CH664160A5 - Reattivo liquido pronto per l'uso per la determinazione del contenuto di glucosio nel sangue. - Google Patents

Description

DESCRIZIONE La presente invenzione si riferisce ad un reattivo liquido pronto per l'uso per la determinazione del contenuto di glucosio nel sangue. Più in particolare l'invenzione concerne un reattivo liquido stabile nel tempo, in una unica confezione pronta per l'uso, a base di glucosio-ossidasi esente da catalasi e di un tensioattivo non ionico.

Come è noto, i metodi più semplici e largamente utilizzati per la determinazione del contenuto di glucosio nel sangue (plasma o siero), sono basati sul metodo Trinder o su variazioni dello stesso.

Il contenuto di glucosio può essere determinato per mezzo della glucosio-ossidasi e della reazione colorata di Trinder, procedendo nel modo seguente:

1) a-D-glucopiranosio + H2O ^ al-D-glucosio...H20 ^ ß-D-

(36%) (<0,1%)

glucopiranosio + H2O (64%)

glucosio-ossidasi

2) ß-D-glucopiranosio + H2O + O2 ^ D-glu-

cono-5-lattone + H2O2

perossidasi

3) 2H2O2 + fenolo + 4-amminofenazone > 4-(p-

-benzochinone-monoimino)-fenazone + 4H2O.

Il reattivo è composto da due parti:

a) una parte enzimatica (glucosio-ossidasi-perossidasi) opportunamente tamponata;

b) un cromogeno, 4-aminofenazone più fenolo (quest'ultimo può essere sostituito da suoi derivati, da cui le modifiche al metodo originale di Trinder, che usò per primo il fenolo).

Tutti i reattivi derivati da questo metodo devono essere ricostituiti al momento dell'uso in un unico reattivo di lavoro, la cui stabilità, una volta ricostituito, è limitata nel tempo.

È da osservare che tale reattivo, una volta ricostituito, ha l'inconveniente di una data di scadenza, garantita, non superiore ai 60 giorni e mediamente di circa 30 giorni.

Attualmente sono noti due metodi di ricostituzione del reattivo di lavoro:

I) per aggiunta di acqua ad un sistema già completo di enzimi-cromogeno;

II) per miscelazione della parte enzimatica con il cromogeno, che in questo caso sono mantenuti separati.

Tuttavia, in tutti i casi, esiste sempre una manipolazione da parte dell'utente. Questa operazione per quanto semplice, può essere frequentemente causa di errore, in quanto, nella preparazione del reattivo possono insorgere inconvenienti tecnici che pregiudicano la validità del sistema.

Nel caso I, quando si ricostituisce il reattivo di lavóro, occorre disporre di acqua distillata di una purezza tale diffìcilmente riscontrabile nei laboratori di analisi in cui spesso si dispone di acqua deionizzata e quindi non del tutto esente dal cloro (problema assai diffuso specialmente nei periodi estivi).

Nel caso II, si può incorrere in una perdita durante il travaso, di una parte di uno dei due reagenti, dovuta ad una possibi-le fuoriuscita di uno di essi o, come avviene più frequentemen--te, al fatto che uno dei reagenti non venga completamente sgrondato dal suo flacone.

In tale eventualità, il reattivo di lavoro può presentare una concentrazione finale diversa da quella desiderata.

Questo inconveniente si presenta anche quando la procedura adottata non permette di ottenere una completa miscela tra il soluto ed il solvente, come accade di frequente se l'enzima viene fornito allo stato di polvere anidra assieme al tampone, che, essendo spesso un tampone fosfato, è poco solubile.

Sempre nel caso in cui si fa ricorso, come di frequènte avviene, a reattivi in polvere, è da tener presente che l'intervallo ammissibile di dosaggio delle polveri è molto alto, e che una conseguente non corretta omogeneità si può manifestare anche per lo stesso lotto di preparazione. Questo è ancora più evidente se si usano enzimi allo stato liofilo, in quanto, come è noto, il processo di liofilizzazione tende a ridurre l'attività enzimatica in maniera spesso eterogenea e casuale (certamente influisce la posizione del singolo flaconcino rispetto al posto che occupa nelle piastre durante la fase di congelamento), per cui le concentrazioni finali (come attività enzimatiche) possono essere molto diverse tra di loro.

Oltre a questa serie di inconvenienti tecnici sulla affidabilità del sistema, i reattivi fino ad oggi impiegati hanno un costo di produzione elevato.

I metodi attuali di produzione prevedono due soluzioni:

a) polveri anidre;

b) liofili.

Nel caso a) la produzione richiede particolari ambienti ad umidità controllata, con impianti costosi nei quali gli operatori sono esposti a gravi rischi dovuti alle condizioni di lavoro molto critiche. Infatti, l'utilizzazione di questi enzimi come polveri, ed in particolare la preseza di sodio azide e dei vari tamponi, provoca sull'organismo degli addetti ai lavori, se esposti per periodi prolungati, danni anche irreversibili alle vie respiratorie. Inoltre, è stato riscontrato che alcune persone, dopo anni di questo lavoro, finiscono con il sensibilizzarsi a detti enzimi, con le conseguenze che ne conseguono.

Nel caso b), l'utilizzazione dei liofilizzatori richiede un forte consumo energetico di corrente ed una elevata quantità di acqua, oltre al costo di ammortamento degli impianti.

È pertanto bene evidente l'importanza di poter disporre di un reattivo per la determinazione di glucosio nel sangue che eviti le delicate operazioni per la ricostituzione precedentemente menzionate, tecniche di produzione di costo notevole non esenti da rischi per il personale addetto alla produzione, nonché i lunghi valori di lead-time (tempo minimo di approntamento del reattivo).

Per la soluzione di questo problema viene ora sorprendentemente proposto in questa invenzione di impiegare come reattivo una glucosio-ossidasi (GOD) del tutto esente da catalasi, in combinazione di agenti stabilizzanti costituiti da tensio attivi non ionici.

Questa combinazione permette di ottenere infatti un reattivo liquido unitario pronto per l'immediata utilizzazione e stabile nel tempo.

In modo vantaggioso esso presenta omogeneità di concentrazione di attività enzimatiche dei singoli componenti. Infatti,

s io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

664 160

la velocità di reazione, esprimibile come ——

A A

At

• dei cromogenó

colorato (A = assorbanza o estinzione), è in particolar modo u.i.

collegata al rapporto di glucosio-ossidasi, in cui u.i. è,

litro come è noto, la quantità di enzima che ossida una limole di glucosio per minuto a 25°C e pH = 7 (tampone sodio fosfato).

È da osservare a questo proposito che'nei reattivi attualmente in commercio, aache fra flaconi dello stesso lotto, sono presenti variazioni, anche notevoli, delle attività enzimatiche, cosa che rende problematica la tecnica nota come «Fixed Time», correttamente applicabile con un reattivo come quello secondo l'invenzione in cui è garantita la ripetitibilità fra flacone e flacone.

Infatti, per una giusta messa a punto di tale tecnica, occorre che l'ossidazione del glucosio da parte della GOD segua una cinetica di pseudo-primo ordine rispetto al ß-glucosio.

Questo determina una serie di reazioni accoppiate, a cui si può applicare il principio della cinetica delle misure a tempo prefissato.

Al reattivo secondo l'invenzione può essere applicata anche tale tecnica. Questo lo rende particolarmente vantaggioso per gli analizzatori veloci che consentono grande risparmio di tempo.

Forma quindi oggetto specifico di questa invenzione un reattivo liquido pronto per l'uso per la determinazione del contenuto di glucosio nel sangue, caratterizzato dal fatto di comprendere una glucosio-ossidasi esente da catalasi ed un tensioattivo non ionico come stabilizzante.

In una forma di realizzazione preferita secondo l'invenzione viene utilizzato lin quantitativo di glucosio-ossidasi variabile tra 900Ó e 40.000 u.i./l e un quantitativo del tensioattivo non ionico variabile tra 5 mg/I e 50 g/1.

Secondo l'invenzione vengono di preferenza utilizzati i seguenti tensioattivi non ionici a base di poliossietilene (POE), ad esempio POE-tridecil alcool, POE-nonilfenolo, ecc. (RENEX), POE-ottilfenolo (TRITON) e POE-lauril-, cetil-, stearil-, oleil-alcool (Brij).

Analogamente si ottengono ottimi risultati impiegando, come tensioattivo, l'idrossi-polietilen-etossidodecano (C12H25--(0-C2H4)n-0H, o etere laurilico del polietilenglicol (Thesit).

È interessante come l'assenza della catalasi non era, nè da Trinder nè dagli altri, presa in considerazione.

A titolo illustrativo, ma non limitativo, vengono ora riportate le seguenti preparazioni:

In questa preparazione si è usato come tensioattivo il Brij-35, POE-lauril-alcool, nella concentrazione compresa tra 5 mg/1 e 50 g/1.

Preparazione A GOD

perossidasi

4-aminoantipirina fenolo tampone fosfato

Dosi relative a mi 1000 di reattivo

9000-40.000 u.i.

300-3000 u.i.

0,1-1,5 mmoli 1,5-15,5 mmoli pH 6,5-11,4.

s Preparazione B GOD

perossidasi 4-aminoantipirina fenolo 10 tampone fosfato

Dosi relative a mi 1000 di reattivo

9000-40.000 u.i.

300-3000 u.i.

0,1-1,5 mmoli 1,5-15,5 mmoli pH 6,5-11,4.

In questa preparazione si è usato come tensioattivo il Triton X100, Poe-ottil-fenolo, nella concentrazione compresa tra 5 mg/1 e 50 g/1.

15 Come possibile vedere nell'allegato grafico (figura 1), in cui in ordinate sono riportati i valori della assorbanza ed in ascisse i tempi di reazione, la cinetica di reazione per le preparazioni A e B, misurata su Perkin Elmer, che si ottiene, è perfettamente identica al variare del tensioattivo utilizzato.

20 Ai fini della costanza della qualità del prodotto in funzione del tempo, si riporta nel grafico di figura 2 l'andamento dell'as-sorbanza per un campione di reattivo del tipo usato per la preparazione A, preparato nel febbraio del 1983 e provato nel gennaio del 1984.

25 Oltre a notare come l'andamento sia perfetto pure in concentrazione elevate (500 mg/dl), è da considerare che la reazione va correttamente a termine nei 10 minuti previsti.

Questo risultato è stato ottenuto con un lotto di reattivo come precedentemente specificato conservato, durante detto pe-3o riodo, in prova di stress (ossia si è usato un recipiente trasparente e non opaco come richiesto, e detto flacone è stato sovente aperto e richiuso).

Da notare che l'assorbanza del bianco contro H2O è solo di 0,128, valore più che accettabile considerando anche il fatto che 35 tale reattivo aumenta la propria assorbanza sotto l'azione diretta della luce.

Sperimentazione tecnica

Una dimostrazione grafica relativa al prodotto citato per il 40 grafico di figura 2 è riportata nel diagramma di figura 3 in cui, in ordinate, sono riportati i valori della assorbanza (A) in funzione della concentrazione (c.St.) dello standard usato (ascisse).

Risulta evidentemente dimostrata la perfetta linearità del reattivo fino ad una concentrazione massima di 500 mg/dl. 45 Tale retta è stata elaborata dal computer utilizzando una serie di standard di 25, 50, 100, 200, 400, 500 mg/dl.

Il rapporto tra reattivo e campione è stato di 1000 jil/10 p.1: il tempo di reazione è stato di 10 minuti. Il colore rimane stabile per circa 1 ora.

50 La presente invenzione è stata descritta con particolare riferimento ad alcune sue forme specifiche di realizzazione ma è da intendersi che modifiche e variazioni potranno essere apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione.

v

3 fogli disegni

Claims (5)

664 160

1. Reattivo liquido pronto per l'uso per la determinazione del contenuto di glucosio nel sangue caratterizzato dal fatto di comprendere una glucosio-ossidasi esente da catalasi ed un tensioattivo non ionico come stabilizzante.

2. Reattivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta glucosio-ossidasi è presente in una quantità variabile tra 9000 e 40.000 u.i./l e detto tensioattivo non ionico è presente in una quantità variabile tra 5 mg/1 e 50 g/1.

2

RIVENDICAZIONI

3. Reattivo secondo le rivendicazioni 1 e 2 caratterizzato dal fatto che detti tensioattivi non ionici sono a base di poliossieti-lene.

4. Reattivo secondo la rivendicazione 3 in cui detto tensioattivo non ionico a base di poliossietilene è POE-lauril-alcool.

5. Reattivo secondo la rivendicazione 3 in cui detto tensioattivo non ionico a base di poliossietilene è POE-ottilfenolo.