JPH07151761A - 血液試料または血液由来の試料中のフルクトサミン含量を測定するための試薬と方法 - Google Patents
血液試料または血液由来の試料中のフルクトサミン含量を測定するための試薬と方法Info
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- JPH07151761A JPH07151761A JP6174522A JP17452294A JPH07151761A JP H07151761 A JPH07151761 A JP H07151761A JP 6174522 A JP6174522 A JP 6174522A JP 17452294 A JP17452294 A JP 17452294A JP H07151761 A JPH07151761 A JP H07151761A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 血液試料中または血液から誘導した試料中の
フルクトサミン含量を測定するための試薬と方法が開示
される。 【構成】 前記試薬のセットは２種類のすぐ使用できる
安定な液体試薬を含んで成り、第一の液体試薬はほぼ中
性のｐＨを有し、且つアルカリ性ｐＨ条件下でフルクト
サミンにより還元されて変色する変色試薬、試料の非特
異的還元成分および／または濁り誘発成分を除去するた
めの試薬、並びに場合により他の常用の添加剤を含有
し、そして第二の液体試薬は塩基性緩衝剤を含有する。
フルクトサミン含量を測定するための試薬と方法が開示
される。 【構成】 前記試薬のセットは２種類のすぐ使用できる
安定な液体試薬を含んで成り、第一の液体試薬はほぼ中
性のｐＨを有し、且つアルカリ性ｐＨ条件下でフルクト
サミンにより還元されて変色する変色試薬、試料の非特
異的還元成分および／または濁り誘発成分を除去するた
めの試薬、並びに場合により他の常用の添加剤を含有
し、そして第二の液体試薬は塩基性緩衝剤を含有する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血液試料または血液由
来の試料中のフルクトサミン含量を測定するための試薬
のセットであって、前記試薬のセットは２種類のすぐ使
用できる安定な液体試薬を含んで成り、第一の液体試薬
はほぼ中性のｐＨを有し、且つアルカリ性ｐＨ条件下で
フルクトサミンにより還元されて変色する変色試薬、試
料の非特異的還元成分および／または濁り発生成分を除
去するための試薬、並びに場合により他の常用の添加剤
を含有し、そして第二の液体試薬は塩基性緩衝剤を含有
する、前記試薬のセットに関する。
来の試料中のフルクトサミン含量を測定するための試薬
のセットであって、前記試薬のセットは２種類のすぐ使
用できる安定な液体試薬を含んで成り、第一の液体試薬
はほぼ中性のｐＨを有し、且つアルカリ性ｐＨ条件下で
フルクトサミンにより還元されて変色する変色試薬、試
料の非特異的還元成分および／または濁り発生成分を除
去するための試薬、並びに場合により他の常用の添加剤
を含有し、そして第二の液体試薬は塩基性緩衝剤を含有
する、前記試薬のセットに関する。
【０００２】本発明はまた、血液試料または血液由来の
試料中のフルクトサミン含量を測定する方法およびその
ような方法における前記試薬のセットの利用法に関す
る。「フルクトサミン含量」なる語句は、タンパク質に
安定に結合した非酵素的グリコシル化の総含有量を意味
する。一定期間に渡る平均グルコースレベルを表すこの
パラメーターは、糖尿病において代謝制御を監視するの
に有用である。
試料中のフルクトサミン含量を測定する方法およびその
ような方法における前記試薬のセットの利用法に関す
る。「フルクトサミン含量」なる語句は、タンパク質に
安定に結合した非酵素的グリコシル化の総含有量を意味
する。一定期間に渡る平均グルコースレベルを表すこの
パラメーターは、糖尿病において代謝制御を監視するの
に有用である。
【０００３】「非特異的還元成分」なる語句は、アルカ
リ性ｐＨ条件下で変色試薬を還元することのできるフル
クトサミン以外の血液成分を意味する。そのような成分
は、ビリルビン、尿酸および遊離チオール基を含有する
タンパク質、並びにビタミン類、例えばアスコルビン
酸、薬剤の代謝物、例えばアセチルサリチル酸の代謝物
である２，５−ジヒドロ安息香酸であり得る。「濁り発
生成分」なる語句は、試料の濁りを引き起こし得る水不
溶性血液成分、例えば脂質、を意味する。
リ性ｐＨ条件下で変色試薬を還元することのできるフル
クトサミン以外の血液成分を意味する。そのような成分
は、ビリルビン、尿酸および遊離チオール基を含有する
タンパク質、並びにビタミン類、例えばアスコルビン
酸、薬剤の代謝物、例えばアセチルサリチル酸の代謝物
である２，５−ジヒドロ安息香酸であり得る。「濁り発
生成分」なる語句は、試料の濁りを引き起こし得る水不
溶性血液成分、例えば脂質、を意味する。
【０００４】
【従来の技術】欧州特許第85 263号は、血清試料中のフ
ルクトサミン含量の簡単な測定方法を記載している。こ
の方法は、アルカリ性溶液中でのフクルトサミンがテト
ラゾリウム塩、例えばニトロブルーテトラゾリウム（Ｎ
ＴＢ）に対する還元剤として作用するエネアミノールを
形成し、それによって測光学的に測定することのできる
色の変化を引き起こし、限定された時間間隔において測
定される色の変化は当フルクトサミンの量に比例すると
いう事実に基づいている。
ルクトサミン含量の簡単な測定方法を記載している。こ
の方法は、アルカリ性溶液中でのフクルトサミンがテト
ラゾリウム塩、例えばニトロブルーテトラゾリウム（Ｎ
ＴＢ）に対する還元剤として作用するエネアミノールを
形成し、それによって測光学的に測定することのできる
色の変化を引き起こし、限定された時間間隔において測
定される色の変化は当フルクトサミンの量に比例すると
いう事実に基づいている。
【０００５】しかし、この方法は多数の欠点を有する。
特に試料原料として血清を使用する時、問題が起こり得
る。何故なら、他の血清成分、例えばビリルビン、尿酸
または遊離チオール基を有するタンパク質もまた、変色
試薬に対する還元剤として作用するからである。他に
も、脂質は高濃度で存在すると試料の濁りを引き起こす
ことがあり、ことによると測光に悪影響を及ぼし、フル
クトサミン含量の測定を困難にするかもしれない。
特に試料原料として血清を使用する時、問題が起こり得
る。何故なら、他の血清成分、例えばビリルビン、尿酸
または遊離チオール基を有するタンパク質もまた、変色
試薬に対する還元剤として作用するからである。他に
も、脂質は高濃度で存在すると試料の濁りを引き起こす
ことがあり、ことによると測光に悪影響を及ぼし、フル
クトサミン含量の測定を困難にするかもしれない。
【０００６】これらの欠点を克服するために、欧州特許
第309 882 号において、変色反応の前にほぼ中性のｐＨ
で妨害試料成分を除去する試薬で試料を処理し、次いで
変色反応に必要な塩基性ｐＨに設定し、そして変色試薬
を添加することによって変色反応を開始する方法が提案
された。この方法は、実際にはすぐ使用できる２種類の
液体試薬のセットを使って実施され、第一の試薬は妨害
試料成分を除去する試薬を含有するほぼ中性の緩衝液で
あり、そして第二の試薬は変色試薬を含有するアルカリ
性緩衝液である。
第309 882 号において、変色反応の前にほぼ中性のｐＨ
で妨害試料成分を除去する試薬で試料を処理し、次いで
変色反応に必要な塩基性ｐＨに設定し、そして変色試薬
を添加することによって変色反応を開始する方法が提案
された。この方法は、実際にはすぐ使用できる２種類の
液体試薬のセットを使って実施され、第一の試薬は妨害
試料成分を除去する試薬を含有するほぼ中性の緩衝液で
あり、そして第二の試薬は変色試薬を含有するアルカリ
性緩衝液である。
【０００７】この方法を自動臨床分析装置において使う
ためには、変色試薬とアルカリ性緩衝液は比較的高濃度
でなければならない。しかしながら、比較的高濃度の変
色試薬と緩衝塩が存在するアルカリ性媒質中では、変色
試薬（通常はテトラゾリウム塩）は安定でなく、そのた
め前記第二の試薬は保存性がないことがわかった。
ためには、変色試薬とアルカリ性緩衝液は比較的高濃度
でなければならない。しかしながら、比較的高濃度の変
色試薬と緩衝塩が存在するアルカリ性媒質中では、変色
試薬（通常はテトラゾリウム塩）は安定でなく、そのた
め前記第二の試薬は保存性がないことがわかった。
【０００８】市販のキット（Fructosamine Plus および
Unimate Fructosamine, Hoffmann-La-Roche, Basel, Sw
itzerland ）では、次のように試薬を分けることによっ
てこの欠点が回避されている：第一の試薬は、変色試薬
と非特異的還元試料成分を除去するための試薬（例えば
ウリカーゼ）とを含有する錠剤から成り；第二の試薬は
残りの試薬を含有するアルカリ性緩衝液から成る。分析
に必要なすぐ使用できる溶液を作製するために、まず錠
剤（第一の試薬）を第二の試薬中に溶かさなければなら
ない。この実行方法は優れた結果を与えるが、次の欠点
を有する：錠剤の溶解に少なくとも15分かかり自動化で
きない；こうして得られた試薬の混合溶液は二週間未満
の不安定な寿命を有する。
Unimate Fructosamine, Hoffmann-La-Roche, Basel, Sw
itzerland ）では、次のように試薬を分けることによっ
てこの欠点が回避されている：第一の試薬は、変色試薬
と非特異的還元試料成分を除去するための試薬（例えば
ウリカーゼ）とを含有する錠剤から成り；第二の試薬は
残りの試薬を含有するアルカリ性緩衝液から成る。分析
に必要なすぐ使用できる溶液を作製するために、まず錠
剤（第一の試薬）を第二の試薬中に溶かさなければなら
ない。この実行方法は優れた結果を与えるが、次の欠点
を有する：錠剤の溶解に少なくとも15分かかり自動化で
きない；こうして得られた試薬の混合溶液は二週間未満
の不安定な寿命を有する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】従って、上記欠点を持
たないフルクトサミン含量の測定用試薬への要求が存在
する。本発明が解決しようとする課題は、そのような試
薬を提供することである。
たないフルクトサミン含量の測定用試薬への要求が存在
する。本発明が解決しようとする課題は、そのような試
薬を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】この課題は上述した試薬
のセットを提供することにより解決される。変色試薬
は、フルクトサミンのエネアミノール型によりアルカリ
性ｐＨ条件下で還元されることのできる物質であり、変
色試薬の還元型は非還元型のものとは異なる色を有する
ため、還元型の出現を測光学的に追跡することができ
る。多数のそのような変色試薬はテトラゾリウム塩の中
に見出され、テトラゾリウム塩はアルカリ性媒質中でホ
ルマザンに還元され得る。そのようなテトラゾリウム塩
の例は下記のものである：
のセットを提供することにより解決される。変色試薬
は、フルクトサミンのエネアミノール型によりアルカリ
性ｐＨ条件下で還元されることのできる物質であり、変
色試薬の還元型は非還元型のものとは異なる色を有する
ため、還元型の出現を測光学的に追跡することができ
る。多数のそのような変色試薬はテトラゾリウム塩の中
に見出され、テトラゾリウム塩はアルカリ性媒質中でホ
ルマザンに還元され得る。そのようなテトラゾリウム塩
の例は下記のものである：
【００１１】３，３′−〔３，３′−ジメトキシ−
（１，１′−ビフェニル）−４，４′−ジイル〕−ビス
〔２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−
テトラゾリウムクロリド〕（ニトロブルーテトラゾリウ
ムＮＴＢ）、３，３′−〔３，３′−ジメトキシ−
（１，１′−ビフェニル）−４，４′−ジイル〕−ビス
〔２，５−ビス（ｐ−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラ
ゾリウムクロリド〕（ＴＮＴＢ）、
（１，１′−ビフェニル）−４，４′−ジイル〕−ビス
〔２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−
テトラゾリウムクロリド〕（ニトロブルーテトラゾリウ
ムＮＴＢ）、３，３′−〔３，３′−ジメトキシ−
（１，１′−ビフェニル）−４，４′−ジイル〕−ビス
〔２，５−ビス（ｐ−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラ
ゾリウムクロリド〕（ＴＮＴＢ）、
【００１２】３，３′−（１，１′−ビフェニル−４，
４′−ジイル）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テ
トラゾリウムクロリド）（ＮｅｏＴＢ）、３−（ｐ−ヨ
ードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フ
ェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、３
−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジ
フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、
および２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）−２
Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＴＶ）。
４′−ジイル）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テ
トラゾリウムクロリド）（ＮｅｏＴＢ）、３−（ｐ−ヨ
ードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フ
ェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、３
−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジ
フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、
および２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）−２
Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＴＶ）。
【００１３】テトラゾリウム塩は、好ましくは第一の液
体試薬中 0.2〜２ミリモル／Ｌの濃度で使用される。特
に好都合のテトラゾリウム塩はニトロブルーテトラゾリ
ウムであり、これは好ましくは第一の液体試薬中 0.5〜
1.5 ミリモル／Ｌの濃度で使用される。血液は通常相当
量の尿酸（これはヒトや他の霊長類ではプリンの代謝の
最終産物である）を含むため、尿酸からアラントインへ
の酸化を触媒する酵素であるウリカーゼが、非特異的還
元成分を除去する試薬として特に有用である。
体試薬中 0.2〜２ミリモル／Ｌの濃度で使用される。特
に好都合のテトラゾリウム塩はニトロブルーテトラゾリ
ウムであり、これは好ましくは第一の液体試薬中 0.5〜
1.5 ミリモル／Ｌの濃度で使用される。血液は通常相当
量の尿酸（これはヒトや他の霊長類ではプリンの代謝の
最終産物である）を含むため、尿酸からアラントインへ
の酸化を触媒する酵素であるウリカーゼが、非特異的還
元成分を除去する試薬として特に有用である。
【００１４】適当な市販のウリカーゼの例は、カンジダ
・アルビカンス（Candida albicans）(Seppim, Sees, 6
1500, France) 、アスペルギルス・フラーブス（Asperg
illus flavus）(Merck) 、ブタ肝臓(Serva, Heidelber
g, FRG)、アルスロバクター・グロビフォルミス（Arthr
obacter globiformis） (Sigma)、およびアルスロバク
ター・プロトホルミエ（Arthrobacter protophormiae）
(Boehringer Mannheim)から単離されたものである。特
に興味深いウリカーゼはアルスロバクター・プロトホル
ミエのウリカーゼであり、これは好ましくは第一の液体
試薬中 500〜1500Ｕ／Ｌの濃度で使用される。
・アルビカンス（Candida albicans）(Seppim, Sees, 6
1500, France) 、アスペルギルス・フラーブス（Asperg
illus flavus）(Merck) 、ブタ肝臓(Serva, Heidelber
g, FRG)、アルスロバクター・グロビフォルミス（Arthr
obacter globiformis） (Sigma)、およびアルスロバク
ター・プロトホルミエ（Arthrobacter protophormiae）
(Boehringer Mannheim)から単離されたものである。特
に興味深いウリカーゼはアルスロバクター・プロトホル
ミエのウリカーゼであり、これは好ましくは第一の液体
試薬中 500〜1500Ｕ／Ｌの濃度で使用される。
【００１５】遊離のチオール基と反応するチオール阻止
剤の添加は結果を更に大きく改善させることができる。
そのようなチオール阻止剤は例えばヨードアセトアミ
ド、ヨードアセテート、Ｎ−エチルマレインアミドおよ
びｐ−ヒドロキシ安息香酸第二水銀である。それらの試
薬は好ましくは第一の液体試薬中 0.5〜500 ミリモル／
Ｌ、特に５〜50ミリモル／Ｌの濃度で使用される。好ま
しいチオール阻止剤はヨードアセトアミドである。
剤の添加は結果を更に大きく改善させることができる。
そのようなチオール阻止剤は例えばヨードアセトアミ
ド、ヨードアセテート、Ｎ−エチルマレインアミドおよ
びｐ−ヒドロキシ安息香酸第二水銀である。それらの試
薬は好ましくは第一の液体試薬中 0.5〜500 ミリモル／
Ｌ、特に５〜50ミリモル／Ｌの濃度で使用される。好ま
しいチオール阻止剤はヨードアセトアミドである。
【００１６】濁り発生血清成分を除去する試薬は、それ
らの成分の分解を触媒する酵素、例えばリパーゼ、並び
にアニオン性、カチオン性および非イオン性界面活性剤
であり、所望により強酸の塩と併用される。有利なアニ
オン性界面活性剤は、胆汁酸の塩およびアルカリ金属ま
たはアルカリ土類金属とそれらとの接合体である。アニ
オン性界面活性剤は好ましくは第一の液体試薬中２〜10
ミリモル／Ｌで使用される。特に興味深いそのような塩
は、特に第一の液体試薬中８〜16ミリモル／Ｌの濃度で
使用される時のコール酸ナトリウムである。
らの成分の分解を触媒する酵素、例えばリパーゼ、並び
にアニオン性、カチオン性および非イオン性界面活性剤
であり、所望により強酸の塩と併用される。有利なアニ
オン性界面活性剤は、胆汁酸の塩およびアルカリ金属ま
たはアルカリ土類金属とそれらとの接合体である。アニ
オン性界面活性剤は好ましくは第一の液体試薬中２〜10
ミリモル／Ｌで使用される。特に興味深いそのような塩
は、特に第一の液体試薬中８〜16ミリモル／Ｌの濃度で
使用される時のコール酸ナトリウムである。
【００１７】様々な非イオン性界面活性剤を使用するこ
とができる。適当な非イオン性界面活性剤としては、特
に、アルコール部分に８〜12個の炭素原子を有し且つ分
子あたり４〜15のグリコール単位を有する、直鎖および
枝分かれアルキル−またはアリールアルキル−アルコー
ル−ポリグリコールエーテルが挙げられる。そのような
市販の非イオン性界面活性剤の例はGenapol X-80〔ｎ＝
８のイソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテ
ル）n ，Boehringer Mannheim から入手可能〕、Oxetal
ID 104 (Zschimmer & Schwarz, Lahnstein, FRG) 、Lu
tensol ON 50, ON60, ON 70 (BASF) およびSoprofor D/
916 (Rhone Poulenc, France)である。
とができる。適当な非イオン性界面活性剤としては、特
に、アルコール部分に８〜12個の炭素原子を有し且つ分
子あたり４〜15のグリコール単位を有する、直鎖および
枝分かれアルキル−またはアリールアルキル−アルコー
ル−ポリグリコールエーテルが挙げられる。そのような
市販の非イオン性界面活性剤の例はGenapol X-80〔ｎ＝
８のイソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテ
ル）n ，Boehringer Mannheim から入手可能〕、Oxetal
ID 104 (Zschimmer & Schwarz, Lahnstein, FRG) 、Lu
tensol ON 50, ON60, ON 70 (BASF) およびSoprofor D/
916 (Rhone Poulenc, France)である。
【００１８】そのような非イオン性界面活性剤の１つま
たはそれらの混合物は、第一の液体試薬中0.05〜15重量
％、特に 0.1〜５重量％の濃度で添加される。有利には
イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）n
が使用され、特に第一の液体試薬中50〜110 ミリモル／
Ｌの濃度で使用される。
たはそれらの混合物は、第一の液体試薬中0.05〜15重量
％、特に 0.1〜５重量％の濃度で添加される。有利には
イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）n
が使用され、特に第一の液体試薬中50〜110 ミリモル／
Ｌの濃度で使用される。
【００１９】濁り発生成分を除去する効果は、強酸の
塩、例えば硫酸または塩酸とアルカリ金属またはアルカ
リ土類金属との塩の存在下でより強力である。好ましい
そのような塩は塩化カリウムおよび塩化ナトリウムであ
る。強酸の塩は好ましくは第一の液体試薬中20〜200 ミ
リモル／Ｌの濃度で使用される。ほぼ中性のｐＨを有す
る第一の液体試薬は、適当な非還元性緩衝剤を通常10〜
100 ミリモル／Ｌの濃度で含有する。この緩衝剤は、有
利には約６〜約９、特に約７〜約８のｐＨを有する緩衝
剤の中から選ばれる。特に便利な緩衝剤は約７〜約８の
ｐＨを有するリン酸カリウム緩衝液である。
塩、例えば硫酸または塩酸とアルカリ金属またはアルカ
リ土類金属との塩の存在下でより強力である。好ましい
そのような塩は塩化カリウムおよび塩化ナトリウムであ
る。強酸の塩は好ましくは第一の液体試薬中20〜200 ミ
リモル／Ｌの濃度で使用される。ほぼ中性のｐＨを有す
る第一の液体試薬は、適当な非還元性緩衝剤を通常10〜
100 ミリモル／Ｌの濃度で含有する。この緩衝剤は、有
利には約６〜約９、特に約７〜約８のｐＨを有する緩衝
剤の中から選ばれる。特に便利な緩衝剤は約７〜約８の
ｐＨを有するリン酸カリウム緩衝液である。
【００２０】第二の液体試薬は、約９〜約12.5、好まし
くは約10〜約11のｐＨを有する緩衝剤を含有する。有利
な緩衝剤は約10〜約11のｐＨを有する炭酸カリウム緩衝
液である。上述した試薬のセットは貯蔵および使用条件
下で優れた安定性を有する。
くは約10〜約11のｐＨを有する緩衝剤を含有する。有利
な緩衝剤は約10〜約11のｐＨを有する炭酸カリウム緩衝
液である。上述した試薬のセットは貯蔵および使用条件
下で優れた安定性を有する。
【００２１】本発明はまた、血液試料または血液由来の
試料を変色試薬で処理しそして誘導される色の変化を測
定することにより前記試料中のフルクトサミン含量を測
定する方法であって、変色反応の最中または前に前記試
料の非特異的還元成分および／または濁り発生成分を除
去し、上述した試薬のセットを使用する方法に関する。
試料を変色試薬で処理しそして誘導される色の変化を測
定することにより前記試料中のフルクトサミン含量を測
定する方法であって、変色反応の最中または前に前記試
料の非特異的還元成分および／または濁り発生成分を除
去し、上述した試薬のセットを使用する方法に関する。
【００２２】この方法の好ましい態様では、妨害成分を
除去するために試料をまず上述の第一の試薬と混合し、
次いで反応混合物のｐＨを約９〜約11、好ましくは約10
〜約11に調整するように適当な量の上述の第二の液体試
薬を添加することにより変色反応を開始する。
除去するために試料をまず上述の第一の試薬と混合し、
次いで反応混合物のｐＨを約９〜約11、好ましくは約10
〜約11に調整するように適当な量の上述の第二の液体試
薬を添加することにより変色反応を開始する。
【００２３】反応混合物の色の変化の速度を適当な波長
で測光学的に測定し、検定溶液のものと比較する。有利
な検定溶液は既知濃度のケトアミン、好ましくはグリケ
ート化ポリ−Ｌ−リジン（EP 351 790参照）、もしくは
デオキシモルホリノフルクトース（ＤＭＦ）を含有する
もの、またはそれらの検定物質のうちの１つにより標準
化された血清である。選択される波長は普通、変色試薬
の還元型の最大吸収波長に近い。変色試薬がニトロブル
ーテトラゾリウムである時、好ましい波長は550 nmであ
る。
で測光学的に測定し、検定溶液のものと比較する。有利
な検定溶液は既知濃度のケトアミン、好ましくはグリケ
ート化ポリ−Ｌ−リジン（EP 351 790参照）、もしくは
デオキシモルホリノフルクトース（ＤＭＦ）を含有する
もの、またはそれらの検定物質のうちの１つにより標準
化された血清である。選択される波長は普通、変色試薬
の還元型の最大吸収波長に近い。変色試薬がニトロブル
ーテトラゾリウムである時、好ましい波長は550 nmであ
る。
【００２４】該方法の別の好ましい態様では、試料と上
述の第一および第二の液体試薬を同時に混合する。上述
の第一および第二の液体試薬を混合し、次いでそれらの
試薬の混合物に試料を添加することも可能である。次い
で第二の液体を、好ましくは反応混合物のｐＨを約９〜
約11、好ましくは約10〜約11に調整するような量で使用
する。本発明の試薬のセットの使用は、錠剤を含んで成
る市販の試薬のセットに比べて、試薬の混合を迅速に行
うことができ且つ完全に自動化することができるという
利点がある。本発明を下記実施例により更に説明する。
述の第一および第二の液体試薬を同時に混合する。上述
の第一および第二の液体試薬を混合し、次いでそれらの
試薬の混合物に試料を添加することも可能である。次い
で第二の液体を、好ましくは反応混合物のｐＨを約９〜
約11、好ましくは約10〜約11に調整するような量で使用
する。本発明の試薬のセットの使用は、錠剤を含んで成
る市販の試薬のセットに比べて、試薬の混合を迅速に行
うことができ且つ完全に自動化することができるという
利点がある。本発明を下記実施例により更に説明する。
【００２５】実施例１：本発明の試薬のセットの調製 本発明の第一および第二の液体試薬のセットを次の組成
物を使って調製した。第一の液体試薬Ｒ１： ─ 1.2 ミリモル／Ｌのニトロブルーテトラゾリウム
（ＮＴＢ） ─ 4000Ｕ／Ｌのアルスロバクター・プロトホルミエの
ウリカーゼ（Boehringer Mannheim ） ─ 80ミリモル／Ｌのイソトリデシルポリ（エチレング
リコールエーテル）8（Genapol X-80, Boehringer Mann
heim ） ─ 12ミリモル／Ｌのコール酸ナトリウム ─ 100 ミリモル／Ｌのリン酸カリウム緩衝液 pH 7.5 ─ 100 ミリモル／Ｌの塩化カリウム第二の液体試薬Ｒ２： 1.5ミリモル／Ｌの炭酸カリウム
緩衝液 pH 10.4
物を使って調製した。第一の液体試薬Ｒ１： ─ 1.2 ミリモル／Ｌのニトロブルーテトラゾリウム
（ＮＴＢ） ─ 4000Ｕ／Ｌのアルスロバクター・プロトホルミエの
ウリカーゼ（Boehringer Mannheim ） ─ 80ミリモル／Ｌのイソトリデシルポリ（エチレング
リコールエーテル）8（Genapol X-80, Boehringer Mann
heim ） ─ 12ミリモル／Ｌのコール酸ナトリウム ─ 100 ミリモル／Ｌのリン酸カリウム緩衝液 pH 7.5 ─ 100 ミリモル／Ｌの塩化カリウム第二の液体試薬Ｒ２： 1.5ミリモル／Ｌの炭酸カリウム
緩衝液 pH 10.4
【００２６】実施例２：本発明の試薬のセットの安定性
の研究 １）貯蔵条件下での安定性 この安定性は、 ─ 調製したばかりの第一の液体試薬Ｒ１の試料、２〜
８℃の温度で１年間貯蔵後の第一の液体試薬Ｒ１の試
料、および24〜26℃の温度で１年間貯蔵後の第一の液体
試薬Ｒ１の試料について、550 nmの波長で吸光度を測定
し、そしてウリカーゼ活性を測定する（Boehringer Man
nheim により推奨されるように293 nmの波長と25℃の温
度でカタラーゼの存在下で尿酸の転換を測光学的に追跡
することにより）ことにより、および
の研究 １）貯蔵条件下での安定性 この安定性は、 ─ 調製したばかりの第一の液体試薬Ｒ１の試料、２〜
８℃の温度で１年間貯蔵後の第一の液体試薬Ｒ１の試
料、および24〜26℃の温度で１年間貯蔵後の第一の液体
試薬Ｒ１の試料について、550 nmの波長で吸光度を測定
し、そしてウリカーゼ活性を測定する（Boehringer Man
nheim により推奨されるように293 nmの波長と25℃の温
度でカタラーゼの存在下で尿酸の転換を測光学的に追跡
することにより）ことにより、および
【００２７】─ 実施例３の１）ｂ）の様式Ｃの項目の
ところに記載する方法を、上記試薬Ｒ１の試料、および
同条件下で貯蔵した試薬Ｒ２の試料を使って実施し、そ
してそれによって測光の直線応答の最大濃度と検定係数
を測定することにより、研究した。試料として２つの対
照血清ロットと１つの検定物質ロット（グリケート化ポ
リリジンにより標準化されたグリケート化アルブミンを
含有するヒト血清）を使用した。結果を下の表１に示
す。
ところに記載する方法を、上記試薬Ｒ１の試料、および
同条件下で貯蔵した試薬Ｒ２の試料を使って実施し、そ
してそれによって測光の直線応答の最大濃度と検定係数
を測定することにより、研究した。試料として２つの対
照血清ロットと１つの検定物質ロット（グリケート化ポ
リリジンにより標準化されたグリケート化アルブミンを
含有するヒト血清）を使用した。結果を下の表１に示
す。
【００２８】
【表１】
【００２９】この表からわかるように、測定したパラメ
ーターのいずれも２〜８℃での１年間の貯蔵後に有意な
変化を示さない。24〜26℃での１年間の貯蔵後には、検
定係数と測光の直線応答の最大濃度は安定であるが、一
方ウリカーゼ活性はわずかな減少を示し、そして吸収は
わずかな増加を示す。それらのわずかな変化は、試験に
おけるこの試薬の実用に影響を及ぼすことなく、過剰に
使用されるウリカーゼと吸光値のわずかな変化は速度論
的測定に対する影響はない。
ーターのいずれも２〜８℃での１年間の貯蔵後に有意な
変化を示さない。24〜26℃での１年間の貯蔵後には、検
定係数と測光の直線応答の最大濃度は安定であるが、一
方ウリカーゼ活性はわずかな減少を示し、そして吸収は
わずかな増加を示す。それらのわずかな変化は、試験に
おけるこの試薬の実用に影響を及ぼすことなく、過剰に
使用されるウリカーゼと吸光値のわずかな変化は速度論
的測定に対する影響はない。
【００３０】２）使用条件下での安定性 空気の出入りを許容する小さな開口部を有する瓶の中に
第一の液体試薬Ｒ１を維持することにより、使用条件を
シミュレーションした。瓶の最初の開封直後と４〜８℃
の温度で８週間貯蔵後に、上記係数のうちの３つを測定
した。結果を下記の表に示す。
第一の液体試薬Ｒ１を維持することにより、使用条件を
シミュレーションした。瓶の最初の開封直後と４〜８℃
の温度で８週間貯蔵後に、上記係数のうちの３つを測定
した。結果を下記の表に示す。
【００３１】
【表２】 測定したパラメーターのいずれもそれらの条件下での貯
蔵の８週間後に有意な変化を示さない。
蔵の８週間後に有意な変化を示さない。
【００３２】瓶の最初の開封直後と２〜８℃の温度で８
週間貯蔵後に、第一の液体試薬を、実施例３の１）ｂ）
の様式Ｃに記載の方法に従って、120 〜750 μモル／Ｌ
のフルクトサミンを含有する種々の血漿試料のフルクト
サミン含量を測定するのに使った。それらの溶液の各々
について47の測定を行い、結果を相関関係づけた。回帰
線の式はＹ＝1.00Ｘ＋3.00である（ＸとＹはそれぞれ、
瓶の最初の開封直後と２〜８℃の温度で８週間貯蔵後の
第一の液体試薬について測定された値である）。それら
の２溶液の間には99.5％の信頼区間で有意な相違はな
い。
週間貯蔵後に、第一の液体試薬を、実施例３の１）ｂ）
の様式Ｃに記載の方法に従って、120 〜750 μモル／Ｌ
のフルクトサミンを含有する種々の血漿試料のフルクト
サミン含量を測定するのに使った。それらの溶液の各々
について47の測定を行い、結果を相関関係づけた。回帰
線の式はＹ＝1.00Ｘ＋3.00である（ＸとＹはそれぞれ、
瓶の最初の開封直後と２〜８℃の温度で８週間貯蔵後の
第一の液体試薬について測定された値である）。それら
の２溶液の間には99.5％の信頼区間で有意な相違はな
い。
【００３３】上述の結果は、貯蔵および使用条件下で本
発明の試薬のセットが優れた安定性を有することを示
す。実施例３ ：本発明の方法と市販の従来技術の方法との比
較 50〜650 μモル／Ｌのフルクトサミンを含有する血漿試
料のフルクトサミン含量を測定するのに本発明の方法の
３つの異なる様式を使用し、その結果を市販のフルクト
サミンプラス法を使って得られた結果と関係づけた。
発明の試薬のセットが優れた安定性を有することを示
す。実施例３ ：本発明の方法と市販の従来技術の方法との比
較 50〜650 μモル／Ｌのフルクトサミンを含有する血漿試
料のフルクトサミン含量を測定するのに本発明の方法の
３つの異なる様式を使用し、その結果を市販のフルクト
サミンプラス法を使って得られた結果と関係づけた。
【００３４】１）試験の説明 全ての試験は、37℃の反応温度と550 nmでの測光を使っ
てCobas Mira分析装置中で実施した。ａ）フルクトサミンプラス法 市販キットであるフルクトサミンプラス（Fructosamine
Plus ）(Roche) を使用した。ＮＢＴとウリカーゼを含
む１錠を、界面活性剤を含むpH 10.4 の緩衝液20 ml 中
に溶かした。試薬混合物 200μl を試料10μl および水
30μl と同時に混合した。8.3 分と13.8分の間の反応速
度を測定した。
てCobas Mira分析装置中で実施した。ａ）フルクトサミンプラス法 市販キットであるフルクトサミンプラス（Fructosamine
Plus ）(Roche) を使用した。ＮＢＴとウリカーゼを含
む１錠を、界面活性剤を含むpH 10.4 の緩衝液20 ml 中
に溶かした。試薬混合物 200μl を試料10μl および水
30μl と同時に混合した。8.3 分と13.8分の間の反応速
度を測定した。
【００３５】ｂ）本発明の方法 様式Ａ ：７mlの第一の液体試薬（0.82ミリモル／ＬのＮ
ＢＴ；70ミリモル／Ｌの塩化カリウム；70ミリモル／Ｌ
のリン酸カリウム緩衝液 pH 7.5 ；56ミリモル／ＬのGe
napol X-80；5.6 ミリモル／Ｌのコール酸ナトリウム；
400 Ｕ／Ｌのアルスロバクター・プロトホルミエのウリ
カーゼ）を使用前に３mlの第二の液体試薬（500ミリモ
ル／Ｌの炭酸カリウム緩衝液 pH 10.4）と混合した。試
薬混合物 200μl を試料10μl および水30μl と同時に
混合した。8.3 分と13.8分の間の反応速度を測定した。
ＢＴ；70ミリモル／Ｌの塩化カリウム；70ミリモル／Ｌ
のリン酸カリウム緩衝液 pH 7.5 ；56ミリモル／ＬのGe
napol X-80；5.6 ミリモル／Ｌのコール酸ナトリウム；
400 Ｕ／Ｌのアルスロバクター・プロトホルミエのウリ
カーゼ）を使用前に３mlの第二の液体試薬（500ミリモ
ル／Ｌの炭酸カリウム緩衝液 pH 10.4）と混合した。試
薬混合物 200μl を試料10μl および水30μl と同時に
混合した。8.3 分と13.8分の間の反応速度を測定した。
【００３６】様式Ｂ：様式Ａと同じ組成を有する第一お
よび第二の液体試薬を分析装置上で分離して使用した。
第一の液体試薬 140μl を第二の液体試薬60μl および
試料10μl と同時に混合した。8.3 分と13.8分の間の反
応速度を測定した。
よび第二の液体試薬を分析装置上で分離して使用した。
第一の液体試薬 140μl を第二の液体試薬60μl および
試料10μl と同時に混合した。8.3 分と13.8分の間の反
応速度を測定した。
【００３７】様式Ｃ：第一の液体試薬（1.2 ミリモル／
ＬのＮＢＴ；100 ミリモル／Ｌの塩化カリウム；100 ミ
リモル／Ｌのリン酸カリウム緩衝液 pH 7.5 ；80ミリモ
ル／ＬのGenapol X-80；12ミリモル／Ｌのコール酸ナト
リウム；4000Ｕ／Ｌのアルスロバクター・プロトホルミ
エのウリカーゼ）と第二の液体試薬（1500ミリモル／Ｌ
の炭酸カリウム緩衝液 pH 10.4）を分析装置上で分離し
て使用した。第一の液体試薬 100μl を試料10μl およ
び水40μl と同時に混合した。3.3分後、第二の液体試
薬20μl と水40μl を添加することにより反応を開始し
た。13.3分と15.4分の間の反応速度を測定した。
ＬのＮＢＴ；100 ミリモル／Ｌの塩化カリウム；100 ミ
リモル／Ｌのリン酸カリウム緩衝液 pH 7.5 ；80ミリモ
ル／ＬのGenapol X-80；12ミリモル／Ｌのコール酸ナト
リウム；4000Ｕ／Ｌのアルスロバクター・プロトホルミ
エのウリカーゼ）と第二の液体試薬（1500ミリモル／Ｌ
の炭酸カリウム緩衝液 pH 10.4）を分析装置上で分離し
て使用した。第一の液体試薬 100μl を試料10μl およ
び水40μl と同時に混合した。3.3分後、第二の液体試
薬20μl と水40μl を添加することにより反応を開始し
た。13.3分と15.4分の間の反応速度を測定した。
【００３８】２）結果 上述した本発明の様式Ａ，ＢおよびＣの方法を使って得
られた結果を、比較対照法を使って得られたものに相関
づけた。実施した測定の数並びに回帰線Ｙ＝ａＸ＋ｂ
（Ｙは本発明の方法について測定された値であり、そし
てＸは比較対照法について測定された値である）の傾き
ａおよび切片ｂ、並びにSpearman順位相関係数を下記の
表３に示す。
られた結果を、比較対照法を使って得られたものに相関
づけた。実施した測定の数並びに回帰線Ｙ＝ａＸ＋ｂ
（Ｙは本発明の方法について測定された値であり、そし
てＸは比較対照法について測定された値である）の傾き
ａおよび切片ｂ、並びにSpearman順位相関係数を下記の
表３に示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】上記結果は、本発明の方法の上述の様式が
比較対照法と非常に高度の相関性を有することを示す。
従って、非常に安定な本発明の試薬のセットは、優れた
臨床結果を提供するだろう。
比較対照法と非常に高度の相関性を有することを示す。
従って、非常に安定な本発明の試薬のセットは、優れた
臨床結果を提供するだろう。
Claims (13)
- 【請求項１】 血液試料または血液由来の試料中のフル
クトサミン含量を測定するための試薬のセットであっ
て、前記試薬のセットは２種類のすぐ使用できる安定な
液体試薬を含んで成り、第一の液体試薬はほぼ中性のｐ
Ｈを有し、且つアルカリ性ｐＨ条件下でフルクトサミン
により還元されて変色する変色試薬、試料の非特異的還
元成分および／または濁り発生成分を除去するための試
薬、並びに場合により他の常用の添加剤を含有し、そし
て第二の液体試薬は塩基性緩衝剤を含有する、前記試薬
のセット。 - 【請求項２】 前記第二の液体試薬が約９〜約12.5のｐ
Ｈを有することを特徴とする、請求項１に記載のセッ
ト。 - 【請求項３】 前記第二の液体試薬が約10〜約11のｐＨ
を有する炭酸塩緩衝液を含有することを特徴とする、請
求項２に記載のセット。 - 【請求項４】 前記第一の液体試薬が約６〜約９のｐＨ
を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一
項に記載のセット。 - 【請求項５】 前記第一の液体試薬が約７〜約８のｐＨ
を有するリン酸塩緩衝液を含有することを特徴とする、
請求項４に記載のセット。 - 【請求項６】 前記第一の液体試薬が変色試薬としてニ
トロブルーテトラゾリウムを含有することを特徴とす
る、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセット。 - 【請求項７】 前記試料の非特異的還元成分を除去する
ための試薬として酸化活性を有する酵素を使用すること
を特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のセ
ット。 - 【請求項８】 前記試料の非特異的還元成分を除去する
ための試薬としてウリカーゼを使用することを特徴とす
る、請求項７に記載のセット。 - 【請求項９】 前記試料の濁り発生成分を除去するため
の試薬として、所望により強酸の塩と一緒に、イオン性
および／または非イオン性界面活性剤を使用することを
特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のセッ
ト。 - 【請求項１０】 イオン性界面活性剤としてコール酸ナ
トリウムを使用することを特徴とする、請求項９に記載
のセット。 - 【請求項１１】 非イオン性界面活性剤としてイソトリ
デシルポリ（エチレングリコールエーテル）n を使用す
ることを特徴とする、請求項９または１０に記載のセッ
ト。 - 【請求項１２】 血液試料または血液由来の試料を変色
試薬で処理しそして誘導される色の変化を測定すること
により前記試料中のフルクトサミン含量を測定する方法
であって、変色反応の前に前記試料の非特異的還元成分
および／または濁り発生成分を除去し、前記試料を請求
項１および４〜１１のいずれか一項に記載の第一の液体
試薬と混合し、次いで反応混合物のｐＨを約９〜約12に
調整するように適当量の請求項１〜３のいずれか一項に
記載の第二の液体試薬を添加することによって変色反応
を開始することを特徴とする方法。 - 【請求項１３】 血液試料または血液由来の試料を変色
試薬で処理しそして誘導される色の変化を測定すること
により前記試料中のフルクトサミン含量を測定する方法
であって、変色反応中に前記試料の非特異的還元成分お
よび／または濁り発生成分を除去し、請求項１および４
〜１１のいずれか一項に記載の第一の液体試薬を請求項
１〜３のいずれか一項に記載の第二の液体試薬と混合
し、そしてそれと同時にまたはその後に前記試料を添加
することによって変色反応を開始し、反応混合物のｐＨ
を約９〜約12に調整するような量で第二の液体試薬を使
用することを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93111966 | 1993-07-27 | ||
| CH93111966:3 | 1993-07-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07151761A true JPH07151761A (ja) | 1995-06-16 |
| JP2619222B2 JP2619222B2 (ja) | 1997-06-11 |
Family
ID=8213115
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6174522A Expired - Lifetime JP2619222B2 (ja) | 1993-07-27 | 1994-07-26 | 血液試料または血液由来の試料中のフルクトサミン含量を測定するための試薬と方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5866352A (ja) |
| EP (1) | EP0636885B1 (ja) |
| JP (1) | JP2619222B2 (ja) |
| AT (1) | ATE216494T1 (ja) |
| CA (1) | CA2127679A1 (ja) |
| DE (1) | DE69430410T2 (ja) |
| ES (1) | ES2174858T3 (ja) |
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
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| JP2017198670A (ja) * | 2016-04-25 | 2017-11-02 | アークレイ株式会社 | 糖化タンパク質の分析方法、分析試薬、分析キットおよび分析用試験片 |
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| US7314453B2 (en) | 2001-05-14 | 2008-01-01 | Youti Kuo | Handheld diagnostic device with renewable biosensor |
| EP1976876A4 (en) * | 2005-12-22 | 2010-01-13 | Conjuchem Biotechnologies Inc | PROCESS FOR PRODUCING PREFORMED ALBUMIN CONJUGATES AND THERAPEUTIC AGENT |
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|---|---|---|---|---|
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| DE3620817A1 (de) * | 1986-06-21 | 1987-12-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen bestimmung des serumfructosamingehalts sowie hierfuer geeignetes reagenzgemisch |
| DE3743405A1 (de) * | 1987-05-14 | 1988-11-24 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung von fructosamin |
| DE3732688A1 (de) * | 1987-09-29 | 1989-04-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen bestimmung des serumfructosamingehalts sowie hierfuer geeignetes reagenzgemisch |
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- 1994-07-08 CA CA002127679A patent/CA2127679A1/en not_active Abandoned
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- 1994-07-11 AT AT94110738T patent/ATE216494T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-07-11 EP EP94110738A patent/EP0636885B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-11 DE DE69430410T patent/DE69430410T2/de not_active Expired - Fee Related
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-
1997
- 1997-07-02 US US08/886,799 patent/US5866352A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
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