JP2950592B2 - フルクトサミン測定用多層分析用具 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、体液、特に血清中のフルクトサミンを測定
する為の多層分析用具に関する。

［従来の技術］ 血清中フルクトサミンの測定は、ジョンソン（Johnso
n）およびベイカー（Baker）によって、アルカリ条件下
でのフルクトサミンの還元力をニトロテトラゾリウムブ
ルー（NTB）で測定する方法が提案されている［クリニ
カ・キミカ・アクタ（Clinica Chimica Acta）,127（19
82）87−95および特公平１−13062号公報参照］。この
方法は、フルクトサミン以外の血清中の還元性物質の影
響を除く為に、10分間のプレインキュベーションを行
い、その間にNTBと反応させて共存還元性物質を分解
し、その後の５分間（10分目から15分目）の間に反応す
るNTB量が血清中フルクトサミン量に比例するのでそれ
を測定するという方法である。

特開昭63−182567号公報には、検体中に共存する妨害
物質を強塩基または酸化剤もしくは酵素で処理するか、
あるいは脱塩して妨害物質を除去し、その後pHを10〜14
の間に調整して呈色物質（テトラゾリウム塩）を加え、
然る後に発色した色を測定するエンドポイントアッセイ
が開示されている。

特開昭63−15168号公報には、試料中の還元性成分及
び／又は混濁成分を除去する為にほぼ中性pHで試料を前
処理し、その後、pH値を10〜12に調節しかつ呈色試薬を
添加する方法が開示されている。

特昭63−304999号公報には、試料溶液にpH9〜12の緩
衝剤溶液、呈色性化合物およびウリカーゼ、ならびに少
なくとも１種の洗浄剤を加え、早くとも５分後に20〜40
℃の温度範囲で吸光度の時間的変化を反応速度論的に測
定する方法が開示されている。

［発明が解決しようとする課題］ ジョンソンおよびベイカーの方法は、当業者で言うウ
エットケミストリーの方法であり、アルカリ条件下で37
℃に温調し、10分から15分の吸光度変化を測定してい
る。

また、体液試料中の還元性物質を前もって、酸化剤や
酵素で分解した後、フルクトサミンの還元力を測定する
方法が特開昭63−182567号公報に開示されているが、操
作が２段階となり繁雑で長時間を要する。

特開昭63−304999号公報にはアルカリ条件下で体液中
の還元性物質や混濁を除去する為に酵素や酸化剤と同時
に界面活性剤が使用されている。この場合にも還元性物
質が消去され混濁が澄明化するまでに早くとも５分以上
のプレインキュベーションの時間を要する。

上記従来技術に記載の方法はいずれもウエットケミス
トリーに属する測定方法であり、測定の際には、反応セ
ルを用いて吸光度の変化を測定しなければならない。

一般に、フルクトサミンとの発色反応に用いられるテ
トラゾリウム塩の還元によって生成したホスマザンは、
反応セルやフローセルに強固に付着してバックグランド
を上昇させ、誤差の原因となる。特に近年、多くの施設
に普及している自動分析機で測定した場合、反応管や輸
送チューブ、フローセルに生成ホルマザンが沈着し、自
動分析機を汚染して他の項目が測定できない状態になっ
てしまう。さらに付着したホルマザンは取れにくい為、
強い酸や界面活性剤に各種器具、部品を１夜浸漬しなけ
ればならないと言う繁雑さがあった。

また、このフルクトサミンの測定試薬はpH10以上の強
アルカリ性で、反応後の廃液は排水を強アルカリ性と
し、環境汚染の原因となる。

一方、ウエットケミストリーに対してドライケミスト
リーと呼ばれる方法があるが、ドライケミストリーでは
体液試料１滴（数μ）を用いて反応を行う為、10分以
上反応させると乾燥が進行し、測定精度が悪くなるとい
う欠点がある。測定時間を10分以内に短縮すると体液中
の還元性物質の影響を受け、正確なデータが得られない
という問題があった。

本発明は、これらの従来技術の問題点を解決すると共
に、フルクトサミンの測定ではほとんど不可能と考えら
れていたドライケミストリー技術を応用して、体液中の
フルクトサミンを短時間で簡易に測定する分析要素を提
供するものである。

［課題を解決するための手段］ 本発明は、上記課題を解決するため、液体不浸透性支
持体、該支持体上に形成されたpH8〜12の緩衝剤含有
層、および該緩衝剤含有層上に形成されたテトラゾリウ
ム塩含有層からなるフルクトサミン測定用多層分析要素
を提供する。

所望により、本発明のフルクトサミン測定用多層分析
要素は、緩衝剤含有層とテトラゾリウム塩含有層との間
に、緩衝剤とテトラゾリウム塩との接触を防止するため
の一種の保護層である中間層を有していてよい。

本発明の多層分析要素では、液体不浸透性支持体とし
ては、液体不浸透性のプラスチックフィルムが好ましく
用いられるが、液体不浸透性であれば他の材料、たとえ
ば紙、金属箔などを用いてもよい。

緩衝剤は、pH8〜12の範囲で緩衝能を持つものであれ
ばいずれでも良い。特に炭酸緩衝剤が好適である。

テトラゾリウム塩としては、フルクトサミンと反応し
て発色するものならば制限なく用いることができるが、
中でも3,3′−［3,3′−ジメトキシ−（1,1−ビフェニ
ル）−4,4′−ジイル］ビス［２−（ｐ−ニトロフェニ
ル）−５−フェニル−2H−テトラゾリウムクロリド］
（NTB）、3,3′−［3,3′−ジメトキシ−（1,1′−ビフ
ェニル）−4,4′−ジイル］ビス［2,5−ビス（ｐ−ニト
ロフェニル）−2H−テトラゾリウムクロリド］（TNT
B）、3,3′−（1,1′−ビフェニル−4,4′−ジイル）ビ
ス（2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムクロリド）
（NeoTB）、３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−
ニトロフェニル）−５−フェニル−2H−テトラゾリウム
クロリド（INT）、３−（4,5−ジメチル−２−チアゾリ
ル）−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブロミド
（MTT）、2,5−ジフェニル−３−（１−ナフチル）−2H
−テトラゾリウムクロリド（TV）などが好ましい。

本発明のフルクトサミン測定用多層分析要素の緩衝剤
含有層には、ウリカーゼを含ませることができる。ウリ
カーゼは、体液中の還元物質である尿酸を短時間で分解
するので、フルクトサミン測定における尿酸の影響を排
除することができ、測定時間を短縮することができる。

本発明のフルクトサミン測定用多層分析要素は、液体
不浸透性支持体材料の上に、緩衝剤含有層、必要に応じ
て形成される中間層、およびテトラゾリウム塩含有層を
順次積層することにより製造できる。

まず、緩衝剤をバインダーと共に適当な溶剤に溶解
し、溶液を支持体材料の上に塗布し、乾燥する。

緩衝剤含有層を形成する為のバインダーとしてはポリ
ビニルピロリドン（PVP）、ヒドロキシプロピルセルロ
ース（HPC）、メチルセルロース（MC）、ポリアクリル
アミド、ゼラチンなどの親水性高分子が好ましく使用さ
れる。

中間層を形成する場合、適当な樹脂成分を、緩衝剤お
よびテトラゾリウム塩を溶解しない溶媒に溶解し、溶液
を緩衝剤含有層上に塗布し、乾燥して中間層のフィルム
を形成する。溶媒としては、イソプロピルアルコール、
アセトン、クロロホルム、塩化メチル、トルエンなどが
好適である。樹脂成分として、HPC、PVPなどが用いられ
る。

テトラゾリウム塩は、溶液として多孔性マトリック
ス、例えば濾紙、布、イソブレンフィルターなどに含浸
し、乾燥し、要すれば中間層と共に緩衝剤含有層にラミ
ネートする。テトラゾリウム塩の溶解性を良くする為
に、界面活性剤を用いても良い。

緩衝剤含有層、中間層およびテトラゾリウム塩含有層
の厚さは、適宜定めればよいが、好ましくは、緩衝剤含
有層の厚さは、ウェット厚200μｍ、中間層の厚さはウ
ェット厚150μｍ、テトラゾリウム塩含有層の厚さは、2
50μｍである。

液体不浸透性支持体、緩衝剤含有層、テトラゾリウム
塩含有層および要すれば中間層からなる積層体を適当な
大きさ、たとえば５×7mmにカットし、ベースフィルム
に両面テープ、接着剤などで固定し、測定に供する。

フルクトサミンの測定は、多層分析要素にフルクトサ
ミンを含む検体を点着し、テトラゾリウム塩の発色を既
知の方法により測定して行うことができる。具体的な方
法は以下の実施例において説明する。

［実施例］ 次に、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、
本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１ 緩衝剤含有層を形成する為に、下記成分： 炭酸ナトリウム 3.18g 炭酸水素ナトリウム 0.84g 精製水 86g PVPK−90 10g を混合し、調製した塗工液を不透明ポリエチレンテレフ
タレート（PET）フィルムにウエット厚200μｍでコーテ
ィングし、40℃で30分乾燥する。

テトラゾリウム塩含有層を形成する為に、下記成分： NTB 700mg メタノール 10g 精製水 14.3g を混合して含浸液を調製し、これを、綿又はポリエステ
ル製の布に含浸し、40℃で30分乾燥する。

中間層として、下記成分： HPC 2g イソプロパノール 98g からなる溶液を緩衝剤含有層の上にコーティングし、そ
の上にテトラゾリウム塩含有層をラミネートした後、40
℃で30分乾燥する。

得られた積層体を、5mm×7mmにカットし、PET片5mm×
8mmの先端に両面テープで固定し、試験片とした。

［直線性］ フルクトサミンを高濃度に含有する人血清を精製水で
段階希釈し、その６μをこの試験片の多層分析要素部
分に点着し、37℃でインキュベートし、インキュベート
開始後５分から７分での反射率をモニターする。反射率
はクベルカ−ムンク（Kubelka−Munk）の式に従ってK/S
値に換算し、その差（ΔK/S）を求めた。結果を第１表
に示す。

これをプロットすると、第１図に示すように良好な希
釈直線性が得られた。

実施例２ ［体液中の共存物質の影響］ アスコルビン酸の影響 人血清にアスコルビン酸を添加し、各種アスコルビン
酸濃度の検体を調製し、各６μを実施例１と同様に作
成した試験片の多層分析要素部分に点着し、37℃でイン
キュベートする。実施例１と同様に５分〜７分のΔK/S
を測定した。結果を第２表に示す。

第２表の結果から理解されるように、本発明の多層分
析要素はアスコルビン酸の影響をほとんど受けない。

尿酸の影響 人血清に尿酸を添加し、各種尿酸濃度の検体を調製
し、各６μを実施例１と同様に作成した試験片の多層
分析要素部分に点着し、37℃でインキュベートする。実
施例１と同様に５分〜７分のΔK/Sを測定した。結果を
第３表に示す。

ΔK/Sは尿酸によってわずかに高値になる傾向がある
が、本発明の多層分析要素は尿酸により実質的に影響を
受けないことが分かる。

第２図に示すK/Sの時間変化から、５分以内で尿酸の
ほぼ全量がNTBと反応していることが判る。

本発明の多層分析要素は、アスコルビン酸および尿酸
の他、グルタチオン、ビリルビン、溶血、混濁の影響も
ほとんど受けない。

実施例３ 種々の患者血清を用いてリファレンス（Reference）
法［ロッシュ（Roche）キット］との相関を測定した。
その結果、第３図に示すように、相関係数γ＝0.98と良
好な相関性が得られた。

実施例４ 緩衝剤含有層を形成する為に、下記成分： 炭酸ナトリウム 0.318g 炭酸水素ナトリウム 0.084g 精製水 8.6g PVPK−90 1.0g ウリカーゼ 4000単位 を混合し、調製した塗工液を不透明ポリエチレンテレフ
タレート（PET）フィルムにウエット厚200μｍでコーテ
ィングし、40℃で30分乾燥する。

テトラゾリウム塩含有層を形成する為に、下記成分： NTB 700mg メタノール 10g 精製水 14.3g を混合して含浸液を調製し、これを、綿又はポリエステ
ルとナイロン混紡の織布に含浸し、40℃で30分乾燥す
る。

中間層として、下記成分： HPC 2g イソプロパノール 98g からなる溶液を緩衝剤含有層の上にコーティングし、そ
の上にテトラゾリウム塩含有層をラミネートして40℃で
30分乾燥する。

得られた蓄層体を、5mm×7mmにカットし、PET片5mm×
80mmの先端に両面テープで固定し、試験片とした。

人血清、および人血清に尿酸を添加して尿酸濃度が約
20mg/dと成るように調製した検体の各６μを、実施
例１および実施例４で作成した試験片それぞれの多層分
析要素部分に点着し、実施例２と同様にK/S値を測定し
た。結果を第４表および第４図に示す。

実施例４では、４〜６分に反応時間を早めても、尿酸
の影響を受けずに問題なくフルクサトミン濃度を測定で
きることが分かる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１における５〜７分でのΔK/Sとフル
クトサミン濃度との関係を示すグラフ、 第２図は、実施例２におけるK/Sの時間変化を示すグラ
フ、 第３図は、本発明による測定と従来法との相関を示すグ
ラフ、および 第４図は、実施例１（点線）と実施例４（実線）の試験
片についてのK/Sの時間変化を示すグラフである。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】液体不浸透性支持体、該支持体上に形成さ
   れたpH8〜12の緩衝剤含有層、および該緩衝剤含有層上
   に形成されたテトラゾリウム塩含有層からなるフルクト
   サミン測定用多層分析用具。
2. 【請求項２】緩衝剤含有層およびテトラゾリウム塩含有
   層の間に、更にこれら両層の接触を防止する中間層を有
   する請求項１記載のフルクトサミン測定用多層分析用
   具。
3. 【請求項３】緩衝剤含有層がウリカーゼを更に含む請求
   項１記載のフルクトサミン測定用多層分析用具。