DE2537499A1 - COLORED COMPARATIVE STANDARD FOR THE DIAGNOSTIC DETERMINATION OF ENZYMATIC REACTIONS AND THE METHOD FOR THEIR PRODUCTION - Google Patents
COLORED COMPARATIVE STANDARD FOR THE DIAGNOSTIC DETERMINATION OF ENZYMATIC REACTIONS AND THE METHOD FOR THEIR PRODUCTIONInfo
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HENKEL, KERN, FEILER & HÄNZELHENKEL, KERN, FEILER & HÄNZEL
telex: 05 29 802 HNKi. D EDUARD-SCHMID-STRASSE 2 2£££^£κ°ΜωΑ3»ί?telex: 05 29 802 HNKi. D EDUARD-SCHMID-STRASSE 2 2 £££ ^ £ κ ° ΜωΑ3 »ί?
Warner-Lambert Company
Morris Plains, N.J.,
V.St.A.Warner-Lambert Company
Morris Plains, NJ,
V.St.A.
Dr. F/rm mcnchen. den 2 2. AUG. 1975Dr. For Munich. the 2 2nd AUG. 1975
Farbiger Vergleichsstandard zur diagnostischen Bestimmung von enzymatischen Reaktionen und Verfahren zu seiner HerstellungColored comparison standard for diagnostic determination of enzymatic reactions and processes for their preparation
Verfahren zur quantitativen Bestimmung bestimmter Enzyme beruhen auf der Bildung von NADA (reduziertem Nikotinsäureamidadenindinucleotid) oder NADPH (reduziertem Nikotinsäureamidadenindinucleotidphosphat) als Ergebnis der enzymatischen Reaktion auf einem Substrat. Das NADH oder NADPH seinerseits reduziert das allgemein als INT bekannte farblose 2-(p-Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid in Gegenwart eines Elektronenträgers, wie Phenazinmethosulfat, zu dem leuchtend roten und spektralphotometrisch bestimmbaren, als INT-Formazan bekannten 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan. Die Enzymkonzentrationen werden durch gleichzeitiges Mitlaufenlassen der Testreaktion in einer bekannte Enzymkonzentrationen enthaltenden Vergleichsprobe und Vergleich der spektralphotometrischen Ablesung der unbekannten Probe gegen die spektralphotometrischen Ablesungen der Vergleichsprobe bestimmt.Methods for the quantitative determination of certain enzymes rely on the formation of NADA (reduced nicotinic acid amide adenine dinucleotide) or NADPH (reduced nicotinic acid amide adenine dinucleotide phosphate) as a result of the enzymatic reaction on a substrate. The NADH or NADPH in turn reduces the colorless 2- (p-iodophenyl) -3- (p-nitrophenyl) -5-phenyltetrazolium chloride, known generally as INT, in the presence of an electron carrier, such as phenazine methosulfate, to the bright red and spectrophotometrically determinable, as INT- Formazan known 1- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl) -3-phenylformazan. The enzyme concentrations are determined by simultaneously running the test reaction in a reference sample containing known enzyme concentrations and comparing the spectrophotometric reading of the unknown sample with the spectrophotometric readings of the reference sample.
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Beispiele für enzymatische Bestimmungen, die in der geschilderten allgemeinen Weise durchgeführt werden, sind von A.L. Babson und G.E. Phillips in "A Rapid Colorimetric Assay for Serum Lactic Dehydrogenase" in "Clin. Chirn. Acta», Band 12, Seiten 210 bis 215 (1965), von Van Der Veen und Mitarbeitern in "Isoenzymes of Creatine Phosphokinase in Tissue Extracts and in Normal and Pathological Sera» in »Clin. Chim. Acta", Band 13, Seiten 312 bis 316 (1966), und von M.M. Nachlas und Mitarbeitern in "The Determination of Lactic Dehydrogenase with a Tetrasodium Salt" in "Anal. Biochem.", Band 1, Seiten 317 bis 326 (1960), beschrieben.Examples of enzymatic determinations, which are described in the general manner are by A.L. Babson and G.E. Phillips in "A Rapid Colorimetric Assay for Serum Lactic Dehydrogenase "in" Clin. Chirn. Acta ", vol. 12, pages 210-215 (1965) by Van Der Veen et al. In Isoenzymes of Creatine Phosphokinase in Tissue Extracts and in Normal and Pathological Sera "in" Clin. Chim. Acta ", Volume 13, Pages 312 bis 316 (1966), and by M.M. Nachlas et al. In "The Determination of Lactic Dehydrogenase with a Tetrasodium Salt "in" Anal. Biochem. ", Vol. 1, pages 317 to 326 (1960).
Die Genauigkeit der nach den geschilderten Verfahren zur Bestimmung enzymatischer Aktivitäten ermittelten Ergebnisse hängt in großem Maße von der Zubereitung und Stabilität der die bekannte Enzymmenge enthaltenden Vergleichsprobe, mit deren Ergebnissen die zu testende Probe verglichen wird, ab. Weiterhin ist bei diesen enzymatischen Testverfahren eine Doppelarbeit erforderlich, da der Test als solcher in jedem Falle sowohl mit der Vergleichsprobe als auch mit der unbekannten Probe durchgeführt werden muß. Eine solche Doppelarbeit erfordert eine äußerst genaue Überwachung, damit sich keine Ungenauigkeiten einschleichen. Somit liegen also der Bedarf und die Vorteile eines stabilen, farbigen Vergleichsstandards zur Verwendung bei enzymatischen Bestimmungen ohne gleichzeitiges Mitlaufenlassen eines Kontrollversuchs auf der Hand. Unglücklicherweise gibt es ein derartiges Produkt bis heute noch nicht.The accuracy of the according to the described procedure for Determination of enzymatic activities obtained depends in large measure on the preparation and stability the comparison sample containing the known amount of enzyme, with the results of which the sample to be tested is compared will, from. Furthermore, duplication of effort is required in these enzymatic test procedures because the test as such can be carried out in each case with both the reference sample and the unknown sample got to. Such duplication of work requires extremely close monitoring so that inaccuracies do not creep in. Thus there is the need and the advantages of a stable, colored comparison standard for use in the case of enzymatic determinations without simultaneous running of a control experiment on the hand. Unfortunately There is no such product to this day.
Gegenstand der Erfindung ist nun ein farbiger Vergleichsstandard zur Verwendung bei diagnostischen Bestimmungen The invention now relates to a colored comparison standard for use in diagnostic determinations
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von enzymatischen Reaktionen, "bei denen i-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-PlIe^If ormazan gebildet wird, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß er aus einer wäßrigen Lösung mit, bezogen auf das Gewicht der gesamten Lösung, G,001 bis 0,020 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan, 0,01 bis 0,10 Gew.-% Serumalbumin, 2 bis 10 Gew.-% eines Lösungsmittels, wie N,N'-Dimethylformamid oder Dirnethylsulfoxid, und 2 bis 10 Gew.-% Isopropanol besteht.of enzymatic reactions, "in which i- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl) -3-PlIe ^ If Ormazan is formed, which is characterized in that it consists of an aqueous solution with, based on the weight of the total solution, G.001 to 0.020% by weight 1- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl) -3-phenylformazan, 0.01 to 0.10% by weight of serum albumin, 2 to 10% by weight of a solvent such as N, N'-dimethylformamide or dimethyl sulfoxide, and 2 to 10% by weight isopropanol consists.
Der wäßrigen farbigen Vergleichsstandardlösung können 5 bis 20 Gew.-% eines inerten Füllstoffs einverleibt werden. Nach ihrer Zubereitung kann die wäßrige farbige Vergleichsstandardlösung lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet und in dieser Form ohne weiteres mit Wasser wieder aufbereitet werden. Die wäßrige farbige VergleichsStandardlösung besitzt ein Absorptionsmaximum bei 500 nm und eignet sich zur Bestimmung bestimmter Enzymaktivitäten, z.B. von Serumlactatdehydrogenase, Kreatinphosphokinase, Glukose-6-phosphatdehydrogenase und dergleichen.5 to 20% by weight of an inert filler can be incorporated into the aqueous colored comparison standard solution. After its preparation, the aqueous colored reference standard solution can be lyophilized or freeze-dried and in this form can easily be reprocessed with water. The aqueous colored comparison standard solution has an absorption maximum at 500 nm and is suitable for the determination of certain enzyme activities, e.g. of serum lactate dehydrogenase, Creatine phosphokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase and the same.
Erfindungsgemäß hat es sich gezeigt, daß ein farbiger Vergleichsstandard zur Verwendung bei der Bestimmung bestimmter Enzymaktivitäten mit, in einer wäßrigen Lösung, bezogen auf ihr Gesamtgewicht, 0,001 bis 0,020 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan, 0,01 bis 0,10 Gew.-% Serumalbumin, 2 bis 10 Gew.-% N,N'-Dimethylformamid und/oder Dimethylsulfoxid und 2 bis 10 Gew.-% Isopropanol ein Absorptionsmaximum bei 500 nm aufweist. Nach Zugabe von 5 bis 20 Gevr,-% eines inerten Füllmittels erhält man eine lyophilisierbare Lösung. In lyophilisierter Form ist der farbige Vergleichsstandard gemäß der Erfin-According to the invention it has been shown that a colored comparison standard for use in the determination of certain enzyme activities with, in an aqueous solution, based on its total weight, 0.001 to 0.020 wt .-% 1- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl ) -3-phenylformazan, 0.01 to 0.10 wt -.% serum albumin, 2 to 10 wt .-% N, N'-dimethylformamide and / or dimethylsulfoxide and 2 to 10 wt .-% isopropanol an absorption maximum at 500 nm having. After adding 5 to 20 % by weight of an inert filler, a lyophilizable solution is obtained. The colored comparison standard according to the invention is available in lyophilized form.
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dung bei Temperaturen von 4 und 24 C mindesten:-, 6 ITonate lang stabil. Die lyophi]isierte Form des erfindungsgemäßen Vergleichsstandards läßt sich mit V/asser ohne weiteres zu einer klaren Lösung wieder aufbereiten. Diese kann dann ohne Schwierigkeiten als Vergleichsstandard bei enzymatischen Bestimmungen verwendet werden.Use at temperatures of 4 and 24 C at least: -, 6 months long stable. The lyophilized form of the calibration standard according to the invention can easily be mixed with water reprocess it to a clear solution. This can then be used without difficulty as a comparison standard for enzymatic Provisions are used.
Das allgemein als INT-Formazan bekannte und in dem farbigen Vergleichsstandard gemäß der Erfindung enthaltene 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan ist im Handel erhältlich und besitzt folgende Formel:The one commonly known as INT-Formazan and in the colored one Comparison standard according to the invention contained 1- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl) -3-phenylformazan is commercially available and has the following formula:
-N=N-C=N-NH--N = N-C = N-NH-
ffff
NO,NO,
Dem INT-Formazan begegnet man häufig bei mikrobiologischen Identifizierungsmaßnahmen, insbesondere bei der Bestimmung von Nahrungsmittelproben oder pathologischen Proben, bei denen Bakterien, falls vorhanden, das farblose 2-(p-Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid (als INT bekannt) der Formel:The INT formazan is often encountered in microbiological Identification measures, especially when determining food samples or pathological samples, in which bacteria, if present, use the colorless 2- (p-iodophenyl) -3- (p-nitrophenyl) -5-phenyltetrazolium chloride (known as INT) of the formula:
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zu dem leuchtend gefärbten INT-Formazan reduzieren. Weiterhin kommt es bei bestimmten enzymatisehen Reaktionen zu einer Reduktion von INT zu INT-Formazan. Der farbige Vergleichsstandard gemäß der Erfindung gelangt dann bei der Bestimmung dieser Enzyme zum Einsatz.reduce to the brightly colored INT-Formazan. It also occurs in certain enzymatic reactions a reduction from INT to INT formazan. The colored comparison standard according to the invention then arrives at the Determination of these enzymes for use.
Lösungsmittel, die die Löslichkeitseigenschaften des INT-Formazans verbessern und eine einfache Wiederaufbereitung des lyophilisierten Vergleichsstandards mit Wasser gestatten, sind N,N'-Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid. Weiterhin begünstigt auch der Zusatz des Isopropanols das Loslichkeitsverhalten des INT-Formazans. Es ist von wesentlicher Bedeutung, daß diese Lösungsmittel das Absorptionsmaximum des wäßrigen farbigen Vergleichsstandards nicht stören.Solvents that increase the solubility properties of the INT formazan and allow easy reprocessing of the lyophilized calibration standard with water, are N, N'-dimethylformamide and dimethyl sulfoxide. Farther The addition of isopropanol also favors the solubility behavior of the INT formazan. It is essential Meaning that these solvents have the absorption maximum of the aqueous colored calibration standard do not bother.
Der stabile, farbige Vergleichsstandard gemäß der Erfindung enthält ferner Serumalbumin. Bevorzugt enthält er Rinderserumalbumin. Dieses Material trägt vermutlich zur Stabilisierung sowohl der lyophilisierten als auch der wäßrigen Form des Vergleichsstandards bei.The stable, colored comparison standard according to the invention also contains serum albumin. It preferably contains bovine serum albumin. This material presumably contributes to Stabilization of both the lyophilized and the aqueous form of the calibration standard.
Geeignete inerte Füllstoffe zur Verwendung in dem Referenzstandard gemäß der Erfindung sind natürliche und synthetische Gummis, wie Gummi arabikum, Natriumalginat, Irisch-Moos-Extrakt, Carboxymethylzellulose, Polyvinylpyrrolidinon und dergleichen, Zucker, wie Sorbit, Mannit, Rohrzucker und dergleichen, sowie Kohlehydrate, wie Stärke, Dextran und dergleichen. Der bevorzugte Füllstoff ist ein Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 10000.Suitable inert fillers for use in the reference standard according to the invention are natural and synthetic gums, such as gum arabic, sodium alginate, Irish moss extract, Carboxymethyl cellulose, polyvinylpyrrolidinone and the like, sugars such as sorbitol, mannitol, cane sugar and the like, as well as carbohydrates such as starch, dextran and the like. The preferred filler is a Dextran with a molecular weight of about 10,000.
Ein bevorzugter farbiger Vergleichsstandard läßt sich erfindungsgemäß durch Zubereiten einer lyophilisierbarenA preferred colored comparison standard can be used according to the invention by preparing a lyophilizable
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wäßrigen Lösung mit, bezogen auf ihr Gesamtgewicht, 0,005 bis 0,015 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan, 0,02 bis 0,075 Gew.-% Rinderserumalbumin, 8 bis 14 Gew.-% Dextran eines Molekulargewichts von etwa 10000, 2 bis 10 Gew.-% N,N'-Dimethylformamid und 2 bis 10 Gew.-% Isopropanol herstellen.aqueous solution with, based on its total weight, 0.005 to 0.015 wt .-% 1- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl) -3-phenylformazan, 0.02 to 0.075 wt .-% bovine serum albumin, 8 to 14 Prepare wt .-% dextran having a molecular weight of about 10,000, 2 to 10 wt .-% N, N'-dimethylformamide and 2 to 10 wt .-% isopropanol.
Ein besonders bevorzugter farbiger Vergleichsstandard gemäß der Erfindung enthält in wäßriger Lösung, bezogen auf das Gewicht der gesamten Lösung, 0,0123 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan, 0,563 Gew.-% Rinderserumalbumin, 9 Gew.-% Dextran eines Molekulargewichts von etwa 10000, 2,5 Gew.-% N,N'-Dimethylformamid und 7,5 Gew.-% Isopropanol. Die Absorption des wäßrigen farbigen Vergleichsstandards gemäß der Erfindung bei 500 nm beträgt etwa 1,34.A particularly preferred colored comparison standard according to the invention contains in aqueous solution, based on the weight of the total solution, 0.0123 wt .-% 1- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl) -3-phenylformazan, 0.563 wt .-% bovine serum albumin, 9 wt .-% dextran having a molecular weight of about 10,000, 2.5 wt -.% N, N'-dimethylformamide and 7.5 wt .-% isopropanol. The absorption of the aqueous colored calibration standard according to the invention at 500 nm is about 1.34.
Es hat sich gezeigt, daß der farbige Vergleichsstandard gemäß der Erfindung in lyophilisierter Form bei Temperaturen von 4° und 24°C mindestens 6 Monate lang stabil ist. Der lyophilisierte Standard läßt sich nach Wiederaufbereitung mit Wasser oder 0,1n-Chlorwasserstoffsäure ohne weiteres so weit verdünnen, wie es zur Aufstellung von Eichkurven für kolorimetrische enzymatische Festpunktbestimmungen erforderlich ist. Wieder aufbereitete farbige Vergleichsstandardlösungen sind bei Raumtemperatur 8 h lang, bei einer Temperatur von 4°C mindestens 48 h lang stabil.It has been shown that the colored comparison standard according to the invention in lyophilized form at temperatures between 4 ° and 24 ° C is stable for at least 6 months. The lyophilized standard can be reprocessed dilute with water or 0.1N hydrochloric acid without further ado to the extent required for the installation of calibration curves is required for colorimetric enzymatic fixed point determinations. Recycled colored ones Calibration standard solutions last for 8 hours at room temperature and for at least 48 hours at 4 ° C stable.
Bei der Zubereitung eines stabilen farbigen Vergleichsstandards gemäß der Erfindung müssen die genannten verschiedenen Bestandteile in bestimmter Weise miteinanderWhen preparing a stable colored calibration standard according to the invention, the various mentioned Components in a certain way with each other
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vermischt werden, damit man ein zur Wiederaufbereitung nach der Gefriertrocknung "bzw. Lyophilisierung fähiges Produkt der erforderlichen Stabilität und Löslichkeit erhält. Diese Eigenschaften erreicht man, indem man zunächst das INT-Formazan vollständig in dem gewählten Lösungsmittel löst, dann unter gründlichem Vermischen Isopropanol zusetzt, das Serumalbumin in Wasser löst und die erhaltene Serumalbuminlösung unter Rühren langsam mit der INT-Formazanlösung versetzt. Vorzugsweise wird im Falle, daß der Vergleichsstandard lyophilisiert werden soll, der inerte Füllstoff zusammen mit dem SerumaTbumin in Wasser gelöst. Die fertige Lösung wird in aliquote Teile geteilt und nach einem üblichen Verfahren gefriergetrocknet oder lyophilisiert.be mixed together to make one available for reprocessing after freeze-drying "or lyophilization Obtains product of the required stability and solubility. These properties can be achieved by first the INT-formazan completely in the chosen solvent dissolves, then adds isopropanol with thorough mixing, dissolves the serum albumin in water and the The resulting serum albumin solution is slowly added to the INT formazan solution while stirring. Preferably im Case that the calibration standards are lyophilized should, the inert filler together with the SerumaTbumin dissolved in water. The finished solution is divided into aliquots divided and freeze-dried or lyophilized by a conventional method.
Zur Verwendung bei enzymatisehen Bestimmungen wird der lyophilisierte farbige Vergleichsstandard mit Wasser oder Ο,ΐη-Chlorwasserstoffsäure wieder aufbereitet. Die farbige Vergleichsstandardlösung dient als Standard bekannter Aktivität, gegen den die unbekannten Testproben zur Bestimmung der Enzymaktivität in der jeweiligen unbekannten Testprobe abgelesen v/erden. Wie bereits erwähnt, kann die farbige Vergleichsstandardlösung gemäß der Erfindung zur Aufstellung von Kurven für kolorimetrische enzymatische Festpunktbestimmungen verdünnt werden.For use in enzymatic determinations, the lyophilized colored comparison standard with water or Ο, ΐη-hydrochloric acid recycled. The colored one Calibration standard solution serves as a standard of known activity against which the unknown test samples are used Determine the enzyme activity in the respective unknown test sample. As mentioned earlier, can the colored comparison standard solution according to the invention for the preparation of curves for colorimetric enzymatic Fixed point determinations are diluted.
Ein farbiger Vergleichsstandard gemäß der Erfindung ist insbesondere in lyophilisierter Form hervorragend stabil und läßt sich nach seiner Wiederaufbereitung in höchst einfacher Weise bei den derzeit üblichen enzymatischen Bestimmungen zum Einsatz bringen.A colored comparison standard according to the invention is particularly stable in lyophilized form and can, after its reprocessing, be very easily carried out with the currently used enzymatic Bring provisions to use.
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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen. The following examples are intended to illustrate the invention in more detail.
Zubereitung der stabilen farbigen Vergleichsstandardlösung:Preparation of the stable colored comparison standard solution:
A. 12,3 mg INT-Formazan werden in 2,5 ml N,N'-Dimethylformamid gelöst, worauf die erhaltene Lösung unter gründlichem Vermischen mit 7,5 ml analysenreinen Isopropanols versetzt wird.A. 12.3 mg of INT-formazan are in 2.5 ml of N, N'-dimethylformamide dissolved, whereupon the resulting solution with thorough mixing with 7.5 ml of analytically pure isopropanol is moved.
B. 9,0 g Dextran eines Molekulargewichts von etwa 10000 und 56,3mg Rinderserumalbumin werden in 90 ml reinen Wassers gelöst.B. 9.0 g of dextran with a molecular weight of about 10,000 and 56.3 mg of bovine serum albumin are dissolved in 90 ml of pure water solved.
C. Die Lösung A wird langsam unter Rühren zu der Lösung B zugegeben. Die hierbei erhaltene Lösung wird in aliquoten Teilen von 4,0 ml in 10 ml fassende IfaLolen abgefüllt, gefroren und 36 h lang mit einem Stockpunkt von 300C lyophilisiert. Dann werden die Phiolen unter trockenem Stickstoff zugeschmolzen. Der Inhalt jeder Phiole wird mit 10 ml 0,1n-Chlorwasserstoffsäure wieder aufbereitet. Die Absorption bei 500 nm beträgt 1,340 - 0,010 entsprechend 540 IE Lactatdehydrogenaseaktivität bei 370C oder 420 IE Creatinphosphokinaseaktivität bei 300C.C. Solution A is slowly added to solution B with stirring. The solution thus obtained is dispensed in aliquots of 4.0 ml in 10-ml IfaLolen, frozen and lyophilized 36 long with a pour point of 30 0 C h. The vials are then sealed under dry nitrogen. The contents of each vial are reconstituted with 10 ml of 0.1N hydrochloric acid. The absorbance at 500 nm is 1.340 to 0.010 corresponding to 540 IU lactate dehydrogenase at 37 0 C or 420 IU Creatinphosphokinaseaktivität at 30 0 C.
Kolorimetrische Bestimmung der Serumlactatdehydrogenase:Colorimetric determination of serum lactate dehydrogenase:
Die für die Bestimmung erforderlichen Reagentien wurden wie folgt zubereitet:The reagents required for the determination were prepared as follows:
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Farbreagens: 50 mg INT wurden in etwa 15 ml Wasser gelöst, wobei solange gerührt wurde, bis eine vollständige Lösung des INT sichergestellt war. Nach Zugabe und Auflösung von 125 mg Nikotinsäureamidadenindinucleotid wurden 12,5 mg Phenazinmethosulfat zugesetzt. Die erhaltene Lösung wurde zusammen mit der verwendeten Waschflüssigkeit sofort in einen niedrigaktinischen 25 ml fassenden Meßkolben überführt und mit Wasser bis zur Marke aufgefüllt.Color reagent: 50 mg INT were dissolved in about 15 ml water, stirring was continued until complete dissolution of the INT was ensured. After adding and dissolving 125 mg of nicotinic acid amide adenine dinucleotide was 12.5 mg Phenazine methosulfate added. The solution obtained was Immediately transferred together with the washing liquid used into a low-actinic 25 ml volumetric flask and filled up to the mark with water.
Pufferreagens: 1,0 g eines handelsüblichen äthoxylierten Oleylalkohols wurde in 10 ml Wasser unter Erhitzen auf eine Temperatur von etwa 95°C gelöst. Nach Verdünnen der Lösung mit Wasser auf 50 ml wurden 12,1 g Tris zugesetzt. Hierauf wurde der pH-Wert mit 3n-HCl auf 8,2 eingestellt und das Ganze auf 100 ml verdünnt.Buffer reagent: 1.0 g of a commercially available ethoxylated oleyl alcohol was dissolved in 10 ml of water with heating to a Dissolved at a temperature of about 95 ° C. After diluting the solution to 50 ml with water, 12.1 g of Tris were added. On that the pH was adjusted to 8.2 with 3N HCl and the whole was diluted to 100 ml.
Substratreagens: (0,1m L(+)Lactat) 5,0 ml einer 20%igen Lösung von L(+)-Milchsäure wurden in etwa 50 ml Wasser eingetragen. Nach Einstellen des pH-Werts auf 5,5 mit 1n-NaOH wurde mit Wasser auf 120 ml verdünnt. Hierauf wurde die Lösung mit einigen wenigen Tropfen Chloroform gesättigt.Substrate reagent: (0.1m L (+) lactate) 5.0 ml of a 20% Solutions of L (+) - lactic acid were added to about 50 ml of water. After adjusting the pH to 5.5 with 1N NaOH was diluted to 120 ml with water. The solution was then saturated with a few drops of chloroform.
Vergleichsreagens: 0,2 g Kaliumoxalat und 0,2 g'Äthylendiamintetraessigsäure, Dinatriumdihydrat, wurden in 100 ml Wasser gelöst. Vgl. Babson und Mitarbeiter in "Clin. Chim. Acta», Band 12, Seiten 210 bis 215 (1965).Comparative reagent: 0.2 g of potassium oxalate and 0.2 g of ethylenediaminetetraacetic acid, Disodium dihydrate was dissolved in 100 ml of water. See Babson et al., Clin. Chim. Acta », Volume 12, pages 210 to 215 (1965).
Verfahren:Procedure:
In zwei Röhrchen wurden 0,1 ml Serum und 0,2 ml Pufferreagens pipettiert. In ein Röhrchen wurde 0,5 ml Substrat, in das andere Röhrchen 0,5 ml Vergleichsreagens eingetragen,0.1 ml of serum and 0.2 ml of buffer reagent were pipetted into two tubes. In a tube was 0.5 ml of substrate, put 0.5 ml comparison reagent in the other tube,
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Dann wurde der Inhalt der beiden Röhrchen durchgemischt und auf eine Temperatur von 370C erwärmt. Nach genau bestimmten Zeitintervallen wurde in beide Röhrchen 0,2 ml Farbreagens eingetragen, worauf der Röhrcheninhalt gemischt und die Röhrchen sofort wieder in das Wasserbad zurückgestellt wurden. Genau 5 min nach Zugabe des Farbreagenses wurden in beide Röhrchen 5 ml 0,In-HCl zugegeben, worauf der Röhrcheninhalt gemischt wurde. Der Unterschied in der Absorption zwischen dem Vergleichsröhrchen und dem die Serumprobe enthaltenden Röhrchen, bestimmt bei 500 nm innerhalb von 20 min, betrug 0,67. Diese Absorption wurde mit dem farbigen Vergleichsstandard von Beispiel 1, dessen Absorption von 1,340 - 0,010 540 IE Lactatdehydrogenaseaktivitäteinheiten äquivalent war, verglichen. Daraus ergab sich, daß die Lactatdehydrogenaseaktivität in dem getesteten Serum bei 37°C 270 IE betrug.Then, the content of the tube was mixed and heated to a temperature of 37 0 C. After precisely defined time intervals, 0.2 ml of color reagent was added to both tubes, whereupon the tube contents were mixed and the tubes were immediately returned to the water bath. Exactly 5 minutes after the addition of the color reagent, 5 ml of 0, In-HCl were added to both tubes, whereupon the tube contents were mixed. The difference in absorbance between the control tube and the tube containing the serum sample, determined at 500 nm within 20 minutes, was 0.67. This absorbance was compared with the color standard of Example 1, the absorption of 1.340 - compared was equivalent 0,010 540 IE Lactatdehydrogenaseaktivitäteinheiten. As a result, the lactate dehydrogenase activity in the tested serum at 37 ° C was 270 IU.
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Claims (12)
wird, dadurch gekennzeichnet, daß man7. Process for the preparation of a colored calibration standard for use in diagnostic determinations of enzymatic reactions in which 1- (p-iodophenyl) -5- (p-nitrophenyl) -3-phenylformazan is formed
is characterized in that one
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