JP4123181B2 - カルシウムの測定方法および測定試薬 - Google Patents
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Description
このような実状において、驚くべきことに、本発明者らは、金属イオンの代わりに、特定の金属酸化物イオン、すなわち、バナジン酸イオンを用いると、キレート発色法でも、血漿中のカルシウムを測定できることを発見した。本発明は、かかる経過により見出されたものである。
更に本発明は、バナジン酸イオンおよびキレート発色剤を含む、キレート化剤を含む生体試料中のカルシウム測定用試薬である。
(1)バナジン酸イオンは、キレート化剤(EDTA等)とは結合するが、キレート発色剤とは結合しないので非特異的な発色が抑えられ、その分の誤差がほとんどないことが考えられる。すなわち、キレート発色剤は、芳香族環を有するので、特定の配位で結合すると考えられ、立体的に込み合っている金属酸化物イオンであるバナジン酸イオンは、キレート発色剤とは結合しにくいと考えられる。一方、マンガンイオンのような他の金属イオンは、金属のまわりに立体障害がなく、特定の配位でもキレート発色剤と結合するため、その分の発色により、カルシウムを正確に測定できないと考えられる。なお、キレート化剤、例えば、EDTAは、イオン化した金属と様々な配位結合をとりうるので、バナジン酸イオン中のバナジウム、すなわち、酸素と結合して立体的に込み合っているバナジウムとも結合しやすい。
(2)バナジン酸イオンは、キレート化剤に対して、カルシウムよりキレート生成定数が大きいので、キレート化剤に結合しているカルシウムを解離させやすい。
本発明において、キレート化剤は、血液の凝固を防止するためのキレート化剤、すなわち、抗凝固用キレート化剤が好適な対象である。そのようなキレート化剤は、通常、環状構造を持たない化合物であり、血液凝固因子に関与するカルシウムと結合することにより、血液凝固を抑制できる。このようなキレート化剤として、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、クエン酸を例示できるが、EDTAが好適な対象である。
本発明で用いられるバナジン酸イオンとしては、本発明の目的に使用できるものであれば特に限定されないが、例えば、VO3 −、VO4 3−等の5価のバナジウムを含むものが好ましい。これらのバナジン酸イオンを、生体試料中に添加するときには、塩として、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属類の塩やアンモニウム塩等の塩として用いることが溶解性の面から好ましい。
カルシウムとキレート発色剤とを反応させるときは、pHが7.5以下で反応させることが好ましく、pH3.0〜7.0がさらに好ましく、pH5.0〜7.0がさらに好ましい。発色反応の際にpHが高すぎると、キレート化剤、例えば、EDTAはイオン化しやすくカルシウムと結合が強いためバナジン酸イオンを加えてもカルシウムの解離が不十分なときがある。また、pHが低すぎると、キレート発色剤が試料中の蛋白質と結合しやすくなり正誤差を与えたりすることがある。
本発明においては、試料中のキレート化剤が高濃度であった場合には、試料中のキレート化剤とは別に、さらに過剰のキレート化剤をキレート発色反応液に含有させた方が、試料中のキレート化剤の影響回避に効果がある。これは、キレート化剤を含む試料に、さらにキレート化剤を混合させた場合に、キレート発色反応液中において試料中のキレート化剤の濃度の影響を見かけ上なくすことで、試料中に高濃度のキレート化剤が含有されても影響を回避することができる。キレート発色反応するとき新たに添加した分のキレート化剤の濃度は、試料中のキレート化剤の量により適宜調整することが好ましい。
上記の第一試薬および第二試薬には、必要により、一般的に添加される成分である、アジ化ナトリウム等の防腐剤、ナトリウム等の塩類、および各種界面活性剤を適宜添加することができる。
バナジン酸イオンを含む第一試薬と生体試料とを一定温度(好ましくは25〜37℃)でかつ一定時間(例えば5分間)混合し、生体試料中のキレート化剤(例えばEDTA)とバナジン酸イオンとをキレート反応させカルシウムを解離させる。次いで、得られる液にキレート発色剤(例えばアルセナゾーIII)を含む第二試薬を加え一定温度(好ましくは25〜37℃)でかつ一定時間(例えば5分間)混合し、解離のカルシウムとキレート発色剤を発色反応させる。発色前後の反応液の吸光度を測定し、キレート発色による吸光度の変化を求め、検量線との比較等により、生体試料中のカルシウムの濃度を測定できる。なお、アルセナゾーIIIを用いた場合、吸光度は、通常、660nmで測定できる。
本発明の測定試薬でカルシウムを測定する場合、日立7150型、日立7170S型のような汎用の自動分析装置でも使用可能である。
以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
EDTA(キレート化剤)を含む生体試料中のカルシウムを、キレート発色剤であるアルセナゾーIII(以下ARZ−IIIと記載することもある)と反応させて測定する際、バナジン酸イオンの存在下で正確に測定できるかどうかを実験した。なお、比較例としてマンガンイオンの存在下や添加金属イオンがない場合も検討した。また、従来、カルシウムを測定する場合の一般的な方法である、金属イオンを添加しないオルトクレゾールフタレインコンプレクソン(OCPC)法も比較例として検討した。なお、試料、カルシウムを測定するための第一試薬および第二試薬の組成は以下のとおりである。
試料
EDTA3mMおよびカルシウム7.9mg/dlを含む生体試料
第一試薬
リン酸二水素ナトリウム 50mM pH6.2
バナジン酸アンモニウムまたは硫酸マンガン 1.0mMまたは0mM
界面活性剤 1.0%
第二試薬
塩化ナトリウム 150mM
ARZ‐III 1.0mM
界面活性剤 1.0%
種々の金属イオンによる非特異的反応
種々の金属イオンにより、ARZ−IIIが非特異的に反応するかどうかを、金属イオンとARZ−IIIと反応させることにより検討した。金属イオンとしては、EDTAとの結合定数がCa2+より大きい6種類の金属イオン、具体的には硫酸マンガン(II)、塩化ニッケル(II)、塩化鉄(II)、硫酸銅(II)、塩化コバルト、酢酸亜鉛を用い、バナジン酸アンモニウムおよび金属イオンがない場合と比較した。試薬としては以下の第一試薬および第二試薬を用いた。
第一試薬
2−Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate(MES)100mM pH6.0
金属イオン 各 0.1mM
第二試薬
塩化ナトリウム 150mM
ARZ−III 1.0mM
実施例1等に示したように、試料中に通常量のEDTAを含む場合、バナジン酸イオンを添加することでカルシウムを測定することができた。本実施例では、試料中に高濃度のEDTAが含有された場合においては、試薬に金属イオンとEDTAを加えて、カルシウムを正確に測定できることを示す。試料、測定試薬は、以下のものを用いた。測定手順は、実施例1と同様にして行った。
試料
カルシウム(7.11mg/dl)とEDTA(6,8,10mM)を含む管理血清希釈液
第一試薬
MES 100mM pH6.0
界面活性剤 0.1%
EDTA 0,0.5M
第二試薬
MES 100mM pH6.0
界面活性剤 0.1%
ARZ−III 1.0mM
バナジン酸アンモニウム 25mM
バナジン酸イオン存在下のキレート反応中の液を種々のpHにしてカルシウムを測定し、この場合の最適のpHを求めた。試料、第一試薬、第二試薬は、以下のものを用いた。
試料
カルシウム(7.9mg/dL)とEDTA(0mMまたは3mM)を含む生体試料
第一試薬
リン酸二水素ナトリウム 50mM(pH5.0,5.4,5.8,6.2,6.6,7.0)
バナジン酸アンモニウム 10mM
界面活性剤 1.0%
第二試薬
生理食塩水
ARZ−III 0.5mM
界面活性剤 1.0%
Claims (7)
- キレート化剤を含む生体試料中のカルシウムをキレート発色剤であるアルセナゾーIIIと反応させて測定するカルシウムの測定方法であって、キレート化剤と結合しているカルシウムをバナジン酸イオンの存在下で解離させて、キレート発色剤であるアルセナゾーIIIとカルシウムとを反応させて測定することを特徴とするカルシウムの測定方法。
- キレート化剤がEDTAである請求項1の測定方法。
- pH7.5以下でカルシウムとキレート発色剤であるアルセナゾーIIIとを反応させる請求項1または2の測定方法。
- pH5.0〜7.0でカルシウムとキレート発色剤であるアルセナゾーIIIとを反応させる請求項1から3のいずれかの測定方法。
- さらに過剰のキレート化剤を試薬として添加して、カルシウムとキレート発色剤であるアルセナゾーIIIとを反応させる請求項1ないし4のいずれかの測定方法。
- バナジン酸イオンおよびキレート発色剤であるアルセナゾーIIIとを含む、キレート化剤を含む生体試料中のカルシウム測定用試薬。
- さらにキレート化剤を含む請求項6の試薬。
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