DE2023989C3 - Verfahren zur Herstellung von aus Antigen-Trägerstoffgemischen bestehenden und gegebenenfalls Antikörper enthaltenden fertigen serodiagnostischen, auf einen Objektträger aufgebrachten lagerbeständigen Testsubstanzen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von aus Antigen-Trägerstoffgemischen bestehenden und gegebenenfalls Antikörper enthaltenden fertigen serodiagnostischen, auf einen Objektträger aufgebrachten lagerbeständigen TestsubstanzenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von aus Antigen-Trägerstoffgemischen bestehenden
und gegebenenfalls Antikörper enthaltenden fertigen *5
serodiagnostischen, auf einen Objektträger aufgebrachten lagerbeständigen Testsubstanzen.
Zur Zeit sind bereits derartige, auf Antigcn-Antikörpir-Reaktionen
beruhende serologische Verfahren bekannt, die es ermöglichen, unterschiedliche Eiweißkörper
bzw. normale oder pathologische Antikörper nachzuweisen. Als Beispiel so!! der Nachweis folgender
Substaven mit Hilfe serodiagnostischer Testsubstanzen erwähnt werden: Wachstumshormon (P. Weiser:
Fme Methodik der Bestimmung hypophysärcr üonadotropme
mittels Hämagglutinations-Hemmungsreaktion, ZbI. Gynäk., 87 [1965], H. 46, S. 1569 bis 1573);
während der Schwangerschaft im Harn erscheinendes Choriongonadotrophormon (Joyce L. Bell: Comparative
Study of Immunological Tests for Pregnancy Diagnosis. Journal of Clinical Pathology, Vo!. 22,
S. 79 [1969]); pathologische Antikörper im Falle bestimmter
Schilddrüsenkrankheiten (Martti Oka, Pentti Seppälä, Leena Mikkonen: Latex Slide Test in
Thyroid Diseases. Acta Medica Scandinavica, Vol. 179, fase. 2 [1966]); pathologisches Eiweiß im Blutserum
an rheumatologischen Krankheiten leidender Kranken (J. M. Singer, Ch. M. Plotz: Am. J. Med.,
21, S. 888 [1956]; O. Tonder: Studies on the Mechanism
of the Waaler-Rose Test. Norwegian University Press, Bergen, Oslo, 1962); pathologischer Antikörper
in Pfeifferschem Drüsenfieber (Beatrice Saemann-Na
viI Ie: Mononucleose-Schnelltest. Objektträger-Agglutination
formolosierter Pferdeerythrocyten. Schweiz, med. Wschr., 96, Nr. 69, S. 1649 bis 1651
[I960]; G. Hoff, S. Bauer: A new rapid Slide Test for Infectious Mononucleosis. J. Amer. med. Ass., 194,
S. 351 [1965], usw.).
Bei einem Teil der ;rwä'r.nten Verfahren wird das
für die Untersuchung notwendige Antigen, bzw. der Antikörper an lyoph'üsierte Schaferythrocyten gebunden,
bei einem anderen Teil dagegen an Kunststoffe, z. B. an Polystyrol-Latex-Teilchen. Für die erwähnten
serologischen Verfahren ist in zahlreichen Fällen die Anwendung einer aufwendigen Laboratoriumseinrichtung
erforderlich, aber auch die einfachen Methoden sind dadurch kompliziert, daß für ihre Ausführung
nicht nur das zu prüfende Blutserum oder der Harn ist in vielen Fallen lur m
riumsfachkundigke.t notwena g.
riumsfachkundigke.t notwena g.
Ziel der Erfindung ^.:f^
der bekannten - auf trymra.y ^
tination beruhenden - immuno ogJ*he"
zu beheben und em Verfahren auszuarten
das es ermöglicht wird, die notwendigen Reagenz.cn
im für die Untersuchung bereiten Zustand auf den
Objektträger einzutrocknen. Verfahren
Dies wird gemäß der Erfindung be, einem Verfahren
der obengenannten Art dadurch erreicht daß man an vorbehandelte Schaferythrocyten oder Poystvr,·!-
Latex gebundene Antigene und gegebenenfalls Antikörper mit einer wäßrigen Lösung von Polyvinylalkohol
mit einem Verseifungsgrad von 86 bis 89 Molprozent und einer Viskosii.il von 3,5 bis 4,5 cP in einer
4"„igen wäßrigen Lösung bei 20'C (Höppler-Viskosimeter),
die ein bakterizides Mittel enthält verrührt und nach dem Auftropfen auf den Objektträger ein-
trocknet.
Durch die erfindungsgemäß erfolgende Verwendung von Polyvinylalkohol als Filmbildner sind die Reageiizien
nach dem Eintrocknen von einer Schutzschicht überzogen, die ihr Abreiben, ihr Ablösen oder mre
Zerstörung verhindert. Auf diese Weise gelingt es die Lagc.oeständigkeit, Genauigkeit und Zuverlässigkeit
solcher Testverfahren erheblich zu steigern, tin weitcrer
Vorteil besteht darin, daß die Ergebnisse längere Zeit aufbewahrt werden können.
Der bei dem erfindungsgemaßen Verfahren verwendete
Polyvinylalkohol besitzt einen pH-Wert von 5 bis 7.
Aus Zeitschrift für Hygiene, 125, V MW U^), ist
es zwar bereits bekannt, serodiagnostische Agglutinationsreaktionen
mit getrockneten Mikrobensuspensionen auf Objektträgern vorzunehmen, doch genügen
die auf diese Weise hergestellten Präparate nicht den Anforderungen der Praxis hinsichtlich der Lagerbeständigkeit,
der Genauigkeit und der Zuverlässigkeit. Erst die Verwendung von Polyvinylalkohol mit den
angegebenen Spezifikafoner. als filmbildendes Mittel
ermöglicht es, Testpräparate herzustellen, welche den entsprechenden Anforderungen der Praxis genügen.
In der wäßrigen Lösung der filmbildenden Substanz kann gegebenenfalls als bakterizides Mittel, z. B. Thiomersal
(Natriumäthyl-mercuri-thiosalicylat) oder Natriumchlorothiazid
verwendet werden.
Die Untersuchungspiatte oder der Objektträger kann eine Metall-, Glas-, Spiegel- oder Kunststoffplatte sein,
die gegebenenfalls mit Lack überzogen wird. Die mit
Lack überzogenen Objektträger werden zweckmäßig 24 Stunden lang getrocknet, und die mit Umbildender
Substanz bereitete wäßrige Lösung der Antigen-Antikörper-Komplexe
wird nur nachher auf die Oberfläche des nach dem Lackieren getrockneten Objektträgers
getropft.
Das erfindungsgemäß hergestellte und am Objektträger
eingetrocknete Präparat ist für die Ausführung
der auf direkter und passiver Hämagglutination beruhenden
diagnostischen Verfahren vorzüglich geeignet, in denen an Platten eingetrocknete und längere
Zeit lagerfähige Mikromengen als Reagenz angewandt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht
3 4
außer e;ner bedeutenden Ersparung der diagnostischen schicht auflöst. Nach 30 Sekunden Wartezeit wird verReagenzien,
daß die Reagenzien, nachdem sie mit mischt, dann wird die Platte fein hin und her gekippt
einem wesentlich einfacheren Verfahren als die bislang und so kann das Ergebnis der Agglulinationsprobe im
bekannten im zur Verwendung bereiten Zustand ein- Laufe von 5 Minuten auf die übliche Weise ausgegetrocknet
wurden, ohne Laboratoriumseinrichtung 5 wertet werden,
im Ordinationszimmer oder beim Krankenbett einfach
und schnell als Hilfsmittel der ärztlichen Diagnostik Beispiel 2
verwendet werden können. Die errindungsgemäßc ,, „ . _ ,.,·»·
Ausführung der Probe ist noch mit dem Vorteil ver- Herstellung eines Gammaglobulin-Antigen-seroIogi-
bunden, daß nach dem Abklingen der Reaktion zwi- io schen Diagnostikums
sehen dem Diagnostikum und dem Blutserum oder Der auf bekannte Weise hergestellten, an Polystyrol-
dem Harn sich am für die Auswertung bereiten Unier- Latex-Teilchen gebundenen Gammaglobulin-Anligen-
suchungsmaterial die Schutzschicht auf reversible Weise Suspension (Gamma Latex) wird ein dem halben
von neuem ausgebildet hat, und somit kann das Volumen der Suspension entsprechendes Volumen
Untersuchungsergebnis am Objektträger gebunden 15 wäßrige Poiyvinylalkohollösung der angegebenen Art
aufbewahrt werden. zugefügt. Die Methylcellulose wird in 5%iger Lösung
Auf das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. Der Suspension wird ein bakterizides
gewonnene Reagenz wird nur ein Tropfen der zu Mittel, z. B. Natriumchlorothiazid, in einer Verdün-
prüfenden Substanz getropft, deren Wassergehalt die nung von 1:5000 zugefügt. Die fertige Suspension wird
Schutzschicht auflöst, und auf diese Weise kommt die 10 auf die im Beispiel I angegebene Weise auf eine
erwünschte Reaktion zustande. Das erfindungsgemäßc lackierte Metallplatte getropft und eingetrocknet. Mit
Verfahren wird mit Hilfe der nachstehenden Ausfüh- dem erfindungsgemäß hergestellten Gammaglobulin-
rungsbeispiele näher erläutert. Antigen-Präparat erfolgt die Prüfung des Rhe-jma-
faktors auf die im Beispiel I angegebene Weise, mit
Beispiel 1 as der Abweichung, daß das zu prüfende Blutserum zuvor
υ , „ . _, .. . . . , mit einem Borat-Puffer von pH 8,2 lOfach verdünnt
Herstellung eines Thyreoidea-Antigen-serologischen wjr(j
Diagnostikums
Der auf bekannte Weise hergestellten, an Polystyrol- Beispiel 3
Latex-Teilchen gebundenen Thyreoidea-Antigen-Sus- 3° ,, ,, . „ , , ,· . .· .
pension wird eine dem halben Volumen der Suspension »"stellung eines Gammaglobulm-Ant.gen-serolog.-
entsprechende Volumenlösung von Polyvinylalkohol schen Diagnost.kums
der angegebenen Art zugefügt. Der auf bekannte Weise hergestellten, an mit 3%iger
Die Konzentration des Polyvinylalkohole beträgt in Formaldehydlösung konservierte Schaferythrocyten
Wasser oder in physiologischer Kochsalzlösung etwa 35 gebundenen Gammaglobuliri-Antigen-Suspension wird
18%. Dieser Lösung wird in 1:5000 Verdünnung ein dem halben Volumen der Suspension entsprechen-
Thiomersal oder Natriumchlorothiazid als bakterizides des Volumen Poiyvinylalkohollösung zugefügt. Die
Mittel zugefügt. Konzentration des angewandten Polyvinylalkohol ist
Von der hergestellten Suspension wird auf eine mit mit der im Beispiel I angegebenen übereinstimmend.
Nitrolack lackierte Metallplatte I Tropfen (0,05 ml) 4° Die auf diese Weise hergestellte Suspension wird auf
getropft, und der Tropfen wird eingetrocknet. Für das die im Beispiel I beschriebene Weise auf eine lackierte
Eintrocknen wird nach Bedarf ein Ventilator verwen- Metallplatte getropft und eingetrocknet. Statt der
det. Hinsichtlich der Qualität der angewandten Metall- Metallplatte kann die Suspension auch auf eine Spieplatte
ist es am wichtigsten, daß im Laufe der Ausfüh- gelfläche getropft werden. Ausführung der Unterrung
der diagnostischen Probe die gut sichtbare Aus- 45 suchüng:
wertung des Ergebnisses ermöglicht sein soll. Für die- Mit dem erfindungsgemäß hergestellten Gamma-
sen Zweck ist z. B. eine im Vakuum gegossene Metall- globulin-Antigen- Präparat erfolgt die Untersuchung
platte aus hochreinem, temperiertem, vernickeltem und des Rheumafaktorb auf die im Beispiel 2 beschriebene
magnetisiertem Metall von niedrigem Gasgehalt mit Weise,
folgender Zusammensetzung geeignet: 5°
folgender Zusammensetzung geeignet: 5°
C 0,06% Beispie. 4
Si 0,04% Herstellung eines Choriongonadotrophormon-Anti-
P 0,22% gen- und -Antikörper-serologischen Diagnostikums
^ °'02 % 55 Der auf bekannte Weise hergestellten, an Polystyrol-
Mn °·25 /° Latex-Teilchen gebundenen Choriongonadotrophor-
^" 0^0" £>
mon-Antigen-Suspension wird ein dem halben VoIu-
P · j] 0^ {" men der Suspension entsprechendes Volumen PoIy-
he 99,35/, vinylalkohollösung der im Beispiel 1 angegebenen
Nach dem Eintrocknen bildet sich eine Schutzschicht, 6° Konzentration zugefügt. Gleichzeitig mit dem erwähn-
wodorch das Reagenz für längere Zeit in zur Verwen- ten Antigen wird mit obiger Polyvinylaikohollösung
dung bereitem Zustand konserviert wird. aus einem Anti-Choriongonadotrophormon-Antikör-
Mit dem fertigen Reagenz kann die Untersuchung per enthaltenden Immunserum eine so stark verdünnte
des Thyreoidea-Antikörpcrs auf folgende Weise unter- Lösung hergestellt, deren in der Reaktion verwendete
nommen werden: Auf das an dtr lackierten Metall- 65 Menge durch 1,5 bis 2 IE HCG/ml Harn neutralisiert
platte eingetrocknete Antigen wird 0,05 ml des zu wird.
prüfenden Blutserums getropft, auf dessen Wirkung Die derart vorbereitete Antigcnsuspension und Im-
sich die das Reagenz bedeckende Polyvinylalkohol- munserumlösung werden in je 0,05 ml Menge separat
auf dieselbe lackierte Metallplatte getropft und auf die im Beispiel 1 angegebene Weise eingetrocknet. Ausführung
der Untersuchung:
Mit dem erfindungsgemäß hergestellten, unter anderem
zur Schwangerschaftsfeststellung dienenden Präparat kann die SchwanRersdiaftsuntersuchung auf
folgende Weise unternommen werden:
Auf das an der lackierten Metallplatte eingetrocknete Antigen und auf das immunserum werden ic
0.2 ml des zu prüfenden Harns getropft, auf dessen Wirkung sich die Reagenzien bedeckende Polyvinylalkoholschicht
auflöst. Nach 30 Sekunden Wartezeit werden die Tropfen vermischt, dann wird weitere
4 Minuten gewartet, nachher wird die Metallplatte fein hin und her gekippt, und das Ergebnis der Agglutinationsprobe
kann nach einer Minute ausgewertet werden.
Herstellung eines Choriongonadotrophormon-Antigcn-
und -Antikörper-serologischen Diagnostikums
Dem auf bekannte Weise hergestellten, mit 3%iger
Formaldehydlösung konservierten und gegebenenfalls an Schaferythrocyten gebundenen Choriongonadotrop-Antigen
wird ein dem halben Volumen der Suspension entsprechendes Volumen Polyvinyla'kohollösung
der im Beispiel 1 angegebenen Konzentration zugefügt Des weiteren ist das Vorgehen mit dem im
Beispiel 4 angegebenen übereinstimmend. Ausführung der Untersuchung:
Mit dem erfindungsgemäß hergestellten, unter anderem
zur Schwangerschaftsfeststellung dienenden Präparat wird die Schwangerschaftsuntersuchung laut
Beispiel 4 durchgeführt.
Schaferythrocyten. welche mit einer 3"JgCH Formaidchydlösung
konserviert sind und die in bekannter Weise hergestellt worden sind, werden mit menschlichem
Fibrinogen-Anligen sensibilisicrt. Solche Fibrinogen-Tests sind z. B. in den folgenden Literatursteilen
beschrieben: E. N. Wardle, I. S. Menon, P. R. Uldall und J. Swinney, (1971), J. din. Path.,
24, S. 124. I. M. Nils-,οη, (I97I), Scand. J. Haemat.,
Suppl. i3, S. 317. C. R. Spittle, (1971), J. Clin. Path.,
24, S. 87.
Zu dem halben Volumen der sensibilisierten Schaferythrocyten wird eine I8%ige Polyvinylalkohollösung
gegeben, wodurch eine Suspension erhalten wird. Gleichzeitig mit der Herstellung des Antigens wird aus
einem Fibrinogen-Antikörper, welcher ein Immunserum enthält, mit einer Polyvinylalkohollösung eine
Lösung hergestellt. Die den Antikörper enthaltende Lösung wird in einem Ausmaß verdünnt, daß die Konzentration
des Antikörpers geeignet ist, um eine Menge von 2 ng/ml menschliches Fribinogen zu neutralisieren.
Ein Tropfen von der Antigen-Suspension und ein Tropfen von der Lösung des Immunseruins wird getrennt
auf eine vorbehandelte Spiegelglasplatte, welche gemäß Beispiel 1 behandelt worden ist, getropft. Die
Tropfen werden eingetrocknet.
Die erhaltene Testplatte ist für die Bestimmung des Fibrinogengehalts von menschlichem Blutserum geeignet.
Der Test wird in folgender Weise durchgeführt. Zu den getrockneten Antigen- und Immunserum-Tropfen
auf dem Spiegelglasplättchen wird eine verdünnte Reihe von dem zu untersuchenden Blutserum
getropft, welche in einem Verdünnungsverhältnis von 1:100, 1:500, 1:1000, 1:2000 mit physiologischer
Kochsalzlösung verdünnt worden ist. Unter der Einwirkung der zu untersuchenden verdünnten Lösung
wird der Polyvinylalkohol-Schutzübcrzug des Antigens und des Immunserums aufgelöst. Nach 30 Sekunden
werden die Tropfen vermischt. Nach 3minutigem Stehenlassen kann das Ergebnis des Tests auf der
Grundlage der Agglutinierung der Erythrocyten ausgewertet
werden.
Claims (1)
- Paientansoruch-Patentanspruch.Verfahren zur Herstellung von aus Antigen-Trägerstoffgemischen bestehenden und gegebenenfalls Antikörper enthaltenden fertigen scrodiagnostischen, auf einen Objektträger aufgebrachten lagerbeständigen Testsubstanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man an vorbehandelte Schaferythrocyteii oder Polystyrollatex gebundene » Antigene und gegebenenfalls Antikörper mit einer wäßrigen Lösung von Polyvinylalkohol mit einem Verseifungsgrad von 86 bis 89 Molprozent und einer Viskosität von 3,5 bis 4,5 cP in einer 4%igen wäßrigen Lösung bei 200C (Höppler-V.skosimeter), die ein bakterizides Mittel enthält, verrührt und nach dem Auftropfen auf dem Objektträger eintrocknet.notwendig ist, sondern auch konservierte Reagenzien η lyophiHsiertem oder flüssigem Zustand. Durch das Auflösen der Reagenzien bzw. durch ihre Dosierung aus den -nunrechenden Vorratsgefaßen werden die
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