JPH04328466A

JPH04328466A - 血液試料中の血清フルクトサミン含量を測定する方法及びその測定試薬

Info

Publication number: JPH04328466A
Application number: JP12543791A
Authority: JP
Inventors: Yoshio Shimizu; 清水　淑男; Katsuhiko Arai; 勝彦荒井; Haruhiko Kawaji; 川治　晴彦
Original assignee: Nippon Chemiphar Co Ltd
Current assignee: Nippon Chemiphar Co Ltd
Priority date: 1991-04-26
Filing date: 1991-04-26
Publication date: 1992-11-17

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、体液中のフルクトサミ
ン含量の測定に関し、さらに詳細には、測定に影響する
共存物質を測定のはじめに除去した後、血液試料中の血
清フルクトサミン含量を特異的に測定する方法およびそ
の測定試薬に関するものである。フルクトサミン含量は
、過去１〜２週間の血糖状態を反映し、その測定は糖尿
病の診断に有用であり、現在広く利用されている。

【０００２】

【従来技術】ところで、フルクトサミンを測定するため
の技術としては、特公平１−１３０６２及び特開平１−
１０８９９７等が知られている。特公平１−１３０６２
には、アルカリ性で試料に着色剤を添加し、始めの１０
分間で反応性の高い共存物質との反応が終了した後の１
０〜１５分の吸光度を測定し、共存物質の影響を少なく
してフルクトサミンを測定する方法が記載されている。

【０００３】しかしながらこの方法では、ビリルビン、
尿酸、グルタチオンなどの共存物質の反応への影響を無
視できないなどの問題が指摘されている。一方、特開平
１−１０８９９７は、特公平１−１３０６２のこれらの
問題点を解決するため、予め試料を中性で酸化酵素（ア
スコルビン酸オキシダ−ゼ、ビリルビンオキシダ−ゼ、
ウリカ−ゼ）及びＳＨ基封鎖剤等で処理したのち、アル
カリ性とし着色剤を添加し、吸光度の上昇を測定するこ
とにより、共存物質の影響を除いてフルクトサミンを測
定している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】これらの明細書、文献
等で報告されているように、血清中に常在するアスコル
ビン酸、ビリルビン、尿酸等、さらに服薬などによって
存在するようになるグルタチオン等が、血清フルクトサ
ミン含量の測定に大きく影響することが、知られている
。ところで、アスコルビン酸は、強アルカリ溶液で分解
することが知られているが、本発明者らの研究でこの時
、金属イオンを添加すると前述の分解が加速されること
が明らになった。また、グルタチオンは、自然にゆっく
りと自動酸化されるが、同じく金属イオンを含有する強
アルカリで処理するとすみやかに自動酸化されることも
判明した。本発明者らは、これらの結果をもとに、試料
を予め金属イオンを含有する強アルカリ溶液で処理した
ところ、共存物質の影響を除き、正確に血清フルクトサ
ミン含量を測定することができることを見出し本発明を
完成した。

【０００５】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、試料を
予め金属イオンを含有するｐＨ１０．５〜１２．５のア
ルカリ溶液で処理し共存物質を除き、次に着色剤を含有
する中性もしくは酸性溶液を添加し、ｐＨ９．５〜１０
．５において生じる色変化を測定することを特徴とする
新規な血清フルクトサミン含量の測定方法を提供するも
のである。更に、本発明は、グリシン及び硫酸コバルト
を含有するｐＨ１０．５〜１１．２の炭酸緩衝液と３−
（ｐ−ヨ−ドフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）
−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム　　クロライド
を含有するリン酸二水素ナトリウム溶液からなる新規な
血清フルクトサミン測定試薬を提供するものである。

【０００６】本発明方法で使用される金属イオンとして
は、好ましくは、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバル
トイオンが挙げられ、更に好ましくは、コバルトイオン
が挙げられる。その至適濃度は、共存物質の影響、なか
でもグルタチオンの濃度によるが、後記のＩ液で１．５
〜２．５ｍＭ、最終溶液（測定溶液）で０．７５〜１．
２５ｍＭが好ましい。アルカリ溶液としては、好ましく
は、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、更に好
ましくは、炭酸緩衝液が挙げられる。アルカリ溶液のｐ
Ｈは、好ましく、ｐＨ１０．５〜１２．５更に好ましく
は、ｐＨ１０．５〜１１．２である。更に、このアルカ
リ溶液には、コバルトイオンを可溶化するためアミンま
たはアミノ酸を添加することが好ましく、アミノ酸とし
ては、グリシンが挙げられる。添加するグリシンの量は
、コバルトイオンの１０倍等量が好ましい。

【０００７】本発明方法で用いられる着色剤としては、
還元されると変色するテトラゾリウム塩が挙げられ、更
にこれらのテトラゾリウム塩は、水に易溶性であること
が好ましく、例えば、３−（ｐ−ヨ−ドフェニル）−２
−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テト
ラゾリウム　　クロライド（以下、ＩＮＴと略す）、ニ
トロテトラゾリウムブル−（ＮＴＢ）等が挙げられる。またこの着色剤を含有する中性もしくは酸性溶液として
は、好ましくは、リン酸塩水溶液、酢酸塩水溶液が挙げ
られ、更に好ましくはリン酸二水素ナトリウム溶液が挙
げられる。色変化を測定する際のｐＨは、ｐＨ９．５〜
１０．５が好ましい。尚、高アルカリでは、感度が良好
となるが、直線性に欠けることから前記のｐＨが好まし
い。

【０００８】本発明の測定試薬は、グリシン及び硫酸コ
バルトを含有するｐＨ１０．５〜１１．２、好ましくは
ｐＨ１０．８の炭酸緩衝液からなるＩ液と３−（ｐ−ヨ
−ドフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−フェニ
ル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライドを含有するリン酸
二水素ナトリウム溶液からなるＩＩ液から構成されてい
る。ここで、Ｉ液は、冷暗所に保存するか、若しくは炭
酸緩衝液とコバルト溶液から使用時調製することが好ま
しい。上記のフルクトサミン含量は、標準試薬をおいて
測定されるが、ここで、標準試薬としては、血清にグル
コ−スを添加した後、インキュベ−トしフルクトサミン
濃度を調整したものを用いることが望ましい。測定可能
な試料としては、体液、好ましくは血液、更に好ましく
は血清が挙げられる。

【０００９】

【作用】次に、本発明方法を用いた測定試験の結果を示
す。人工的にグルコ−スを添加しインキュベ−トした糖
化血清を、正常血清で希釈した血清フルクトサミンの測
定試験において、本発明方法を用いることでフルクトサ
ミンの含量と吸光度差ΔＡとの間には図１で示すように
良好な直線関係が得られた。また、正常血清および正常
血清にアスコルビン酸、尿酸、グルタチオンを添加した
ときの本発明方法を用いた際の反応のタイムコ−ス（図
２）から明らかなように、本発明方法では共存物質を添
加しても吸光度差ΔＡ（これらの直線の傾きが同じであ
るので）は影響をうけなかった。更に、本発明方法で、
正常血清に種々の共存物質を添加したときの測定値への
影響を試験した結果、これら添加共存物質の影響が除か
れていることが確認された。

【００１０】

【発明の効果】以上、詳述したように、本発明方法を用
いることにより共存物質の影響を除き、正確に血清フル
クトサミン含量を測定することができ、更に着色剤を添
加後、速やかに測定を開始することができるため測定時
間を短縮でき、また特開平１−１０８９９７では共存物
質の影響を除くため、酵素など多数の試薬を用いている
が、本発明方法では簡便な試薬で共存物質を除くことが
可能となり、臨床検査の分野において有用な発明である
。次に実施例、参考例を挙げ本発明を更に詳細に説明す
る。

【００１１】

【実施例】１。本発明方法による血清フルクトサミンの
測定＜試薬の組成＞Ｉ液（ｐＨ１０．８）２００ｍＭの炭酸緩衝液２０ｍＭのグリシン２ｍＭの硫酸コバルトＩＩ液１００ｍＭのリン酸二水素ナトリウム２．５ｍＭのＩＮＴ

【００１２】＜測定の実施＞試料１００μｌにＩ液１ｍ
ｌを加え、３７℃で５分間インキュベ−トした。次いで
、これにＩＩ液１ｍｌを加え、３７℃でインキュベ−ト
し５００ｎｍにおける吸光度を測定し、０および５分後
の値から吸光度差ΔＡを求めた。尚、測定は、日立２２
８型分光光度計を用い、測定用セルのまわりに３７℃の
温水を循環させることにより行った。そして、公知のフ
ルクトサミン含量を有する標準液を同様に測定し、試料
のフルクトサミン濃度を計算した。＜糖化血清の調製方法＞正常血清１ｍｌにグルコ−ス１
０ｍｇを添加し、４０℃で４日間インキュベ−トするこ
とにより得た。

【００１３】＜試験結果＞図１に人工的にグルコ−スを
添加しインキュベ−トした糖化血清を、正常血清で希釈
した時の試験結果を示す。図１中の横軸における■、■
、■及び■はそれぞれ下記の表１の割合で正常血清、糖
化血清を混合したものである。

【表１】

【００１４】図１から明らかなように、フルクトサミン
の含量と吸光度差ΔＡとの間には良好な直線関係が得ら
れた。図２に正常血清および正常血清にアスコルビン酸
、尿酸、グルタチオンを添加したときの反応のタイムコ
−スを示す。図２中、●は正常血清、○はアスコルビン
酸Ｎａ（２０ｍｇ／ｄｌ）添加血清、△は尿酸Ｎａ（２
０ｍｇ／ｄｌ）添加血清そして、□はグルタチオン（５
０ｍｇ／ｄｌ）添加血清を表す。ＩＩ液は、横軸（時間
）で０分に添加した。図２から明らかなように、本発明
方法では共存物質を添加しても吸光度差ΔＡ（これらの
直線の傾きが同じであるので）は影響をうけなかった。

【００１５】次いで表２に、正常血清に種々の共存物質
を添加したときの測定値への影響を示す。

【表２】表２から明らかなように共存物質の影響が除かれている
ことが確認された。

【００１６】２。参考例特公平１−１３０６２記載の方法でフルクトサミン含量
の測定を行なった。正常血清及び正常血清にアスコルビ
ン酸、尿酸、グルタチオンを添加したときのタイムコ−
スを図３に示す。図３において■は正常血清、■はアス
コルビン酸Ｎａ（２０ｍｇ／ｄｌ）添加血清、■はグル
タチオン（５０ｍｇ／ｄｌ）添加血清、そして■は尿酸
Ｎａ（２０ｍｇ／ｄｌ）添加血清を表す。この方法では
、アスコルビン酸、グルタチオオンの反応性は高く、大
きく測定値に影響していることが推測される。

【図面の簡単な説明】

【図１】　　本発明方法を用い、糖化血清を正常血清で
希釈したときの希釈直線性を示す図

【図２】　　本発明方法の共存物質の影響を示す図

【図
３】　　特公平１−１３０６２記載の方法でフルクトサ
ミン含量を測定した図

【符号の説明】

図２中、●は正常血清、○はアスコルビン酸Ｎａ添加血
清、△は尿酸Ｎａ添加血清そして、□はグルタチオン添
加血清を、図３中、■は正常血清、■はアスコルビン酸
Ｎａ添加血清、■はグルタチオン添加血清、そして■は
尿酸Ｎａ添加血清を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　試料を金属イオンを含有するｐＨ１０
．５〜１２．５のアルカリ溶液で処理した後、着色剤を
含有する中性もしくは酸性溶液を添加し、ｐＨ９．５〜
１０．５において生じる色変化を測定することを特徴と
する血清フルクトサミンの測定方法。
【請求項２】　　金属イオンが、コバルトイオンである
請求項１記載の測定方法。
【請求項３】　　アルカリ溶液が、炭酸緩衝液である請
求項１及び２記載の測定方法。
【請求項４】　　アルカリ溶液が、アミンまたはアミノ
酸を含有する請求項１〜３記載の測定方法。
【請求項５】　　アルカリ溶液が、グリシンを含有する
請求項１〜３記載の測定方法。
【請求項６】　　着色剤が、還元されると変色するテト
ラゾリウム塩である請求項１〜５記載の測定方法。
【請求項７】　　着色剤を含有する中性もしくは酸性溶
液が、３−（ｐ−ヨ−ドフェニル）−２−（ｐ−ニトロ
フェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロ
ライドを含有するリン酸二水素ナトリウム溶液である請
求項１〜６記載の測定方法。
【請求項８】　　グリシン及び硫酸コバルトを含有する
ｐＨ１０．５〜１１．２の炭酸緩衝液と３−（ｐ−ヨ−
ドフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェ
ニル−２Ｈ−テトラゾリウム　　クロライドを含有する
リン酸二水素ナトリウム溶液からなる血清フルクトサミ
ン測定試薬。