DE3502200A1 - Gebrauchsfertiges, fluessiges reagens zum bestimmen des glucosegehaltes von blut - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein gebrauchsfertiges, flüssiges Reagens zum Bestimmen des Glucosegehaltes von Blut.

Zum Bestimmen des Glucosegehaltes von Blut (Plasma oder Serum) werden meistens das Trinder-Verfahren oder dessen Abwandlungen benutzt. Bei diesen Verfahren wird der Glucosegehalt von Blut mit Hilfe der Glucoseoxydase und der Trinder-Farbreaktionen in den folgenden Schritten durchgeführt:

jC-D-Glucopyranose + HpO ■■■ · al-D-Glucose .. .H₃O «—■*·

(D (36%) ( < 0,1%)

ρ -D-Glucopyranose + H_?0
(64%)

β -D-Glucopyranose +

η (2)

A -lacton+H„0

pOp.

2Hp0p+Phenol+4-Aminophenazon ,,„ g 4-(p-Benzochinon-

(3) monoimino)-phenazon + 4H_0.

Das Reagens besteht aus einer für die Glucoseoxydase bzw. Peroxydase geeignet gepufferten Enzymkomponente und einem Chromogen, insbesondere 4-Aminophenazon und Phenol oder dessen Derivaten. Die Reagenzien müssen bei Gebrauch re-

konstituiert, d.h. zur ursprünglichen Konzentration gelöst werden. Das gebrauchsfertige Reagens besitzt nach seiner Rekonstitution nur noch eine begrenzte Stabilität. Es ist mit dem Nachteil behaftet, nicht langer als 60 Tage und durchschnittlich 30 Tage haltbar zu sein.

Zur Rekonstitution sind die beiden folgenden Verfahren bekannt :

I. Hinzufügen von Wasser zu einem Enzym-Chromogengemisch.

II. Mischen der Enzymkomponente und des Chromogens, die in diesem Fall getrennt aufbewahrt werden.

In beiden Fällen ist der Benutzer gezwungen, das gebrauchsfertige Produkt selbst anzusetzen. Bei dieser, wenn auch einfachen, Zubereitung treten jedoch häufig technisch bedingte Fehler auf. Im einen Fall wird destilliertes Wasser von einer solch hohen Reinheit benötigt, wie es nur selten zur Verfugung steht. Das in den Labors für klinische Tests zur Verfügung stehende deionisierte Wasser enthält häufig noch Spuren von Chlor, und seine Reinheit ist besonders im Sommer ungenügend. Beim Mischen führt hingegen ein Verschütten der Komponenten oder ungenügendes Ausfließen der Reagenzien aus den Flaschen zu einer anderen als der gewünschten Konzentration. Außer diesen beiden Fehlerquellen kann es auch zu einem inhomogenen Mischen von gelöstem Stoff und Lösungsmittel kommen, wenn das Enzym aus einem wasserfreien Pulver besteht und zusammen mit einem schlecht löslichen Puffer wie z.B. Phosphatpuffer genutzt wird.

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Bei pulverförmiger! Reagenzien kommt es häufig vor, daß das Mischungsverhältnis der Pulverbestandteile selbst innerhalb einer Fabrikationsserie in einem weiten Bereich schwankt und daraus eine unvollkommene Homogenität resultiert. Bei lyophilisierten Enzymen besteht die Gefahr, daß die Enzymaktivität abhängig von der Lage der einzelnen Flasche und ihrem Platz auf der Platte während der Lyophilisation unterschiedlich zufällig reduziert wird und sich somit unterschiedliche Konzentrationen bzw. Aktivitäten ergeben. Ausser den oben erwähnten die Reproduzierbarkeit beeinträchtigenden Nachteile verursachen die bekannten Reagenzien aus den folgenden Gründen sehr hohe Produktionskosten.

Die bekannten Reagenzien zum Bestimmen des Glucosegehaltes von Blut liegen entweder als wasserfreie Pulver oder als Lyophile vor. Die Produktion von wasserfreien Pulvern erfordert feuchtigkeitsgesteuerte Räume, in denen die Beschäf- \ tigten infolge der starken Beanspruchung ernsten Risiken ausgesetzt sind. So kann es bei der Verwendung von Enzymenpulvern insbesondere in Verbindung mit Natriumazid oder anderen Puffern zu manchmal irreversiblen Schaden an den Atmungsorganen der Beschäftigten kommen, wenn sie längere , >, Zeit diesen Substanzen ausgesetzt sind. Außerdem kann der ' jahrelange Umgang mit solchen Enzymen zu einer Sensibili- : sierung und daraus folgenden Körperschäden führen.

Die zur Lyophilisation benötigten Anlagen erfordern hinge- ; gen neben hohen Investitionskosten einen hohen Verbrauch an elektrischer Energie und Wasser.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Reagens zu ' schaffen, das nicht mit den oben genannten Nachteilen behaftet ist und ohne lange Rüstzeiten (Mindestzeit für den Ansatz der Reagens) auskommt.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine katalasefreie Glucoseoxydase (GOD) und ein nichtionisches oberflächenaktives Agens als Stabilisator gelöst. Diese Kombination ergibt ein stabiles, homogenes und gebrauchsfertiges Flüssigreagens. Die homogene Konzentration der Enzymaktivitäten der Einzelkomponenten ist besonders vorteilhaft, weil die Reaktionsgeschwindigkeit /^A/ ^t (A = Absorption oder Extinktion) des farbigen Chromogens in einer bestimmten Beziehung zum Verhältnis U/l Glucoseoxydase steht, wobei U (GOD-Einheit) die Enzymmenge ist, die unter Testbedingungen die Umsetzung von 1 /irnol Glucose in einer Minute bei 25 C und einem pH-Wert von 7,0 (Natriumphosphatpuffer) bewirkt.

Dies ist der Grund dafür, daß sich bei den herkömmlichen Reagenzien teilweise erhebliche Aktivitätsunterschiede ergeben, selbst wenn die Flaschen aus einem Los stammen. Demzufolge ergeben sich Probleme bei der sogenannten Festzeittechnik.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Reagenzes besteht darin, daß es wegen der Gleichheit aller Flascheninhalte für die erwähnte Festzeittechnik geeignet ist. Bei dieser Technik muß die Glucoseoxydation durch GOD in bezug auf die β -Glucose einer Pseudo-Erster-Ordnung-Kinetik folgen. Das verursacht eine Reihe von Kettenreaktionen, auf die das Kinetikprinzip der Festzeittechnik-Messungen angewendet werden kann. Das erfindungsgemäße Reagens ist auch besonders für schnelle Analysierer geeignet.

Vorzugsweise besteht das erfindungsgemäße Reagens aus 9000 bis 40000 U/l GOD und 5 mg/1 bis 50 g/l eines nichtionischen oberflächenaktiven Agenzes. Als nichtionisches ober-

flächenaktives Agens eignet sich vorzugsweise Polyoxyäthylen (POÄ), beispielsweise POÄ-Tridecylalkohol und POÄ-Nonylphenol (RENEX), POÄ-Oktylphenol (TRITON CgH₁₇-C₆H₄ CH₂)_n-OH) und POÄ Lauryl-, Zetyl-, Stearyl-, Oleylalkohol (BRIJ). Ebenfalls sehr gute Ergebnisse zeitigen die folgenden oberflächenaktiven Agenzien: Hydrooxypolyäthylen-Äthoxydodekan (C₁₂H₃₅-(0-C₂H₄)_n-0H) oder der Lauryläther des Polyoxyäthylenglycols (THESIT).

Eine katalasefreie Glucoseoxydase wurde bisher weder von : Trinder noch von anderen Autoren in Erwägung gezogen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines in der Zeich- ' nung erläuterten Ausführungsbeispiels näher beschrieben. In

der Zeichnung zeigen: Γ

Fig. 1 ein Reaktionsdiagramm zweier erfindungsgemäßer { Reagenzien A und B; ;

Fig. 2 ein Reaktionsdiagramm des erfindungsgemäßen Reagenzes A und

Fig. 3 die Abhängigkeit der Absorption von der Standardkonzentration des erfindungsgemäßen Reagenzes.

In Fig. 1 ist die Reaktionskinetik der folgenden zwei Rea- ' genzien dargestellt:

A, B Mengen bezogen auf

1000 ml des Reagenzes ί

GOD 9 000 - 40 000 U

Peroxidase 300 - 3 000 U

4-Aminoantipyrin 0,1 - 1,5 mMol

Phenol 1,5 - 15,5 mMol

Phosphatpuffer pH 6,5-11,4

Bei der Zusammensetzung A diente als oberflächenaktives Agens POÄ-Laurylalkohol (BRIJ 35) mit einer Konzentration von 5 mg/1 bis 50 g/l.

Bei der Zusammensetzung B diente hingegen POÄ-Octylphenol (Triton-XlOO) in einer Konzentration von 5 mg/1 bis 50 g/l als oberflächenaktives Agens.

Im Diagramm der Fig. 1 ist die Abhängigkeit der Absorption (Ordinate) von der Reaktionszeit (Abszisse) der beiden Reagenzien A und B dargestellt. Die nach Perkin-Elmer gemessenen und geplotteten Reaktionskinetiken der Reagenzien A und B sind nahezu gleich, obwohl die oberflächenaktiven Agenzien verschieden waren.

Um die Konstanz der Produktquälität zu demonstrieren, ist im Diagramm der Fig. 2 die Absorption einer Probe der Zusammensetzung A dargestellt, die im Februar 1983 zubereitet und im Januar 1984 getestet wurde.

Nach den Diagrammen der Fig. 1 und 2 wird jeweils nach einer Reaktionszeit von 10 Min. das Absorptionsmaximum erreicht; außerdem besteht auch bei hohen Konzentrationen von 500 mg/dl hinsichtlich des Kurvenverlaufs Übereinstimmung mit der Theorie.

Die in den Fig. 1 und 2 dargestellten Ergebnisse wurden unter extremen Bedingungen erreicht. So wurde statt des

normalerweise erforderlichen undurchsichtigen Gefäßes ein transparentes Gefäß benutzt, das zudem öfter geöffnet und wieder verschlossen wurde. Für die Absorption von weiß gegen H₉O wurde ein Wert von 0,128 gemessen, der durchaus akzeptabel ist, wenn man berücksichtigt, daß die Absorption eines Reagenzes bei direktem Licht ansteigt.

Bei einem Versuch ergab sich das Diagramm der Fig. 3, in dem die Absorption eine Probe der Zusammensetzung A als Funktion der Konzentration einer Standardprobe dargestellt ist. Das Diagramm wurde mittels eines Computers aufgrund von Standardproben mit einer Konzentration von 25, 50, 100, 200, 400 und 500 mg/1 geplottet; es zeigt die absolute Linearität bis hin zu einer Maximalkonzentration von 500 mg/1. Das Verhältnis Reagenz/Probe betrug 1.000 ul/10 jxl, die Reaktionszeit 10 Minuten und die Farbe blieb für etwa 1 Stunde stabil.

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Claims (5)

Dr.-lng. Reiman Kph*fcj" - ·■' :pipl.4-lng. Klaus Bergen Wilhelm-Tell-Stn. 14 4OOO Düsseldorf 1 Telefon 39 7O SB Pat.ont.anwnlr.f 350220Ü 23. Jan. 1985 ■ i , 35 881 K A. MENARINI s.a.s, 50131 FIRENZE, Italien, Mo. 3, Via dei Sette Santi "Gebrauchsfertiges, flüssiges Reagens zum Bestimmen des Glucosegehaltes von Blut" Patentansprüche:

1. Gebrauchsfertiges, flüssiges Reagens zum Bestimmen des Glucosegehaltes von Blut, gekennzeichnet durch eine katalasefreie Glucoseoxydase und ein niohtionisches, oberflächenaktives Agens als Stabilisator.

2. Reagens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch 9000 bis 40000 U/l Glucoseoxydase und 5 mg/1 bis 50 g/l nichtionisches, oberflächenaktives Agens.

3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das nichtionische oberflächenaktive Agens aus Polyoxyäthylen besteht.

4. Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtionische oberflächenaktive Agens aus POÄ-Laurylalkohol besteht.

BAD ORIGINAL

5. Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtionische Agens aus POÄ-Octylphenol besteht.