LU85734A1 - Reactif liquide pret a l'emploi en vue de determiner la teneur en glucose dans le sang - Google Patents

Reactif liquide pret a l'emploi en vue de determiner la teneur en glucose dans le sang Download PDF

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Description

. > * Réactif liquide prêt à l'emploi en vue de déterminer la teneur en glucose dans le sang.
La présente invention concerne un réactif liquide prêt à l'emploi en vue de déterminer la 5 teneur en glucose dans le sang. Plus particulièrement, l'invention concerne un réactif liquide stable en une seule trousse prête à l'emploi, ce réactif comprenant une oxydase de glucose exempte de catalase, ainsi qu'un agent tensio-actif non ionique.
10 On sait que les méthodes les plus simples et les plus utilisées pour déterminer la teneur en glucose dans le sang (plasma ou sérum) sont basées sur la méthode de Trinder ou sur des variantes de cette méthode.
» 15 La teneur en glucose dans le sang peut être déterminée au moyen de l'oxydase de glucose et de la réaction colorée de Trinder conformément aux étapes suivantes : 1) (X -D-glucopyranôse + H20 al-D-glucose...HgO «-- 20 (36%) ' «0,1%) ß-D-glucopyranose + Η,,Ο (64%) 2) ß-D-glucopyranose + H20+02 gluCose~-°Xy--ase> D-glucono- ^-lactone + H202.
25 3) 2H202 + phénol + 4-aminophénazone Eero.ix:.y(^Q-.se> 4_ (p-benzoquinone-mono-imino)-phénazone + 4H20.
Le réactif .est constitué de deux composants : a) un composant enzymatique judicieusement tamponné (oxydase de glucose/peroxydase) ; 30 -b) un chromogène, spécifiquement, la 4- aminophénazone plus le phénol (ce dernier peut être remplacé par ses dérivés, d'où les variantes de la méthode originale introduite par Trinder qui a utilisé pour la première fois le phénol).
L
, > 2 * ^
Tous les réactifs employés selon cette • méthode doivent être reconstitués au moment de leur utilisation en un seul réactif opératoire ayant, lorsqu'il est reconstitué, une stabilité limitée.
5 II est à noter que, lorsqu'il est recons titué, un tel réactif présente l'inconvénient d'avoir une date de péremption garantie ne dépassant pas 60 jours et, en moyenne, d'environ 30 jours.
Actuellement, on connaît deux méthodes en 10 vue de reconstituer le réactif opératoire : I) en ajoutant de l'eau à un système préalablement mélangé d'enzymes/chromogène ; II) en mélangeant le composant enzymatique et le chromogène qui, dans ce cas, ont été conservés 15 séparément.
Toutefois, dans tous les cas, l'utilisateur doit manipuler le produit. Même si elle est simple, cette opération donne fréquemment lieu à des erreurs car, lors de la préparation du réactif, certains 20 problèmes techniques altérant la validité du système peuvent se poser.
Dans le cas I, lorsque le réactif opératoire est reconstitué, il faut de l’eau distillée de haute pureté, tandis que l'eau déminéralisée et non complè-25 tement exempte de chlore est uniquement disponible dans des laboratoires pour des essais cliniques (inconvénient habituel, en particulier, en été).
Dans le cas II, au cours de l'étape de déversement, on ne peut éviter une perte d’un des 30 deux réactifs 'par suite du débordement possible de l'un d'eux ou, plus fréquemment, par suite de l'écoulement goutte à goutte incomplet d'un des réactifs hors de son flacon.
Dans ce cas, le réactif opératoire a souvent 35 une concentration finale différente de celle désirée.
/ > 3 Λ \
On rencontre également cet inconvénient . lorsque le procédé adopté ne permet pas d'obtenir un mélange complet du soluté et du solvant comme cela se produit fréquemment si l'enzyme est fournie 5 sous forme d'une poudre anhydre conjointement avec le tampon (très souvent un tampon de phosphate) qui est légèrement soluble.
Lorsqu'on utilise des réactifs en poudre, comme c’est fréquemment le cas, il faut tenir compte 10 du fait que la proportion des ingrédients de la poudre peut se situer dans un très large intervalle et qu'il peut en résulter une homogénéité incomplète, même dans le même lot de préparations. Cette caractéristique est plus évidente encore lorsqu'on utilise 15 des enzymes lyophilisées car, comme on le sait, le processus de lyophilisation peut souvent réduire fortuitement et de manière hétérogène l'activité enzymatique (uniquement la position du flacon sur les plaques au cours de l'étape de congélation exer-20 ce sûrement une influence), si bien que les concentrations finales (activité enzymatique) peuvent être très différentes l'une de l'autre. Outre ces inconvénients techniques altérant la fiabilité du système, les réactifs utilisés jusqu'à présent entraînent des 25 frais de fabrication très élevés.
Les procédés de production actuels englobent deux possibilités : a) poudres anhydres b) produits lyophilisés.
30 Dans le cas a), la production nécessite un local-spécial dont l'humidité est contrôlée, ainsi que des installations coûteuses dans lesquelles les opérateurs sont exposés à des risques sérieux en raison des conditions de travail pénibles et ce, par 35 suite de l'utilisation des enzymes sous forme de pou- / .
» J
4 Λ dres ; en particulier, la présence d'azide de sodium et des différents tampons peut provoquer, parfois de manière irréversible, des lésions des organes respiratoires des opérateurs, si ceux-ci sont exposés 5 pendant une longue période. De plus, il est à noter qu'après avoir effectué ce travail pendant quelques années, certaines personnes sont sensibilisées à ces enzymes et qu’elles sont sujettes à des lésions conséquentes .
10 Dans le cas b), l'utilisation de produits lyophilisés exige d'importantes quantités d'énergie électrique et d’eau, sans compter les frais d'extinction des installations.
En conséquence, on reconnaît nettement 15 l'importance de disposer, en vue de déterminer la teneur en glucose dans le sang, d'un réactif permettant d'éviter les opérations délicates précitées de reconstitution, les techniques de production coûteuses qui peuvent également être dangereuses pour le per-20 sonnel, de même que les longues durées de préparation (temps minimum pour la constitution du réactif).
Pour résoudre ce problème, de façon surprenante, suivant la présente invention, on propose d'utiliser, comme réactif, une oxydase de glucose 25 (GOD) complètement exempte de catalase, en combinaison avec des stabilisants constitués d'agents tensio-actifs non ioniques.
Cette combinaison fournit un réactif liquide unitaire et stable prêt à l'emploi. La concentration 30 homogène des activités enzymatiques simples des composants semble être particulièrement favorable, car
la vitesse réactionnelle (qui peut être exprimée par Δ A
==-r (A = capacité d'absorption ou extinction)) du Δ ^ chromogène coloré est en relation particulière avec 35 le rapport u.i/litre d'oxydase de glucose, rapport / * 5 * dans lequel u.i représente, comme on le sait, la quantité d'enzyme qui oxyde 1 ^mole de glucose par minute à 25°C et à un pH de 7 (tampon de phosphate de sodium).
5 A cet égard, il convient d'observer que, dans les réactifs actuellement sur le marché et parmi des flacons du même lot également, on peut trouver des différences parfois remarquables dans les activités enzymatiques. En conséquence, il se pose cer-10 tains problèmes dans la technique connue sous le nom de "temps fixe", technique que l'on peut effectuer correctement avec un réactif analogue à celui de la présente invention dont l'invariabilité entre flacons est assurée.
15 Pour une mise en oeuvre correcte de cette technique, il est nécessaire que l'oxydation du glucose par "GOD" suive une pseudo-cinétique de premier ordre vis-à-vis du ß-glucose.
Il en résulte une série de réactions cou-20 plées auxquelles on peut appliquer le principe cinétique des mesures de temps fixe.
La technique précitée peut être appliquée au réactif suivant la présente invention, ce qui le rend particulièrement approprié pour des analyses 25 rapides en ayant la possibilité de réaliser un important gain de temps.
En conséquence, un objet spécifique de la présente invention est un réactif liquide prêt à l'emploi en vue de déterminer la teneur en glucose 30 dans le sang, ce réactif étant caractérisé en ce qu’il comprend une oxydase de glucose exempte de catalase, ainsi qu'un agent tensio-actif non ionique comme stabilisant. Dans une forme de réalisation préférée selon l'invention, on utilise une oxydase 35 de glucose en une quantité de 9.000 à 40.000 u.i/litre
L
6 t * ^ et un agent tensio-actif non ionique en une quantité de 5 mg à 50 g/litre ; de préférence, on emploie les agents tensio-actifs non ioniques de polyoxyéthylène (POE) ci-après : l’alcool POE-tridécylique, le P0E-5 nonylphénol, etc. (RENEX), le POE-octylphénol (TRITON), de même que les alcools POE-laurylique, -cétylique, -stéarylique et -oléylique (BRIJ).
De même, oh obtient de très bons résultats en utilisant, comme agent tensio-actif, l'hydroxy-10 polyéthylène-éthoxydodécane (Ci2H25~^°*"C2H4^n-0H
ou l'éther laurylique de polyoxyéthylène-glycol (THESIT).
Il convient de souligner que l'absence de catalase n'a été prise en considération ni par 15 Trinder, ni par d'autres auteurs.
A titre d'illustration et sans aucun caractère limitatif, on décrira à présent les compositions suivantes :
Composition A Quantités rapportées à 1.000 20 _ ml du réactif_ GOD 9.000-40.000 U.i
Peroxydase 300-3.000 u.i 4-amino-antipyrine 0,1-1,5 millimole
Phénol 1,5-15,5 millimoles 25 Tampon de phosphate pH : 6,5-11,4
Dans cette composition, comme agent tensio-actif, on a utilisé l'alcool POE-laurylique (Brij 35) en une concentration de 5 mg à 50 g/litre.
Composition B Quantités rapportées à 1.000 30 _;_ ml du réactif_ GOD 9.000-40.000 u.i
Peroxydase 300-3.000 u.i 4-amino-antipyrine 0,1-1,5 millimole
Phénol < 1,5-15,5 millimoles 35 Tampon de phosphate pH : 6,5-11,4 /_ i I, > 7 * λ
Dans cette composition, comme agent tensio-actif, on a utilisé le POE-octylphénol (Triton-X100) en une concentration de 5 mg à 50 g/litre.
Ainsi qu'on peut le constater d'après le 5 diagramme annexé (figure 1) dans lequel on trace une courbe des valeurs de la capacité d'absorption vis-à-vis des temps de réaction, la cinétique réactionnelle obtenue pour les compositions A et B, mesurée avec l'appareil de Perkin-Elmer, est exactement 10 semblable lorsqu'on change l'agent tensio-actif utilisé.
Afin de démontrer l'inaltérabilité de la qualité du produit, le diagramme de la figure 2 illustre la capacité d'absorption d'un échantillon de 15 réactif du type utilisé dans la composition A, préparé en février 1983 et soumis à des essais en janvier 1984.
Outre le fait de noter la façon dont la courbe est conforme à la théorie même à une concen-20 tration élevée (500 mg/dl), il convient de prendre en considération que la réaction est effectuée complètement endéans la période estimée de 10 minutes.
Ce résultat a été obtenu en utilisant un lot de réactifs du type décrit ci-dessus que l'on 25 a conservé au cours de cette période dans des conditions d’essai de contrainte (en fait, on a utilisé un récipient transparent en lieu et place du récipient opaque habituellement requis, tandis que l'on a très souvent ouvert et refermé ce récipient). Il 30 est également à noter que la capacité d'absorption du blanc vis-à-vis de HgO n'est que de 0,128, c'est-à-dire une valeur parfaitement acceptable dès l'instant où, en plus, la capacité d'absorption d'un tel réactif augmente sous l'action directe de la 35 lumière .*
L
V > * .
f 8
EXPERIENCE TECHNIQUE
Une démonstration graphique pertinente au produit cité pour le diagramme de la figure 2 est donnée en figure 3 qui est un graphique de la capa-5 cité d'absorption (A) en fonction de la concentration (c.St.) de l'étalon utilisé (abscisse).
Ce diagramme montre clairement la linéarité parfaite du réactif jusqu'à une concentration maximale de 500 mg/litre.
10 Cette ligne droite a été tracée par l'or dinateur en utilisant une série d'étalons de 25, 50, 100, 200, 400 et 500 mg/litre.
La proportion du réactif vis-à-vis de l'échantillon était de 1.000 yilitre$/10 yulitrès ; le 15 temps de réaction était de 10 minutes. La couleur est restée stable pendant environ 1 heure.
La présente invention a été décrite en se référant, en particulier, à certaines formes de réalisation spécifiques, mais il est entendu que des 20 modifications et des changements peuvent être apportés dans la description ci-dessus par l'homme de métier sans se départir de son esprit et de son cadre réels.
Ά i *

Claims (6)

1. Réactif liquide prêt à l’emploi en Ivue de déterminer la teneur en glucose dans le sang, caractérisé en ce qu’il comprend une oxydase de glu-5 cose exempte de catalase et un agent tensio-actif non ionique comme stabilisant.
2. Réactif liquide prêt à l'emploi en vue de déterminer la teneur en glucose dans le sang, caractérisé en ce que l'oxydase de glucose est pré-10 sente en une quantité se situant dans l'intervalle allant de 9.000 à 40.000 u.i./litre, tandis que l'agent tensio-actif non ionique est présent en une quantité se situant dans l'intervalle allant de 5 mg à 50 g/litre. » 15
3. Réactif liquide prêt à l'emploi en vue de déterminer la teneur en glucose dans le sang selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les agents tensio-actifs non ioniques sont des agents H tensio-actifs de polyoxyéthylène. 20
4. Réactif liquide prêt à l'emploi en vue de déterminer la teneur en glucose dans le sang selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent tensio-actif non ionique de polyoxyéthylène est l'alcool POE-laurylique. 25
5. Réactif liquide prêt à l'emploi en vue de déterminer la teneur en glucose dans le sang selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent tensio-actif non ionique de polyoxyéthylène est le POE-octylphénol. 30
6. Réactif liquide prêt à l'emploi en vue de déterminer la teneur en glucose dans le sang selon l'une quelconque des revendications précédentes, en substance comme décrit et revendiqué dans la présente \ spécification. X.K i
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