题。发明人发现优选的稳定剂A为非离子表面活性剂和两性表面活性剂的组合物，其中非离子表面活性剂选自月桂醇、胆酸钠、正辛基葡萄糖苷、聚乙二醇单十二醚、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯十二烷基醚中的一种或几种，两性表面活性剂选自烷基二甲基胺醋酸甜菜碱、烷基羟磺基甜菜碱、月桂酸酰胺丙基甜菜碱、烷基羧甲基羟乙基咪唑甜菜碱中的一种或几种。组合使用不仅可以解决抗冻问题还可以消除血清中的部分干扰(图2及下述实验)。

抗冻实验：

按照实施例1-5配置的试剂与市售A、市售B试剂放置-20度，冻实后放在常温下自然融化。此过程反复三次，每次融化后上机测质控，模拟运输过程中及贴壁存放后冻融过程。

抗冻试验测值数据：

以上数据为实施例2-5获得的实验结果，下述实验数据通过实施例1的试剂完成。

从实验结果(图2、图3)可以看出，研发试剂在三次冻融前后测值无差别，试剂外观澄清。加入非离子表面活性剂试剂三次冻融测值一次比一次测值高，已超出医院所接受范围，但试剂外观澄清。未添加表面活性剂试剂，冻融后试剂外观出现沉淀，测值也超出靶值范围，不准确。

抗干扰：

分别按照本领域的常规技术配置含有抗坏血酸、胆红素、血红蛋白，甘油三酯不同浓度的待测样品，采用实施例1-5对各种干扰物的抗干扰能力。检测结果如下所示：

以上数据由实施例2及实施例3与对照试剂所测得，由于实施例1-5使用稳定剂B属于同一种类，均具有类似的抗胆红素的良好的效果，下述实验通过实施例1的试剂完成。

VC干扰	市售A	回收率％	研发试剂	回收率％	市售B	回收率％
							血清+水	5.34	100	5.3	100	5.37	100

血清+10mg/dl	4.9	91.76	5.3	100	5.07	94.41
							血清+20mg/dl	4.45	83.33	5.1	96.23	4.88	90.88
血清+30mg/dl	3.97	74.34	4.9	92.45	4.33	80.63
							血清+40mg/dl	3.48	65.17	4.9	92.45	3.81	70.95
血清+50mg/dl	3.02	52.65	4.9	92.45	3.12	58.10

37度存放10天稳定性数据：

按实施例1-5配置试剂盒稳定性好，配置液体试剂进行37度加速稳定性试验，37度加速稳定性试验10天可模拟现实4-8度保存1年。结果如下表所示：

相关实验：

按实施例配置1-5试剂盒与市售A、市售B做相关性实验。检测50份新鲜人血清(包含正常和异常样本)，按参数进行测定，对测定值进行相关分析(结果见图1，X，Y轴均为测定值，单位mmol/l)。研发试剂与市售A相关系数R²＝0.9996，回归方程为y＝0.9982x+0.0739。研发试剂与市售B相关系数R²＝0.9998，回归方程为y＝1.0198x-0.106。结果表明本试剂与市售试剂相关性良好，具有很好的特异性和准确性(图4)。

序号	研发试剂	市售A	市售B
				1	4.97	4.92	4.9
2	5.12	5.13	5.03
				3	5.28	5.3	5.22
4	5.17	5.28	5.16
				5	5.09	5.29	5.18
6	2.14	2.13	2.12
				7	4.24	4.23	4.25
8	4.54	4.7	4.57
				9	4.74	4.87	4.81
10	4.76	4.82	4.83
				11	4.96	4.96	5.03
12	5.47	5.53	5.43
				13	8.05	8.01	8
14	5	4.97	4.95
				15	7.82	7.83	7.78
16	5.76	5.78	5.77
				17	5.5	5.47	5.41
18	6.24	6.224	6.18
				19	5.87	5.98	5.89
20	6.04	6.25	6.05
				21	5.73	5.64	5.66
22	5.2	5.27	5.28
				23	5.69	5.87	5.73
24	5.7	5.79	5.81
				25	5.15	5.23	5.19
26	5.75	5.77	5.78

27	4.95	4.99	4.87
				28	5.39	5.39	5.28
29	4.97	4.95	4.91
				30	8.75	8.82	8.73
31	5.65	5.57	5.6
				32	7.59	7.57	7.46
33	5.54	5.57	5.47
				34	5.64	5.79	5.64
35	4.76	4.94	4.83
				36	5.38	5.37	5.38
37	6.02	6.2	6.12
				38	7.77	7.96	7.95
39	5.76	5.86	5.86
				40	6.5	6.71	6.56
41	11.85	11.95	12.08
				42	16.79	16.87	17.01
43	14.57	14.59	14.52
				44	16.05	16.08	16.38
45	23.28	23.47	23.78
				46	33.07	33	33.58
47	21.85	21.51	22.07
				48	14.16	14.17	14.29
49	17.91	18.14	18.16
				50	13.49	13.91	13.91

线性实验：

采用本领域技术人员已知的方法，对实施例1-5的试剂盒做线性范围检测。将高值标本进行等比稀释，在检测仪器上采用试剂盒连续测定3次，计算其均值。将检测出的样品的测量值与稀释比例进行相关对比。求出节距为零的回归方程。通过回归方程求出每个样本的理论值。根据计算出的理论值和检测均值之间求出该浓度时检测的线性偏差。要求回归方程的回归系数R²＞0.99，各浓度的线性偏差均小于10％

结果：研发试剂线性0-26.09mmol/l，市售试剂A线性0-25.82mmol/l，市售试剂B线性0-26.02mmol/l。研发试剂具有良好的线性，在临床检测异常值时得到保证。

准确度、精密度实验

分别采用本领域常规的检测方法，对实施例1-5制备的试剂盒的准确性和精密度进行检测。

准确性

对靶值为6.0(5.1-6.9)mmol/l的质控液I和靶值为15.7(13.3-18.1)mmol/l的质控液II在相同条件下，采用试剂盒对同一质控液的血糖浓度连续检测20次，将检测结果的平均值与靶值范围进行比较，以检测所述的试剂盒的准确性。

精密度

在相同条件下，采用试剂盒对两份质控液的血糖含量连续检测20次，比较每个试剂盒的变异系数，以检测所述的试剂盒的精密度。

以上实施例是对本发明的说明和进一步解释，而不是对本发明的限制，在本发明的精神和权利保护范围内所做的任何修改，都落入本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种稳定的液体单试剂血糖试剂盒，包括：

其中：

所述表面活性剂至少包含非离子表面活性剂和两性表面活性剂，

非离子表面活性剂的重量百分含量为0.1%-10%，

两性表面活性剂的重量百分含量为0.01%-5%，

所述稳定剂选自谷氨酸盐、甘氨酸盐、葡萄糖酸盐、牛血清蛋白中的两种或多种。

2.根据权利要求1所述的稳定的液体单试剂血糖试剂盒，其中

非离子表面活性剂选自月桂醇、胆酸钠、正辛基葡萄糖苷、聚乙二醇单十二醚、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯十二烷基醚中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的稳定的液体单试剂血糖试剂盒，其中

两性表面活性剂选自烷基二甲基胺醋酸甜菜碱、烷基羟磺基甜菜碱、月桂酸酰胺丙基甜菜碱、烷基羧甲基羟乙基咪唑甜菜碱中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的稳定的液体单试剂血糖试剂盒，还含有1-100ku/l的抗坏血酸氧化酶。

5.根据权利要求1所述的稳定的液体单试剂血糖试剂盒，其中缓冲液选自Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、GOOD’S缓冲液、柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的稳定的液体单试剂血糖试剂盒，其中防腐剂选自迭氮钠，迭氮锂、PC300、烷基糖苷、MIT中的一种。

7.根据权利要求1所述的稳定的液体单试剂血糖试剂盒，其中色原为苯酚。

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