DE2023989C3 - Verfahren zur Herstellung von aus Antigen-Trägerstoffgemischen bestehenden und gegebenenfalls Antikörper enthaltenden fertigen serodiagnostischen, auf einen Objektträger aufgebrachten lagerbeständigen Testsubstanzen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von aus Antigen-Trägerstoffgemischen bestehenden und gegebenenfalls Antikörper enthaltenden fertigen *5 serodiagnostischen, auf einen Objektträger aufgebrachten lagerbeständigen Testsubstanzen.

Zur Zeit sind bereits derartige, auf Antigcn-Antikörpir-Reaktionen beruhende serologische Verfahren bekannt, die es ermöglichen, unterschiedliche Eiweißkörper bzw. normale oder pathologische Antikörper nachzuweisen. Als Beispiel so!! der Nachweis folgender Substaven mit Hilfe serodiagnostischer Testsubstanzen erwähnt werden: Wachstumshormon (P. Weiser: Fme Methodik der Bestimmung hypophysärcr üonadotropme mittels Hämagglutinations-Hemmungsreaktion, ZbI. Gynäk., 87 [1965], H. 46, S. 1569 bis 1573); während der Schwangerschaft im Harn erscheinendes Choriongonadotrophormon (Joyce L. Bell: Comparative Study of Immunological Tests for Pregnancy Diagnosis. Journal of Clinical Pathology, Vo!. 22, S. 79 [1969]); pathologische Antikörper im Falle bestimmter Schilddrüsenkrankheiten (Martti Oka, Pentti Seppälä, Leena Mikkonen: Latex Slide Test in Thyroid Diseases. Acta Medica Scandinavica, Vol. 179, fase. 2 [1966]); pathologisches Eiweiß im Blutserum an rheumatologischen Krankheiten leidender Kranken (J. M. Singer, Ch. M. Plotz: Am. J. Med., 21, S. 888 [1956]; O. Tonder: Studies on the Mechanism of the Waaler-Rose Test. Norwegian University Press, Bergen, Oslo, 1962); pathologischer Antikörper in Pfeifferschem Drüsenfieber (Beatrice Saemann-Na viI Ie: Mononucleose-Schnelltest. Objektträger-Agglutination formolosierter Pferdeerythrocyten. Schweiz, med. Wschr., 96, Nr. 69, S. 1649 bis 1651 [I960]; G. Hoff, S. Bauer: A new rapid Slide Test for Infectious Mononucleosis. J. Amer. med. Ass., 194, S. 351 [1965], usw.).

Bei einem Teil der ;rwä'r.nten Verfahren wird das für die Untersuchung notwendige Antigen, bzw. der Antikörper an lyoph'üsierte Schaferythrocyten gebunden, bei einem anderen Teil dagegen an Kunststoffe, z. B. an Polystyrol-Latex-Teilchen. Für die erwähnten serologischen Verfahren ist in zahlreichen Fällen die Anwendung einer aufwendigen Laboratoriumseinrichtung erforderlich, aber auch die einfachen Methoden sind dadurch kompliziert, daß für ihre Ausführung nicht nur das zu prüfende Blutserum oder der Harn ist in vielen Fallen lur m
riumsfachkundigke.t notwena g.

Ziel der Erfindung ^.:f^ der bekannten - auf trymra.y ^ tination beruhenden - immuno ogJ*^he" zu beheben und em Verfahren auszuarten das es ermöglicht wird, die notwendigen Reagenz.cn im für die Untersuchung bereiten Zustand auf den Objektträger einzutrocknen. Verfahren

Dies wird gemäß der Erfindung be, einem Verfahren der obengenannten Art dadurch erreicht daß man an vorbehandelte Schaferythrocyten oder Poystvr,·!- Latex gebundene Antigene und gegebenenfalls Antikörper mit einer wäßrigen Lösung von Polyvinylalkohol mit einem Verseifungsgrad von 86 bis 89 Molprozent und einer Viskosii.il von 3,5 bis 4,5 cP in einer 4"„igen wäßrigen Lösung bei 20'C (Höppler-Viskosimeter), die ein bakterizides Mittel enthält verrührt und nach dem Auftropfen auf den Objektträger ein-

trocknet.

Durch die erfindungsgemäß erfolgende Verwendung von Polyvinylalkohol als Filmbildner sind die Reageiizien nach dem Eintrocknen von einer Schutzschicht überzogen, die ihr Abreiben, ihr Ablösen oder mre Zerstörung verhindert. Auf diese Weise gelingt es die Lagc.oeständigkeit, Genauigkeit und Zuverlässigkeit solcher Testverfahren erheblich zu steigern, tin weitcrer Vorteil besteht darin, daß die Ergebnisse längere Zeit aufbewahrt werden können.

Der bei dem erfindungsgemaßen Verfahren verwendete Polyvinylalkohol besitzt einen pH-Wert von 5 bis 7.

Aus Zeitschrift für Hygiene, 125, V MW U^), ist es zwar bereits bekannt, serodiagnostische Agglutinationsreaktionen mit getrockneten Mikrobensuspensionen auf Objektträgern vorzunehmen, doch genügen die auf diese Weise hergestellten Präparate nicht den Anforderungen der Praxis hinsichtlich der Lagerbeständigkeit, der Genauigkeit und der Zuverlässigkeit. Erst die Verwendung von Polyvinylalkohol mit den angegebenen Spezifikafoner. als filmbildendes Mittel ermöglicht es, Testpräparate herzustellen, welche den entsprechenden Anforderungen der Praxis genügen.

In der wäßrigen Lösung der filmbildenden Substanz kann gegebenenfalls als bakterizides Mittel, z. B. Thiomersal (Natriumäthyl-mercuri-thiosalicylat) oder Natriumchlorothiazid verwendet werden.

Die Untersuchungspiatte oder der Objektträger kann eine Metall-, Glas-, Spiegel- oder Kunststoffplatte sein, die gegebenenfalls mit Lack überzogen wird. Die mit Lack überzogenen Objektträger werden zweckmäßig 24 Stunden lang getrocknet, und die mit Umbildender Substanz bereitete wäßrige Lösung der Antigen-Antikörper-Komplexe wird nur nachher auf die Oberfläche des nach dem Lackieren getrockneten Objektträgers getropft.

Das erfindungsgemäß hergestellte und am Objektträger eingetrocknete Präparat ist für die Ausführung der auf direkter und passiver Hämagglutination beruhenden diagnostischen Verfahren vorzüglich geeignet, in denen an Platten eingetrocknete und längere Zeit lagerfähige Mikromengen als Reagenz angewandt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht

3 4

außer e;ner bedeutenden Ersparung der diagnostischen schicht auflöst. Nach 30 Sekunden Wartezeit wird verReagenzien, daß die Reagenzien, nachdem sie mit mischt, dann wird die Platte fein hin und her gekippt einem wesentlich einfacheren Verfahren als die bislang und so kann das Ergebnis der Agglulinationsprobe im bekannten im zur Verwendung bereiten Zustand ein- Laufe von 5 Minuten auf die übliche Weise ausgegetrocknet wurden, ohne Laboratoriumseinrichtung 5 wertet werden, im Ordinationszimmer oder beim Krankenbett einfach

und schnell als Hilfsmittel der ärztlichen Diagnostik Beispiel 2

verwendet werden können. Die errindungsgemäßc ,, „ . _ ,.,·»·

Ausführung der Probe ist noch mit dem Vorteil ver- Herstellung eines Gammaglobulin-Antigen-seroIogi-

bunden, daß nach dem Abklingen der Reaktion zwi- io ^schen Diagnostikums

sehen dem Diagnostikum und dem Blutserum oder Der auf bekannte Weise hergestellten, an Polystyrol-

dem Harn sich am für die Auswertung bereiten Unier- Latex-Teilchen gebundenen Gammaglobulin-Anligen-

suchungsmaterial die Schutzschicht auf reversible Weise Suspension (Gamma Latex) wird ein dem halben

von neuem ausgebildet hat, und somit kann das Volumen der Suspension entsprechendes Volumen

Untersuchungsergebnis am Objektträger gebunden 15 wäßrige Poiyvinylalkohollösung der angegebenen Art

aufbewahrt werden. zugefügt. Die Methylcellulose wird in 5%iger Lösung

Auf das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. Der Suspension wird ein bakterizides

gewonnene Reagenz wird nur ein Tropfen der zu Mittel, z. B. Natriumchlorothiazid, in einer Verdün-

prüfenden Substanz getropft, deren Wassergehalt die nung von 1:5000 zugefügt. Die fertige Suspension wird

Schutzschicht auflöst, und auf diese Weise kommt die 10 auf die im Beispiel I angegebene Weise auf eine

erwünschte Reaktion zustande. Das erfindungsgemäßc lackierte Metallplatte getropft und eingetrocknet. Mit

Verfahren wird mit Hilfe der nachstehenden Ausfüh- dem erfindungsgemäß hergestellten Gammaglobulin-

rungsbeispiele näher erläutert. Antigen-Präparat erfolgt die Prüfung des Rhe-jma-

faktors auf die im Beispiel I angegebene Weise, mit

Beispiel 1 as der Abweichung, daß das zu prüfende Blutserum zuvor

υ , „ . _, .. . . . , mit einem Borat-Puffer von pH 8,2 lOfach verdünnt

Herstellung eines Thyreoidea-Antigen-serologischen _wjr(j

Diagnostikums

Der auf bekannte Weise hergestellten, an Polystyrol- Beispiel 3

Latex-Teilchen gebundenen Thyreoidea-Antigen-Sus- 3° ,, ,, . „ , , ,· . .· .

pension wird eine dem halben Volumen der Suspension »"stellung eines Gammaglobulm-Ant.gen-serolog.-

entsprechende Volumenlösung von Polyvinylalkohol ^schen Diagnost.kums

der angegebenen Art zugefügt. Der auf bekannte Weise hergestellten, an mit 3%iger

Die Konzentration des Polyvinylalkohole beträgt in Formaldehydlösung konservierte Schaferythrocyten

Wasser oder in physiologischer Kochsalzlösung etwa 35 gebundenen Gammaglobuliri-Antigen-Suspension wird

18%. Dieser Lösung wird in 1:5000 Verdünnung ein dem halben Volumen der Suspension entsprechen-

Thiomersal oder Natriumchlorothiazid als bakterizides des Volumen Poiyvinylalkohollösung zugefügt. Die

Mittel zugefügt. Konzentration des angewandten Polyvinylalkohol ist

Von der hergestellten Suspension wird auf eine mit mit der im Beispiel I angegebenen übereinstimmend. Nitrolack lackierte Metallplatte I Tropfen (0,05 ml) 4° Die auf diese Weise hergestellte Suspension wird auf getropft, und der Tropfen wird eingetrocknet. Für das die im Beispiel I beschriebene Weise auf eine lackierte Eintrocknen wird nach Bedarf ein Ventilator verwen- Metallplatte getropft und eingetrocknet. Statt der det. Hinsichtlich der Qualität der angewandten Metall- Metallplatte kann die Suspension auch auf eine Spieplatte ist es am wichtigsten, daß im Laufe der Ausfüh- gelfläche getropft werden. Ausführung der Unterrung der diagnostischen Probe die gut sichtbare Aus- 45 suchüng:

wertung des Ergebnisses ermöglicht sein soll. Für die- Mit dem erfindungsgemäß hergestellten Gamma-

sen Zweck ist z. B. eine im Vakuum gegossene Metall- globulin-Antigen- Präparat erfolgt die Untersuchung

platte aus hochreinem, temperiertem, vernickeltem und des Rheumafaktorb auf die im Beispiel 2 beschriebene

magnetisiertem Metall von niedrigem Gasgehalt mit Weise,
folgender Zusammensetzung geeignet: 5°

C 0,06% Beispie. 4

Si 0,04% Herstellung eines Choriongonadotrophormon-Anti-

P 0,22% gen- und -Antikörper-serologischen Diagnostikums

^ °'⁰² % 55 Der auf bekannte Weise hergestellten, an Polystyrol-

^Mn °·²⁵ /° Latex-Teilchen gebundenen Choriongonadotrophor-

^" ⁰^⁰" £> mon-Antigen-Suspension wird ein dem halben VoIu-

P · j] ⁰^ {" men der Suspension entsprechendes Volumen PoIy-

^he 99,35/, vinylalkohollösung der im Beispiel 1 angegebenen

Nach dem Eintrocknen bildet sich eine Schutzschicht, ⁶° Konzentration zugefügt. Gleichzeitig mit dem erwähn-

wodorch das Reagenz für längere Zeit in zur Verwen- ten Antigen wird mit obiger Polyvinylaikohollösung

dung bereitem Zustand konserviert wird. aus einem Anti-Choriongonadotrophormon-Antikör-

Mit dem fertigen Reagenz kann die Untersuchung per enthaltenden Immunserum eine so stark verdünnte

des Thyreoidea-Antikörpcrs auf folgende Weise unter- Lösung hergestellt, deren in der Reaktion verwendete

nommen werden: Auf das an dtr lackierten Metall- 65 Menge durch 1,5 bis 2 IE HCG/ml Harn neutralisiert

platte eingetrocknete Antigen wird 0,05 ml des zu wird.

prüfenden Blutserums getropft, auf dessen Wirkung Die derart vorbereitete Antigcnsuspension und Im-

sich die das Reagenz bedeckende Polyvinylalkohol- munserumlösung werden in je 0,05 ml Menge separat

auf dieselbe lackierte Metallplatte getropft und auf die im Beispiel 1 angegebene Weise eingetrocknet. Ausführung der Untersuchung:

Mit dem erfindungsgemäß hergestellten, unter anderem zur Schwangerschaftsfeststellung dienenden Präparat kann die SchwanRersdiaftsuntersuchung auf folgende Weise unternommen werden:

Auf das an der lackierten Metallplatte eingetrocknete Antigen und auf das immunserum werden ic 0.2 ml des zu prüfenden Harns getropft, auf dessen Wirkung sich die Reagenzien bedeckende Polyvinylalkoholschicht auflöst. Nach 30 Sekunden Wartezeit werden die Tropfen vermischt, dann wird weitere 4 Minuten gewartet, nachher wird die Metallplatte fein hin und her gekippt, und das Ergebnis der Agglutinationsprobe kann nach einer Minute ausgewertet werden.

Beispiel 5

Herstellung eines Choriongonadotrophormon-Antigcn- und -Antikörper-serologischen Diagnostikums

Dem auf bekannte Weise hergestellten, mit 3%iger Formaldehydlösung konservierten und gegebenenfalls an Schaferythrocyten gebundenen Choriongonadotrop-Antigen wird ein dem halben Volumen der Suspension entsprechendes Volumen Polyvinyla'kohollösung der im Beispiel 1 angegebenen Konzentration zugefügt Des weiteren ist das Vorgehen mit dem im Beispiel 4 angegebenen übereinstimmend. Ausführung der Untersuchung:

Mit dem erfindungsgemäß hergestellten, unter anderem zur Schwangerschaftsfeststellung dienenden Präparat wird die Schwangerschaftsuntersuchung laut Beispiel 4 durchgeführt.

Beispiel 6

Schaferythrocyten. welche mit einer 3"JgCH Formaidchydlösung konserviert sind und die in bekannter Weise hergestellt worden sind, werden mit menschlichem Fibrinogen-Anligen sensibilisicrt. Solche Fibrinogen-Tests sind z. B. in den folgenden Literatursteilen beschrieben: E. N. Wardle, I. S. Menon, P. R. Uldall und J. Swinney, (1971), J. din. Path., 24, S. 124. I. M. Nils-,οη, (I97I), Scand. J. Haemat., Suppl. i3, S. 317. C. R. Spittle, (1971), J. Clin. Path., 24, S. 87.

Zu dem halben Volumen der sensibilisierten Schaferythrocyten wird eine I8%ige Polyvinylalkohollösung gegeben, wodurch eine Suspension erhalten wird. Gleichzeitig mit der Herstellung des Antigens wird aus einem Fibrinogen-Antikörper, welcher ein Immunserum enthält, mit einer Polyvinylalkohollösung eine Lösung hergestellt. Die den Antikörper enthaltende Lösung wird in einem Ausmaß verdünnt, daß die Konzentration des Antikörpers geeignet ist, um eine Menge von 2 ng/ml menschliches Fribinogen zu neutralisieren. Ein Tropfen von der Antigen-Suspension und ein Tropfen von der Lösung des Immunseruins wird getrennt auf eine vorbehandelte Spiegelglasplatte, welche gemäß Beispiel 1 behandelt worden ist, getropft. Die Tropfen werden eingetrocknet.

Die erhaltene Testplatte ist für die Bestimmung des Fibrinogengehalts von menschlichem Blutserum geeignet. Der Test wird in folgender Weise durchgeführt. Zu den getrockneten Antigen- und Immunserum-Tropfen auf dem Spiegelglasplättchen wird eine verdünnte Reihe von dem zu untersuchenden Blutserum getropft, welche in einem Verdünnungsverhältnis von 1:100, 1:500, 1:1000, 1:2000 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt worden ist. Unter der Einwirkung der zu untersuchenden verdünnten Lösung wird der Polyvinylalkohol-Schutzübcrzug des Antigens und des Immunserums aufgelöst. Nach 30 Sekunden werden die Tropfen vermischt. Nach 3minutigem Stehenlassen kann das Ergebnis des Tests auf der Grundlage der Agglutinierung der Erythrocyten ausgewertet werden.

Claims (1)

1. Paientansoruch-Patentanspruch.

   Verfahren zur Herstellung von aus Antigen-Trägerstoffgemischen bestehenden und gegebenenfalls Antikörper enthaltenden fertigen scrodiagnostischen, auf einen Objektträger aufgebrachten lagerbeständigen Testsubstanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man an vorbehandelte Schaferythrocyteii oder Polystyrollatex gebundene » Antigene und gegebenenfalls Antikörper mit einer wäßrigen Lösung von Polyvinylalkohol mit einem Verseifungsgrad von 86 bis 89 Molprozent und einer Viskosität von 3,5 bis 4,5 cP in einer 4%igen wäßrigen Lösung bei 20⁰C (Höppler-V.skosimeter), die ein bakterizides Mittel enthält, verrührt und nach dem Auftropfen auf dem Objektträger eintrocknet.

   notwendig ist, sondern auch konservierte Reagenzien η lyophiHsiertem oder flüssigem Zustand. Durch das Auflösen der Reagenzien bzw. durch ihre Dosierung aus den -nunrechenden Vorratsgefaßen werden die