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PATENTANSPRÜCHE
1. Gefärbtes Bezugs-Standard für diagnostische Bestimmungen, welche enzymatische Reaktionen, bei denen 1-(pjod- phenylf54p-nitrophenylf3-phenylformazan gebildet wird, aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass es eine wässrige Lösung von a) 0,001 bis 0,020 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)3-phenylformazan; b) 0,01 bis 0,10 Gew.-0/o Serumalbumin; c) 2 bis 10 Gew.-0!o der Lösungsmittel N,N'-Dimethylformamid und/oder Dimethylsulfoxyd; und d) 2 bis 10 Gew.-0!o Isopropylalkohol enthält, wobei die Mengenangaben sich auf das Gewicht der Gesamtlösung beziehen, und ein Extinktionsmaximum bei 500 nm aufweist.
2. Gefärbtes Bezugs-Standard nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es 5 bis 20 Gew.-% eines inerten Quellmittels in wässriger Lösung enthält.
3. Gefärbtes Bezugs-Standard nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Lösung von a) 0,005 bis 0,015 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)- 3-phenylformazan; b) 0,02 bis 0,075 Gew.- /0 Serumalbumin; c) 2 bis 10 Gew.-0/c N,N'-Dimethylformamid; d) 2 bis 10 Gew.-O/o Isopropylalkohol; und e) 8 bis 14 Gew.-0!o Dextran mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10 000 enthält.
4. Gefärbtes Bezugs-Standard nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es eine wässrige Lösung von a) etwa 0,0123 Gew.-O/o 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3- phenylformazan; b) etwa 0,0563 Gew.-0!o Rinderserumalbumin; c) etwa 2,5 Gew.-% N,N'-Dimethylformamid; d) etwa 7,5 Gew.-0/o Isopropylalkohol; und e) etwa 9 Gew.-% Dextran mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10000 enthält und diese Lösung eine Extinktion bei 500 nm, was einem Äquivalent von ungefähr 1,34 entspricht, aufweist.
5. Verfahren zur Herstellung eines gefärbten Bezugs-Standards für diagnostische Bestimmungen, welche enzymatische Reaktionen, bei denen 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phe- nylformazan gebildet wird, aufweisen, nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man a) 0,001 bis 0,020 Gew.-0/c I-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenylt 3-phenylformazan in einer wässrigen Lösung, welche 2 bis 10 Gew.-O/o der Lösungsmittel N,N'-Dimethylformamid und/oder Dimethylsulfoxyd enthält, vollständig löst; b) 2 bis 10 Gew.-0/o Isopropylalkohol langsam zu der Lösung a) gibt und sorgfältig mischt; c) 0,01 bis 0,10 Gew.- /0 Serumalbumin in 80 bis 95 Gew.-0/o Wasser löst;
und d) die Lösung b) zu der Lösung c) langsam unter Rühren hinzufügt, wobei sich die Mengenangaben auf die Gesamtlösung beziehen.
6. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Stufe c) 5 bis 20 Gew.-% eines inerten Quellmittels in dem Wasser zusätzlich mit dem Serumalbumin löst, und man in der Stufe d) die Lösung b) langsam unter Rühren zu der Lösung c), welche das Quellmittel und das Serumalbumin enthält, hinzufügt.
7. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man in der Verfahrensstufe a) 0,005 bis 0,015 Gew.-0/o lAp-Jodphenylp5Ap-nitrophenyl)-3-phenylformazan in einer wässrigen Lösung, welche 2 bis 10 Gew.-0/o N,N'-Dimethylformamid enthält, löst; und man in der Stufe c) 0,02 bis 0,075 Gew.-0/c Serumalbumin zusätzlich zu 8 bis 14 Gew.-% eines Dextran-Quellmittels mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10 000, hinzufügt.
8. Verfahren nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man in der Verfahrensstufe a) etwa 0,0123 Gew.-% 1Xp-JodphenylS5Ap-nitrophenyl)-3-phenylformazan in einer wässrigen Lösung, welche 2,5 Gew.-0/o N,N'-Dimethylformamid enthält, löst, in Stufe b) etwa 7,5 Gew.-0/o Isopropylalkohol zusetzt und in Stufe c) 9 Gew.-0/o Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 und 0,0563 Gew.-% Rinderserumalbumin in 90 Gew.-% Wasser löst.
9. Verwendung des gefärbten Bezugs-Standards nach den Patentansprüchen 1 und 2 zur Herstellung eines stabilen Produktes, dadurch gekennzeichnet, dass man die wässrige Lösung lyophilisiert.
10. Verwendung nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Bezugs-Standard gemäss Patentanspruch 3 verwendet.
11. Verwendung nach Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Bezugs-Standard gemäss Patentanspruch 4 verwendet.
Die Erfindung betrifft ein gefärbtes Bezugs-Standard für diagnostische Bestimmungen, welche enzymatische Reaktionen, bei denen 1Ap-Jodphenyl)-5Ap-nitrophenyl)-3-phenylforma- zan gebildet wird, aufweisen, sowie das Verfahren zu seiner Herstellung, sowie seine Verwendung zur Herstellung eines lyophilisierten Produktes.
Methoden zur quantitativen Bestimmung gewisser Enzyme basieren auf der Produktion von reduziertem Nikotinamid Adenindinucleotid (NADH) oder reduziertem Nikotinamid Adenindinucleotidphosphat (NADPH) als Ergebnis der enzymatischen Reaktion auf einem Substrat. Das NADH oder im Wechsel NADPH reduziert farbloses 2-(p-Jodphenyl)-3 < p- nitrophenyl > 5-phenyltetrazoliumchlorid (im allgemeinen unter der Bezeichnung INT bekannt) in Gegenwart eines Elektronenträgers, beispielsweise Phenazin-methosulfat, zu 1(pJodphe- nyl)-5-(p-nitrophenylS phenylformazan für gewöhnlich unter der Bezeichnung INT-Formazan bekannt), welches hellrot ist und spektrofotometrisch gemessen werden kann.
Die Konzentrationen des Enzyms werden derart bestimmt, dass man gleichzeitig neben der Testreaktion einen Versuch mit einer Bezugsprobe durchführt, wobei letztere bekannte Enzymmengen besitzt und man die spektrofotometrischen Werte der zu bestimmenden Probe mit denen der Bezugsprobe vergleicht.
Repräsentative enzymatische Bestimmungen, bei denen die oben beschriebene Methode im allgemeinen beschrieben ist, finden sich in folgenden Schriften: Babson, A. L. and Phillips, G. E., A Rapid Colorimetric Assay for Serum Lactic Dehydrogenase , Clin. Chim. Acta 12,210-215(1965); Van Der Veen et al., Isoenzymes of Creatine Phosphokinase in Tissue Extracts and in Normal and Pathological Sera , Clin. Chim. Acta 13, 312-316 (1966); and Nachlas, M. M., et al., The Determination of Lactic Dehydrogenase with a Tetrasodium Salt , Anal. Bio chem.,1,317-326 (1960).
Die Genauigkeit der Ergebnisse bei der Anwendung der oben genannten Methoden zur Bestimmung enzymatischer Aktivitäten hängt in einem weiten Mass von der Herstellung und der Stabilität der Bezugsprobe ab, welche eine bekannte Enzymmenge enthält, mit der die Ergebnisse der Testprobe verglichen werden. Darüber hinaus bedeuten diese enzymatischen Testmethoden eine doppelte Arbeit, da in jedem Falle der Test selber ebenso auf der Bezugsprobe wie auf der unbekannten Probe laufen muss. Solch ein Doppelversuch erfordert eine sehr umfangreiche Kontrolle, um sicherzugehen, dass
keine Ungenauigkeiten vorliegen.
Es liegt deshalb auf der Hand, dass ein Bedürfnis nach einem stabilen Bezugsstandard für die enzymatischen Bestimmungen vorliegt, bei dem kein gleichzeitiger Kontrolltest vorgenommen werden muss. Bis jetzt ist ein solches Produkt noch nicht im Handel erhältlich.
Demgemäss ist Gegenstand der Erfindung:
1. ein gefärbtes Bezugs-Standard für diagnostische Bestimmungen, welche enzymatische Reaktionen, bei denen l-(p-Jod- phenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan gebildet wird, aufweisen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine wässrige Lösung von a) 0,001 bis 0,020 Gew.-0/c 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl > 3-phenylformazan; b) 0,01 bis 0,10 Gew.- /O Serumalbumin; c) 2 bis 10 Gew;O/o der Lösungsmittel N,N'-Dimethylformamid und/oder Dimethylsulfoxyd; und d) 2 bis 10 Gew.-0/c Isopropylalkohol enthält, wobei sich die Mengenangaben auf die Gesamtlösung beziehen, und ein Extinktionsmaximum bei 500 nm aufweist;
sowie
2. ein Verfahren zur Herstellung des gefärbten Bezugs-Standards für diagnostische Bestimmungen, welche enzymatische Reaktionen, bei denen 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phe- nylformazan gebildet wird, aufweisen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) 0,001 bis 0,020 Gew.-0/o 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)- 3-phenylformazan in einer wässrigen Lösung, welche 2 bis 10 Gew.-0/o Lösungsmittel N,N'-Dimethylformamid und/oder
Dimethylsulfoxyd enthält, vollständig löst; b) 2 bis 10 Gew.-O/o Isopropylalkohol langsam zu der Lösung a) gibt und sorgfältig mischt; c) 0,01 bis 0,10 Gew.-0/c Serumalbumin in 80 bis 95 Gew.-0/o Wasser löst;
und d) die Lösung b) zu der Lösung c) langsam unter Rühren hinzufügt, wobei sich die Mengenangaben auf die Gesamtlösung beziehen.
Dem wässrigen gefärbten Bezugs-Standard können auch 5 bis 20 Gew.-0/o eines inerten Quellmittels zugesetzt und sodann lyophilisiert werden. Das lyophilisierte Produkt kann leicht mit Wasser wiederhergestellt werden. Die wässrige gefärbte
Bezugs-Standardlösung weist ein Extinktionsmaximum bei 500 nm auf und eignet sich für die Bestimmung gewisser Enzym aktivitäten, wie beispielsweise der Aktivität der Serumlactat
Dehydrogenase, der Creatinphosphokinase, der Glucose-6.
phosphatdehydrogenase und ähnlicher Enzyme.
Es hat sich herausgestellt, dass ein gefärbtes Bezugs-Stan dard zur Bestimmung gewisser Enzymaktivitäten enthaltend in wässriger Lösung 0,001 bis 0,020 Gew.-0/c lXp-JodphenylS5Xp- nitrophenyl > 3-phenylformazan, 0,01 bis 0,10 Gew.- /0 Serumal bumin, 2 bis 10 Gew.-% eines Lösungsmittels N,N'-Dimethylfor mamid und/oder Dimethylsulfoxyd und 2 bis 10 Gew.-% Isopro pylalkohol ein Extinktionsmaximum bei 500 nm aufweist.
Durch die Zugabe von 5 bis 20 Gew;O/o eines inerten Quellmit tels kann eine Lösung, welche lyophilisiert werden kann, herge stellt werden. DieNlyophilisierte Form des gefärbten Bezugs
Standards ist mindestens sechs Monate lang bei 4 "C und bei
24 "C stabil. darüber hinaus kann die lyophilisierte Form des vorliegenden Bezugs-Standards mit Wasser wiederhergestellt werden und ergibt eine klare Lösung, welche ohne Schwierig keit als Bezugs-Standard für die enzymatischen Bestimmungen verwendet werden kann.
Das 14p-Jodphenyl)4-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan in dem gefärbten Bezugs-Standard (allgemein als INT-Formazan bekannt) ist im Handel von National Biochemicals Cor., Cleve land, Ohio erhältlich und weist folgende Formel auf:
EMI2.1
Das INlU-Formazan wird häufig bei mikrobiologischen Identifikations-Bestimmungen verwendet, insbesondere bei der Prüfung von Nahrungsmitteln und pathologischen Präparaten, bei denen Bakterien, falls vorhanden, das farblose 2-(p-Jodphe nyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid (allgemein als INT bekannt), welches die Formel
EMI2.2
besitzt, zu dem hellgefärbten INT-Formazan reduziert.
Darüber hinaus bewirken einige enzymatische Reaktionen die Reduktion des INT in das INT-Formazan, und dies wiederum ist genau die Verwendungsmöglichkeit des vorliegenden gefärbten Bezugs-Standards bei der Bestimmung dieser Enzyme.
Es hat sich herausgestellt, dass die Lösungsmittel N,N' Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd besonders gut die Löslichkeit des INT-Formazans verbessern und die leichte Wiederherstellung mit Wasser nach der Lyophilisierung erlauben. Die Zugabe von Isopropylalkohol unterstützt ebenfalls diesen Lösungsvorgang. Von besonderer Wichtigkeit ist es, dass diese Lösungsmittel nicht das Extinktionsmancimum der wässrigen gefärbten Bezugs-Standardlösung stören oder beeinträchtigen.
Das vorliegende stabile gefärbte Bezugs-Standard enthält auch Serumalbumin. Dabei ist das Rinderserumalbumin bevor zugt Es wird vermutet, dass dieses Material bei der Stabilisierung sowohl der lyophilisierten als auch der wässrigen Form des Bezugs-Standards hilft.
Geeignete inerte Quellmittel zur Verwendung in dem vorliegenden Bezugs-Standard sind u. a. natürliche und synthetische Kautschukarten, wie z. B. Gummi arabicum, Natriumalgi nat, Irish-Moos-Extrakt, Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon und ähnliche Arten; ferner Zucker, wie beispielsweise Sorbit, Mannit, Saccharose und ähnliche Zucker; ferner ECohle- hydrate, wie z. B. Stärke, Dextran und andere Kohlehydrate.
Das bevorzugte Quellmittel ist ein Dextran mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10000.
Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel eines gefärbten Bezugs-Standards kann derart hergestellt werden, indem man eine wässrige Lösung, welche sich zur Lyophilisierung eignet, herstellt, welche 0,005 bis 0,015 Gew.-0/o von 1-(pJodphenyW5- (p-nitrophenyl3-phenyllormazan, 0,02 bis 0,075 Gew.-0/o Rin derserumalbumin, 8 bis 14 Gew.-0/o Dextran, mit einem Molekulargewicht von etwa 10000,2 bis 10 Gew.-0/c N,N'-Dimethylfor- mamid und 2 bis 10 Gew.-0/o Isopropylalkohol zubereitet.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform eines gefärbten Bezugs-Standards enthält in wässriger Lösung 0,0123 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan, 0,563 Gew.-0/o Rinderserumalbumin, 9 Gew.-0/c Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 10000,2,5 Ges % N,N' Dimethylformamid und 7,5 Gew.- /O Isopropylalkohol. Die Extinktion der wässrigen gefärbten Bezugs-Standardlösung bei 500 nm ist ungefähr 1,34.
Die lyophilisierte Form des vorliegenden gefärbten Bezugs Standards hat sich bei Temperaturen von 4 "C und 24 "C mindestens sechs Monate lang als stabil erwiesen. Das mit Wasser oder mit 0,1 n Salzsäure wiederhergestellte lyophilisierte Standard kann leicht zu Verdünnungen verwendet werden, welche zur Aufstellung von Standardkurven für kolorimetrische Fixpunkt (fixed-point > Enzymproben erforderlich sein können.
Wiederhergestellte gefärbte Bezugs-Standardlösungen sind 8 Stunden lang bei Zimmertemperatur und mindestens 48 Stunden lang bei 4 "C stabil.
Um ein stabiles gefärbtes Bezugs-Standard herzustellen, müssen die verschiedenen oben genannten Bestandteile auf besondere Weise zueinander gegeben werden, um ein Produkt zu erhalten, welches die notwendige Stabilität und Löslichkeit aufweist, um nach der Lyophilisierung wiederhergestellt werden zu können. Diese Eigenschaften werden durch erstes vollständiges Lösen des INT-Formazans in einem ausgewählten Lösungsmittel und Zugabe des Isopropylalkohols unter gründli chem Mischen erreicht. Das Serumalbumin wird in Wasser gelöst und zu dieser Lösung wird langsam unter Rühren die INT-Formazanlösung zugesetzt. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel des vorliegenden Bezugs-Standards, bei dem Lyo philisierung erwünscht ist, wird das inerte Quellmittel in Wasser zusammen mit dem Serumalbumin gelöst.
Die erhaltene Endlösung wird in gleiche Teile aufgeteilt und dem üblichen Lyophilisierungsverfahren unterworfen.
Zur Verwendung für enzymatische Bestimmungen wird die oben beschriebene lyophilisierte Form des gefärbten Bezugs Standards mit Wasser oder 0,1 n-Salzsäure wiederhergestellt.
Die gefärbte Bezugs-Standardlösung dient als Standard bekannter Aktivität, gegen das unbekannte Testproben vergli chen werden können, um die Enzymaktivität in der unbekannten Probe zu bestimmen. Die vorliegende gefärbte Bezugs Standardlösung kann bei Bedarf verdünnt werden, um zur Auf stellung von Kurven für colorimetrische Fixpunkt (fix pointS
Enzymproben zu dienen.
Das vorliegende gefärbte Bezugs-Standard weist eine ausgezeichnete Stabilität in lyophilisiertem Zustand auf und kann nach der Wiederherstellung leicht für die laufend vorgenom menen enzymatischen Bestimmungen verwendet werden. Aus führungsbeispiele des vorliegenden gefärbten Bezugs-Stan dards sowie dessen Herstellungsverfahren sind nachfolgend in den Beispielen beschrieben.
Beispiel
Herstellung der stabilen gefärbten Bezugs-Standardlösung a) 12,13 mg INT-Formazan wird in 2,5 ml N,N'-Dimethylfor- mamid gelöst. Zu dieser Lösung werden 7,5 ml Isopropanol als
Reagens hinzugefügt und sorgfältig vermischt.
b) 9,0 g Dextran mit einem Molekulargewicht von ungefähr
10 000 und 56,3 mg Rinderserumalbumin werden in 90 ml gerei nigtem Wasser gelöst.
c) Die Lösung a) wird langsam zu der Lösung b) unter Rühren zugesetzt. Von der erhaltenen vereinigten Lösung werden gleiche Mengen von jeweils 4,0 ml in Ampullen von 10 ml Inhalt gegeben, gefroren und 36 Stunden lang bei einem Einstellpunkt von 30 "C lyophilisiert. Sodann werden die Ampullen in trockener Stickstoffatmosphäre verschlossen. Jede Ampulle wird mit 10 ml einer 0,1 n-Salzsäure wiederhergestellt, wobei die Extinktion bei 500 nm 1,34010,010 beträgt, was 540 Internationale Einheiten Lactat-Dehydrogenase-Aktivität bei 37 "C oder aber 420 Internationalen Einheiten Creatin-Phosphokinase-Aktivität bei 30 "C entspricht.
Colorimetrischer Versuch für Serumlactat-Dehydrogenase Die Reagentien für den Versuch werden wie folgt hergestellt:
Farbreagens: 50 mg INT werden in ungefähr 15 ml Wasser unter längerem Schütteln gelöst, bis die Lösung vollständig eingetreten ist. Sodann werden 125 mg Nikotinamid-Adenindinucleotid hinzugefügt und gelöst gefolgt von der Zugabe von 12,5 mg Phenazin-Methosulfat. Die Lösung wird mit den Waschwässern sofort in eine 25 ml volumetrische Flasche mit geringer actinischer Wirkung eingebracht und mit Wasser bis zur Marke verdünnt.
Pufferlösung: 1,0 g äthoxylierter Oleylalkohol (Lipal 10-OA, Drew Chemical Co., Boonton, N. J.) wird in 10 ml Wasser durch Erhitzen auf ungefähr 95 "C gelöst. Die Lösung wird mit Wasser auf 50 ml verdünnt und sodann werden 12,1 g Tris dazugegeben. Der pH-Wert wird auf 8,2 mittels 3 n-Salzsäure eingestellt und das Ganze sodann auf 100 ml aufgefüllt.
Substratreagens: (0,1 m-L(+)lactat) 5,0 ml einer 200/obigen L(+SMilchsäurelösung werden zu ungefähr 50 ml Wasser gegeben. Der pH-Wert wird auf 5,5 mittels 1 n-Natronlauge eingestellt und das Ganze mit Wasser auf 120 ml aufgefüllt. Die Lösung wird mit einigen Tropfen Chloroform gesättigt.
Kontrollregeans: 0,2 g Kaliumoxalat und 0,2 Äthylendiamintetraessigsäure-Dinatriumdihydrat werden in 100 ml Wasser gelöst. Die oben genannten Zubereitungen sind in Babson et al. Clin. Chim. Acta 12: Seite 210 bis 215(1965) beschrieben.
Verfahren: 0,1 ml Serum und 0,2 ml Pufferreagens werden in jeweils 2 Reagensgläser pipetiert.0,5 ml Substrat werden in das eine Reagensglas gegeben und 0,5 ml der Kontroll-Rea genslösung in das andere Reagensglas. Beide Reagensgläser werden gemischt und auf 37 "C erwärmt. In genau gemessenen Abständen werden in beide Reagensgläser jeweils 0,2 ml Farbreagens zugesetzt und der Inhalt der Reagensgläser wiederum gemischt und das Ganze sofort wieder in das Wasserbad gestellt. Genau 5 Minuten nach Zugabe des Farbreagens werden in beide Reagensgläserjeweils 5 ml 0,1 n-Salzsäure gegeben und erneut gemischt. Die Differenz bei der Extinktion zwischen dem Kontrollreagensglas und dem Reagensglas mit der Serumprobe, bestimmt bei 500 nm innerhalb 20 Minuten, beträgt 0,67.
Diese Extinktion wird mit dem gefärbten Bezugs Standard aus Beispiel 1 verglichen, welches eine Extinktion von 1,34010,010, was 540 Internationalen Einheiten Lactat-Dehydrogenase-Aktivität entspricht, aufweist. Die Lactat-Dehydrogenase-Aktivität in dem Serum wird bestimmt und ergibt 270 Internationale Einheiten bei 37 "C.
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PATENT CLAIMS
1. Colored reference standard for diagnostic determinations which have enzymatic reactions in which 1- (p-iodophenylf54p-nitrophenylf3-phenylformazan is formed, characterized in that it is an aqueous solution of a) 0.001 to 0.020% by weight 1 - (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl) 3-phenylformazan; b) 0.01 to 0.10% by weight of serum albumin; c) 2 to 10% by weight of the solvents N, N'-dimethylformamide and / or dimethyl sulfoxide; and d) contains 2 to 10% by weight of isopropyl alcohol, the quantities given being based on the weight of the total solution and having an extinction maximum at 500 nm.
2. Colored reference standard according to claim 1, characterized in that it contains 5 to 20 wt .-% of an inert swelling agent in aqueous solution.
3. Colored reference standard according to claim 1, characterized in that it is a solution of a) 0.005 to 0.015 wt .-% 1- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl) - 3-phenylformazane; b) 0.02 to 0.075 w / o serum albumin; c) 2 to 10% by weight 0 / c N, N'-dimethylformamide; d) 2 to 10% by weight of isopropyl alcohol; and e) contains 8 to 14% by weight dextran with a molecular weight of approximately 10,000.
4. Colored reference standard according to claim 3, characterized in that it is an aqueous solution of a) about 0.0123% by weight O / o 1- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl) -3- phenylformazane ; b) about 0.0563% by weight bovine serum albumin; c) about 2.5% by weight of N, N'-dimethylformamide; d) about 7.5% by weight isopropyl alcohol; and e) contains about 9% by weight of dextran with a molecular weight of about 10,000 and this solution has an absorbance at 500 nm, which corresponds to an equivalent of about 1.34.
5. A process for producing a colored reference standard for diagnostic determinations which have enzymatic reactions in which 1- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl) -3-phenylformazane is formed, according to claim 1, characterized in that a) 0.001 to 0.020% by weight 0 / c I- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenylt 3-phenylformazane in an aqueous solution containing 2 to 10% by weight of the solvent Contains N, N'-dimethylformamide and / or dimethyl sulfoxide, completely dissolves; b) slowly add 2 to 10% by weight of isopropyl alcohol to solution a) and mix thoroughly; c) 0.01 to 0.10 w / o serum albumin dissolves in 80 to 95 w / o water;
and d) slowly adding the solution b) to the solution c) with stirring, the quantitative data relating to the total solution.
6. The method according to claim 5, characterized in that in step c) 5 to 20 wt .-% of an inert swelling agent in the water additionally with the serum albumin, and in step d) the solution b) slowly with stirring to the solution c), which contains the swelling agent and the serum albumin.
7. The method according to claim 5, characterized in that in process step a) 0.005 to 0.015% by weight / 0 lAp-iodophenylp5Ap-nitrophenyl) -3-phenylformazane in an aqueous solution which is 2 to 10% by weight / o contains N, N'-dimethylformamide, dissolves; and in step c) 0.02 to 0.075% by weight / c serum albumin is added in addition to 8 to 14% by weight of a dextran swelling agent with a molecular weight of approximately 10,000.
8. The method according to claim 7, characterized in that in process step a) about 0.0123 wt .-% 1Xp-JodphenylS5Ap-nitrophenyl) -3-phenylformazan in an aqueous solution, which is 2.5 wt Contains N, N'-dimethylformamide, dissolves, adds about 7.5% by weight of isopropyl alcohol in stage b) and 9% by weight of dextran with a molecular weight of about 10,000 and 0.0563 in stage c) % By weight of bovine serum albumin dissolves in 90% by weight of water.
9. Use of the colored reference standard according to claims 1 and 2 for the production of a stable product, characterized in that the aqueous solution is lyophilized.
10. Use according to claim 9, characterized in that one uses a reference standard according to claim 3.
11. Use according to claim 10, characterized in that one uses a reference standard according to claim 4.
The invention relates to a colored reference standard for diagnostic determinations which have enzymatic reactions in which 1Ap-iodophenyl) -5Ap-nitrophenyl) -3-phenylformazane is formed, as well as the process for its preparation and its use for the preparation of a lyophilized product.
Methods for the quantitative determination of certain enzymes are based on the production of reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) or reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) as a result of the enzymatic reaction on a substrate. The NADH or alternately NADPH reduces colorless 2- (p-iodophenyl) -3 <p -nitrophenyl> 5-phenyltetrazolium chloride (generally known under the name INT) in the presence of an electron carrier, for example phenazine methosulfate, to 1 (p-iodophenyl ) -5- (p-nitrophenylS phenylformazan usually known under the name INT-Formazan), which is light red and can be measured spectrophotometrically.
The concentrations of the enzyme are determined in such a way that in addition to the test reaction, a test is carried out with a reference sample, the latter having known amounts of enzyme and the spectrophotometric values of the sample to be determined being compared with those of the reference sample.
Representative enzymatic determinations, in which the method described above is generally described, can be found in the following documents: Babson, A.L. and Phillips, G.E., A Rapid Colorimetric Assay for Serum Lactic Dehydrogenase, Clin. Chim. Acta 12, 210-215 (1965); Van Der Veen et al., Isoenzymes of Creatine Phosphokinase in Tissue Extracts and in Normal and Pathological Sera, Clin. Chim. Acta 13, 312-316 (1966); and Nachlas, M.M., et al., The Determination of Lactic Dehydrogenase with a Tetrasodium Salt, Anal. Bio chem., 1,317-326 (1960).
The accuracy of the results when using the above-mentioned methods for determining enzymatic activities depends to a large extent on the preparation and the stability of the reference sample, which contains a known amount of enzyme with which the results of the test sample are compared. In addition, these enzymatic test methods mean double work, since in any case the test itself must run on the reference sample as well as on the unknown sample. Such a double attempt requires very extensive control to ensure that
there are no inaccuracies.
It is therefore clear that there is a need for a stable reference standard for the enzymatic determinations, which does not require a simultaneous control test. Such a product is not yet commercially available.
The invention accordingly relates to:
1. a colored reference standard for diagnostic determinations, which have enzymatic reactions in which l- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl) -3-phenylformazan is formed, which is characterized in that it an aqueous solution of a) 0.001 to 0.020% by weight / c 1- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl> 3-phenylformazane; b) 0.01 to 0.10% by weight serum albumin; c) 2 to 10% by weight of the solvents N, N'-dimethylformamide and / or dimethyl sulfoxide; and d) contains 2 to 10% by weight of isopropyl alcohol, the quantitative data relating to the total solution and having an extinction maximum at 500 nm;
such as
2. A method for producing the colored reference standard for diagnostic determinations, which have enzymatic reactions in which 1- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl) -3-phenylformazane is formed, characterized in that is that a) 0.001 to 0.020% by weight 0 / o 1- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl) -3-phenylformazane in an aqueous solution containing 2 to 10% by weight 0 / o solvent N, N'-dimethylformamide and / or
Contains dimethyl sulfoxide, completely dissolves; b) slowly add 2 to 10% by weight of isopropyl alcohol to solution a) and mix thoroughly; c) 0.01 to 0.10% by weight / c of serum albumin dissolved in 80 to 95% by weight of water;
and d) slowly adding the solution b) to the solution c) with stirring, the quantitative data relating to the total solution.
5 to 20% by weight of an inert swelling agent can also be added to the aqueous colored reference standard and then lyophilized. The lyophilized product can easily be restored with water. The watery colored
Reference standard solution has an extinction maximum at 500 nm and is suitable for the determination of certain enzyme activities, such as the activity of serum lactate
Dehydrogenase, creatine phosphokinase, glucose-6.
phosphate dehydrogenase and similar enzymes.
It has been found that a colored reference standard for the determination of certain enzyme activities containing in aqueous solution 0.001 to 0.020% by weight / c lXp-iodophenylS5Xp-nitrophenyl> 3-phenylformazane, 0.01 to 0.10% by weight / 0 serum alumine, 2 to 10% by weight of a solvent N, N'-dimethylformamide and / or dimethyl sulfoxide and 2 to 10% by weight of isopropyl alcohol has an extinction maximum at 500 nm.
A solution which can be lyophilized can be prepared by adding 5 to 20% by weight of an inert swelling agent. The lyophilized form of the colored cover
Standards is at 4 "C and at least for six months
24 "C. stable. In addition, the lyophilized form of the present reference standard can be restored with water and results in a clear solution which can be used without difficulty as a reference standard for the enzymatic determinations.
The 14p-iodophenyl) 4- (p-nitrophenyl) -3-phenylformazan in the colored reference standard (commonly known as INT-Formazan) is commercially available from National Biochemicals Cor., Cleveland, Ohio and has the following formula:
EMI2.1
The INlU-Formazan is often used in microbiological identification determinations, especially in the testing of food and pathological preparations in which bacteria, if present, contain the colorless 2- (p-iodophenyl) -3- (p-nitrophenyl) -5 -phenyltetrazolium chloride (commonly known as INT), which has the formula
EMI2.2
reduced to the light-colored INT-Formazan.
In addition, some enzymatic reactions cause the INT to be reduced to the INT formazan, and this, in turn, is exactly the use of this colored reference standard in the determination of these enzymes.
It has been found that the solvents N, N 'dimethylformamide or dimethyl sulfoxide improve particularly well the solubility of the INT formazan and allow easy restoration with water after lyophilization. The addition of isopropyl alcohol also supports this solution process. It is of particular importance that these solvents do not interfere with or impair the extinction maximum of the aqueous colored reference standard solution.
The present stable colored reference standard also contains serum albumin. Bovine serum albumin is preferred. It is believed that this material helps to stabilize both the lyophilized and the aqueous form of the reference standard.
Suitable inert swelling agents for use in the present reference standard include a. natural and synthetic types of rubber, such as B. gum arabic, sodium algate, Irish moss extract, carboxymethyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone and similar species; sugar such as sorbitol, mannitol, sucrose and like sugars; also E-carbohydrates, such as. B. starch, dextran and other carbohydrates.
The preferred swelling agent is a dextran with a molecular weight of approximately 10,000.
A preferred embodiment of a colored reference standard can be prepared by preparing an aqueous solution which is suitable for lyophilization and which contains 0.005 to 0.015% by weight of 1- (p-iodophenyW5- (p-nitrophenyl3-phenyllormazane, 0.02 to 0.075% by weight of serum albumin, 8 to 14% by weight of dextran, with a molecular weight of approximately 10000.2 to 10% by weight of N, N'-dimethylformamide and 2 to 10% by weight isopropyl alcohol prepared.
A particularly preferred embodiment of a colored reference standard contains 0.0123% by weight of 1- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl) -3-phenylformazane, 0.563% by weight of ooic serum albumin, 9 in aqueous solution % By weight dextran with a molecular weight of approximately 10000.2.5% by weight of N, N 'dimethylformamide and 7.5% by weight of isopropyl alcohol. The absorbance of the reference aqueous colored standard solution at 500 nm is approximately 1.34.
The lyophilized form of the present colored reference standard has been shown to be stable at temperatures of 4 "C and 24" C for at least six months. The lyophilized standard reconstituted with water or with 0.1 N hydrochloric acid can easily be used for dilutions which may be required for the preparation of standard curves for colorimetric fixed point (fixed-point> enzyme samples).
Restored colored reference standard solutions are stable for 8 hours at room temperature and at least 48 hours at 4 "C.
In order to produce a stable colored reference standard, the various constituents mentioned above must be added to one another in a special way in order to obtain a product which has the necessary stability and solubility in order to be able to be restored after lyophilization. These properties are achieved by first completely dissolving the INT formazan in a selected solvent and adding the isopropyl alcohol with thorough mixing. The serum albumin is dissolved in water and the INT formazan solution is slowly added to this solution while stirring. In a preferred embodiment of the present reference standard, in which lyophilization is desired, the inert swelling agent is dissolved in water together with the serum albumin.
The final solution obtained is divided into equal parts and subjected to the usual lyophilization process.
For use in enzymatic determinations, the above-described lyophilized form of the colored reference standard is restored with water or 0.1N hydrochloric acid.
The colored reference standard solution serves as a standard of known activity against which unknown test samples can be compared to determine the enzyme activity in the unknown sample. The present colored reference standard solution can be diluted if necessary in order to set up curves for colorimetric fixed point (fix pointS
Serve enzyme samples.
The present colored reference standard has excellent stability in the lyophilized state and can easily be used for the ongoing enzymatic determinations after the restoration. From examples of the present colored reference standard and its manufacturing process are described below in the examples.
example
Preparation of the stable colored reference standard solution a) 12.13 mg of INT formazan is dissolved in 2.5 ml of N, N'-dimethylformamide. 7.5 ml of isopropanol are added to this solution
Reagent added and mixed thoroughly.
b) 9.0 g of dextran with a molecular weight of approximately
10,000 and 56.3 mg bovine serum albumin are dissolved in 90 ml of purified water.
c) Solution a) is slowly added to solution b) with stirring. Equal quantities of 4.0 ml each are placed in ampoules of 10 ml content, frozen and lyophilized for 36 hours at a setpoint of 30 ° C. The ampoules are then sealed in a dry nitrogen atmosphere. Each ampoule is sealed with 10 ml of 0.1N hydrochloric acid restored, the absorbance at 500 nm being 1.34010.010, which is 540 international units of lactate dehydrogenase activity at 37 ° C. or 420 international units of creatine phosphokinase activity at 30 ° C. corresponds.
Colorimetric Experiment for Serum Lactate Dehydrogenase The reagents for the experiment are prepared as follows:
Color reagent: 50 mg of INT are dissolved in approximately 15 ml of water with long shaking until the solution is completely absorbed. Then 125 mg of nicotinamide adenine dinucleotide are added and dissolved followed by the addition of 12.5 mg of phenazine methosulfate. The solution is immediately added to the wash water in a 25 ml volumetric bottle with little actinic effect and diluted to the mark with water.
Buffer solution: 1.0 g of ethoxylated oleyl alcohol (Lipal 10-OA, Drew Chemical Co., Boonton, NJ) is dissolved in 10 ml of water by heating to approximately 95 ° C. The solution is diluted with water to 50 ml and then 12 , 1 g of Tris was added, the pH was adjusted to 8.2 using 3N hydrochloric acid and the whole was then made up to 100 ml.
Substrate reagent: (0.1 mL (+) lactate) 5.0 ml of a 200 / L (+ S) lactic acid solution are added to about 50 ml of water. The pH is adjusted to 5.5 with 1N sodium hydroxide solution and the whole made up to 120 ml with water and saturated with a few drops of chloroform.
Control regeans: 0.2 g potassium oxalate and 0.2 ethylenediaminetetraacetic acid disodium dihydrate are dissolved in 100 ml water. The above-mentioned preparations are described in Babson et al. Clin. Chim. Acta 12: Pages 210 to 215 (1965).
Procedure: 0.1 ml of serum and 0.2 ml of buffer reagent are pipetted into 2 test tubes each. 0.5 ml of substrate are added to one test tube and 0.5 ml of the control reagent solution into the other test tube. Both test tubes are mixed and heated to 37 "C. At exactly measured intervals, 0.2 ml of color reagent is added to each of the test tubes and the contents of the test tubes are mixed again and the whole thing is immediately put back into the water bath. Exactly 5 minutes after the addition of the color reagent 5 ml of 0.1 N hydrochloric acid are added to both test tubes and mixed again.The difference in the absorbance between the control test tube and the test tube with the serum sample, determined at 500 nm within 20 minutes, is 0.67.
This absorbance is compared to the colored reference standard from Example 1, which has an absorbance of 1.34010.010, which corresponds to 540 international units of lactate dehydrogenase activity. The lactate dehydrogenase activity in the serum is determined and gives 270 international units at 37 "C.