DE2023989A1 - Verfahren zur herstellung von aus antigen-traegerstoffgemischen bestehenden und gegebenenfalls antikoerper enthaltenden fertigen serodiagnostischen,auf einen objekttraeger aufgebrachten lagerbestaendigen testsubstanzen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von aus antigen-traegerstoffgemischen bestehenden und gegebenenfalls antikoerper enthaltenden fertigen serodiagnostischen,auf einen objekttraeger aufgebrachten lagerbestaendigen testsubstanzen

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Description

Licencia Talalmanyokat Efteftesitö Vallalat, Budapest/Ungarn
VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG TON, AUS ANTIGBN-ANTIKÖRPER SYSTEMEN BESTEHENDEN, PERTIGEN SERODIAGNOSTISCHEN TESTSUBSTANZEN, DIE FÜR OBJEKTTRa'gERREAKTIONEN GEEIGNET UND LAGERBESTANDIG SIND
Zur Zeit sind bereits derartige, auf Antigen-Antikörper Reaktionen beruhende serologische Verfahren bekannt, die es ermöglichen unterschiedliche E.iwe£ßkörper, bzw. normale oder pathologische Antikörper nachzuweisen. Als Beispiel soll der Nachweis folgender Substanzen mit Hilfe serodiagnostischer Teatsubstanzen erwähnt werden! Wachstumshormon (P. Weiser: Eine Methodik der Bestimmung hypophyoärer Gonadotropine mittels HHraagglutinations-Hemraungareaktion, ZbI. Gynäk. 87. /1965/ H. 46, S.
9/0 - /Fne*
"BAD
009840/1963
I569-I573); während der Schwangerschaft im Harn erscheinendes Choriongonadotrophormon (Joyce L. Bells Comparative Study of Immunological Teato for Pregnancy Diagnosis. Journal of Clinical Pathology, Vol. 22, p. 79 /1969/ϊ; pathologische Antikörper im Falle "bestimmter Schilddrüsenkrankheiten (Martti Oka, Pentti Seppälä, Leena Mikkonen: Latex Slide Teat in Thyroid Diseases. Acta Medlca Scandinavica, Vol. 179, fase. 2 /1966/)$ pathologische Eiweiß im Blutserum an rheumatologiachen Krankheiten leidender Kranken (Singer, J0M., Plots9 Ch1M.: Im0 J, Med. 21. 888 /I956/ ; Tonder, Q.s Studies on the Mechanism of the Waaler-Hoae Teat, norwegian University Press, Bergen9 Oslo, 1962)j pathologischer Antikörper in Pfeifferachem DrUsenfleber (Beatrice Saemansi-Havllles Iiononuicleose- .. Schnelltest. Objektträger-Agglutination formolisierter Pferdeerythrocyten. Schweis» med» Wschr«, %*> Ir» 49 ' I649-I65I /196O/5 Hoff» Go3 Bau.er9 Sos A n®^ rapid, Slide Teat for Infectious .HZononucleosis. J. Mmevo med» Iss. 194 351 /1965/ usw.). .
Bei einem Teil der erwähnten Verfahren wird das für die Untersuchung notwendige InUgQn9 h&vi» der Antikörper an lyophilisierte Ochaferythrocyten gebunden» bei einem anderen Teil dagegen an Kunststoffe8 S0B4 an Polystyrol-Latex Teilchen. Für die erwähnten serologischen Verfahren ist in zahlreichen fällen die Anwendung einer voluminösen Laboratoriumaeinrichtimg ©rforderlichs aber auch die einfachen Methoden, sind dadurch kompliziert0 daß für ihre Auaftlhruug nicht nur daa zu prüfende Blutserum oder der Harn notwendig ist» sond©i?2i auch konservierte Reagenzien in lyophllisiertem oder flüssigen Zustand· Durch das Auflösen der Reagen2sien9 taw„ finish ihr® Do- . sierung aus den entsprechend en Vorratsgeffäflen wexden die ansonsten einfachen.Mefckodaß umständliche deswegen 1st in vielen Fällen für ihre Ausführung Laboratoriuesfachitundigkeit notwendig.
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Das Ziel unserer Erfindung ist das Beheben der'angeführten Nachteile der bekannten - auf Erythröcyten-, bzw. Latexagglutination beruhenden - immunologischen Methoden und das Ausarbeiten eines Verfahrens, wodurch es ermöglicht wird die notwendigen Reagenzien im für die Untersuchung bereiten Zustand auf dem Objektträger einzutrocknen. Mit dieser Methode kann einerseits erreicht werden, daß für die unterschiedlichen serodlagnostischen Teste nur das zu prüfende Blutserum oder der Harn notwendig ist, anderseits können diese serologische Methoden durch die Anwendung des Verfahrens äußerst vereinfacht werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann dadurch ger kennzeichnet werden, daß Komplexe aus vorbehandelten Schaferythrocyten oder Latex-Antigen und Antikörpern mit der wäßrigen Lösung eines mit der biologischen Substanz kompatiblen, nach dem Eintrocknen einen filmbildenden und auf Wasserzugabe löslichen natürlichen, halbsynthetischen oder synthetischen Polymeren oder Kunststoffes, die gegebenenfalls irgendein bactericides Mittel enthält» verrührt und nach dem Auf tropf en auf den Objektträger eingetrocknet wird, wodurch ein ohne Aktivitätsverminderung haltbares, fertiges Reagenz gewonnen wird, Hach dem Eintrocknen sind die Reagenzien von einer Schutzschicht überzogen, dieser verhindert ihr Abreiben, Ablösen und ihre Zerstörung, konserviert somit die Reagenzien.
Als filmbildendes synthetisches oder halbsynthetisches, wasserlösliches Polymer werden Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon; Polyvinylmethylather, Carboxymethylcellulose oder Methylcellulose und andere wasserlösliche Polymere linearer Struktur verwendet. Als filmbildendes Kunstharz sind Harnst of f-Formaldehyd-, Melamin-Formaldehyd-, Caaein-Pormaldehydharze, weiterhin Substanzen auf Alkydharzbasia geeignet, die den Forderungen der Wasserlöslichkeit und der Kompatibilität mit biologischen Substanzen entsprechen. Als filmbildenden natürliches Polymer er-
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wähnen wir z.B. Gelatine oder Leim. In der wäßrigen Lösung der filmbildenden Substanz kann gegebenenfalls als bakterizides Mittel z.B. Merthiolat (Natrium-äthyl-Qpecksirber(ll)-thiosalicylat) oder Natriumthiazid verwendet werden.
Die Untersuchungsplatte oder der Objektträger kann eine Metall-, Glas-, Spiegel- oder Kunststoffplatte sein, die gegebenenfalls mit Lack überzogen wird. Die mit Lack überzogenen Objektträger werden zweckmäßig 24 Stunden lang getrocknet und die mit filmbildender Substanz bereitete wäßrige Lösung der Antigen-Antikörper Komplexe wird nur nachher auf die Oberfläche des nach dem Lackieren getrockneten Objektträgers getropft.
Das erfindungsgemäß hergestellte und am Objektträger eingetrocknete Präparat ist für die Ausführung der auf direkter und passiver Häma*gglutination beruhenden diagnostischen Verfahren vorzüglich geeignet, in denen an Platten eingetrocknete und längere Zeit lagerfähige Mikromengen als Reagenz angewandt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht außer einer bedeutenden Ersparung der diagnostischen Reagenzien, daß die Reagenzien, nachdem sie mit einem wesentlich einfacheren Verfahren als die bislang bekannten im zur Verwendung bereiten Zustand eingetrocknet wurden, ohne Laboratoriumseinrichtung im Ordinationszimmer oder beim Krankenbett einfach und schnell als Hilfsmittel der ärztlichen Diagnostik verwendet werden können. Die erfindungsgemäße Ausführung der Probe ist noch mit dem Vorteil verbunden, daß nach dem Abklingen der Reaktion zwischen dem Diagnostikum und dem Blutserum oder dem Harn sich am für die Auswertung bereiten Untersuchungamaterial die Schutzschicht auf reversible Weise von neuem ausgebildet, und somit kann das Untersuchungsergebnia am Objektträger gebunden aufbewahrt werden.
Auf das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Reagenz wird nur ein Tropfen der zu prüfenden Substanz
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. 202398^
getropft, deren Wassergehalt die Schutzschicht auflöst und auf diese Weise kommt die erwünschte Reaktion zustande. Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit Hilfe der nachstehenden Au3führungsbeispiele näher illustriert, die den Schutzkreis der Erfindung nicht beschränken.
Beispiel 1
Herstellung eines Thyreoidea<~Antigen serologischen Diagnostikums
Der auf bekannte Weise hergestellten, an Polystyrol-Latex Teilchen gebundenen Thyreoidea-Antigen Suspen- ' aion (TA-Test = Hyland Laboratories, Los Angeles, Kalifornien, USA.) wird ein dem halben Volumen der Suspension entsprechendes Volumen Polyvinylalkohol-Lösung zugefügt. Der Polyvinylalkohol ist eine handelsübliche Substanz, für diesen Zweck verwenden wir die Handelspräparate Vinavilol 4-88 (Montecatini, Italien) oder Rhodovilol 4/125/P (Hhone Poulenc, Frankreich). Die Konzentration der angewandten Polyvinylalkohole beträgt in Wasser oder in physiologischer Kochsalzlösung etwa 18$, dieser Lösung wird nötigenfalls in 1:5000 Verdünnung Merthiolat oder Natriumthiazid als baktericldes Mittel zugefügt.
Von der hergestellten Suspension wird auf eine μ
mit Nitrolack lackierte Metallplatte 1 Tröpfen (0,05 ml) getropft und der Tropfen wird elnoetrocknet· Pur das Eintrocknen wird nach Bedarf ein Ventilator verwendet. Die Qualität der angewandten Metallplatte betreffend ist es am wichtigsten, daß im Laufe der Ausführung der diagnostischen , probe die gut sichtbare Auswertung des Ergebnisses ermöglicht sein soll. Erfahrungsgemäß entspricht für diesen ftwock z.B. eine Im Vakuum gegossene Metallplatte aus hochreinem, temperiertem, vernickeltem und magnetieiertem Metall von niedrigem Gasgehalt, dessen Zuaammenaetzung folgende iati
0 0,06 %
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P 0,22 #
S 0,02 $
Mn 0,25 %
Cu 0,03 %
Al 0,03.Φ
Fe 99,35 %
Nach dem Eintrocknen bildet sich eine Schutzschicht, wodurch das Reagenz für längere Zeit im zur Verwendung bereiten Znstand konserviert wird.» Statt des Polyvinylalkohole von der angegebenen Qualität kann das Diagnostikum auch unter Verwendung von Methyl cellulose, hergestellt werden.
Mit dem fertigen Reagens kann die Untersuchung des Thyreoidea-Antikörpers auf folgend© Ifeiae unternommen werden: Auf daa aa der lackierten Metallplatte eingetrocknete Antigen wird 0s05 ml des zu prüfenden Blutsermas getropft auf dessen Wirkung aick.di© das leagens bedeckende Poly™ vlnylalkoholschicht auflöst, lach 30 Sekunden Wartezeit wird vermiscfats dann wird die Platte fein lain und her.gekipp b und so kann das Ergebnis der Igglutlnationsprobe im Laufe von 5 Minuten auf die übliche Weise auagewertet werden.
Beispiel 2
Herstellung eines Garaiaaglobtilin-Äntigen serologischen Diagnostikuras · ■
Der auf bekannte Weis® hergestellte^ an Poljstyrol-Lafcex Teilclien gebundenen Gammaglobulln-Antigen Suspension (Garama-Latex, herstellende Firma Human, Impfatoff prqduaierendoa und Forschungsinstitut:, Budapest) xrl^ä ein dem halben Volumen der Suspension entsprechendes-Tolieen wäßrige Methylcelluloae-Löaung zugefügt. Die Hetby!-cellulose wiM in 5'^-iger Lösung verwendet© Der Suopesielosa WiKl9 ?jeiin erwünscht, ein baktericMea Mittel, SoB«. latriumtMasid» Ib Ii5000 Verdünnung zugefügto Die-fertige Suspension wird auf die in Beispiel 1 angegebene Welse auf ©Ine lackierte Metallplatte getropft und. eing®trocknet«,
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Mit dem erfindungegemäß hergestellten Gammaglobu— lin-Antigen Präparat erfolgt die Prüfung des Rheumafak-fcorB auf die in Beispiel 1 angegebene Weise, mit der Abweichung, daß d as zu prüfende Blutserum vorangehend mit einem Boratpuffer von pH 8,2 zehnfach, verdünnt wird.
Beispiel 3
Herstellung eines Gammaglobulin-Antigen serologiüchen Diagnostikums
Der auf bekannte Weise hergestellten, an mit 3#- iger Formaldehydlösung konservierte Schaferythrocyten gebundenen Gammaglobulin-Antigen Suspension wird ein dem halben Volumen der Suspension entsprechendes Volumen PoIyvinylalkohol-Lösung zugefügt» Die Konzentration des angewandten Poly vinylalkohole ist mit der in Beispiel 1 angegebenen übereinstimmend.
Die auf diese Weise hergestellte Suspension wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise auf eine lackierte Metallplatte getropft und eingetrocknet. Statt der Metallplatte kann die Suspension auch auf eine Spiegelfläche getropft werden. Ausführung der Untersuchung:
Mit dem erfindungsgemäß hergestellten Gammaglobulin-Antigen Präparat erfolgt die Untersuchung des Rheumafaktors auf die in Beispiel 2 beschriebenen Weise.
Beispiel 4 "
Herstellung eines Choriongonadotrophormon-Antlgen und Antikörper serologischen Diagnostikums
Der auf bekannte Weise hergestellten, an Polystyrol-Latex Teilchen gebundenen Choriongonadotrophorraon-Antigen. Suspension '(Gravindex » Ortho Diagnostics, Raritan, New Jersey, USA; Pregnosticon-Planotest «· Organon, Oss, Holland; Prepurex « Burroughs Wellcome and Co., London, England; DAP-Test = Wampole lab., Stemford, Conn., USA) wird ein dem halben Volumen der Suspension entsprechendes Volumen Polyvinylalkohol-Lö'sung von der in Beispiel 1 angegebenen Konzentration zugefügt. Gleichzeitig mit dem er-
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wähnten Antigen wird mit obiger Polyvinylalkohol-Lösung aus einem Anti-Choriongonadotrophormon-Antikörper enthaltenden Immunaerum eine so stark verdünnte Lösung hergestellt» deren in der Reaktion verwendete Menge durch 1,5-2 IE HGG/ml Harn neutralisiert wird.
Die derart vorbereitete Antigensuspension und Im— munserumlösung werden in ;je 0,05 ml Menge separat auf dieselbe lackierte Metallplatte getropft und auf die in Beispiel 1 angegebene Weise eingetrocknet.
Ausführung der Unterauehung:
Mit dem erfindungsgemäß hergestellten» unter anderem zur Schwangerschaftsfeststellung dienenden Präparat !rann die Schwangorschaftsunterauchung auf folgende Weise unternommen werden:
Auf das an der lackierten Metallplatte eingetrocknete Antigen und auf das Immunserum werden je 0,2 ml des zu prüfenden Harns getropft, auf dessen Wirkung sich die'Reagenzien bedeckende Polyvinylalkoholschicht auflöst. Nach 30 Sekunden Wartezeit werden die Tropfen vermischt, dann wird weitere 4 Minuten gewartet» nachher wird die Metallplatte fein hin und her gekippt und das Ergebnis der Agglutinationsprobe kann nach einer Minute ausgewertet werden»
Beispiel 5
Herstellung eines Choriongonadotrophormon-Antigen und -Antikörper serologischen Diagnostikums
Dem auf bekannte Weise hergestellten, mit 3#-iger Formaldehydlb'sung konservierten und gegebenenfalls an Schaferythrocyten gebundenen Choriongonadotrop-Antigen wird ein dem halben Volumen der Suspension entsprechendes Volumen Polyvinylalkohol-Iösung von der in Beispiel 1 angegebenen Konsentration zugefügt. Dea weiteren ist das Vorgehen mit dem in Beispiel 4 angegebenen übereinstimmend, Ausführung der Untersuchung:
Mit dem erfindungsgemäß hergestellten, unter anderem zur Schwangerschaftsfestatellung dienenden Präparat
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wird die fichangerschaftsuntereuchung laut Beiapiel 4 durchgeführt »
Dad in den angegebenen Beispielen mitgeteilte Verfahren kann unter der Verwendung von Gelatine oder Leim, weiterhin Polyvinylpyrrolidon, Carboxymethylcelluloae, baw. Harnstoff-Formaldehyd-, Melamin-Formaldeliyd-, uaw. Kunntbars-Vorkondensaten unternommen werden.
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Claims (14)

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Heroteilung von aus Antigen-Antikörper Systemen bestehenden fertigen serodiagnostisehen Teatsubstanzen, die für ObjekLträgerreaktionen geeignet und lagerbeständig 3ind» dadurch gek e η η ζ ei chne t, daß Komplexe aits vorbehandelten Schaferythrocyten oder Latex-intigen und Antikörper mit der wäßrigen Lösung eines mit der biologischen Substanz kompatiblen, nach dem Eintrocknen einen Film bildenden und auf Wasserzugabe löslichen natürlichen,, halbsynthetischen oder synthetischen Polymeren oder Kunststoffes, die gegebenenfalls irgendein baktericides Mittel enthält, verrührt und nach dem Auftropfen auf den Objektträger eingetrocknet wird.
2. Verfahren nach Anspruch I9 dadurch gekennzeichnet» daß als fumbildende synthetische oder halbsynthetische, wasserlösliche Polymer PoIyriny!alkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyvlnylmethyläther» 'Carboxymethylcellulose, Methylcellulose oder ein anderes Polymer linearer Struktur verwendet wird«
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gek e η nzeichnet 9 daß als filmbildendes Kunstharz die wäßrige Lösung einer Substans auf Harnstoff-Formaldehyd~9 Melamin-, Formaldehyd-j Casein-Forrnaldehyd- oder Allcydharzbaaia verwendet wird·
4. Verfahren nach Anspruch I9 dadurch gekennzeichnet, daß als fUmbildende natürliche Polymere Gelatine oder Leim verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1B dadurch gekennzeichnet , dafi als bakterleide Substanz Merthiolat (Natrium-äthyl-Qnecksil'berdli-thioaalicylatl oder latriumthiazid verwendet wird»
6. Verfahren nach Anspruch 1 B .dadurch g e k e η η-aeich'net 9 daß ale Objektträger eine Metall- Glas-» Spiegel- oder Kunststoff platte v©^w©Jide-t-wird.
7. Verfahren nach Anspruch I8 dadurch g β k β η n-
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zeichnet , daß als Objektträger eine mit Lack überzogene Metallplatte verwendet wird.
8. Serodiagnostische Teatsubstanzen aus Antigen-Antikörper Systemen, dadurch gekennzeichnet, daß 3ie Komplexe von vorbehandelten Schaferythrocyten oder Latex-Antigen und Antikörpern in Kombination mit der wäßrigen Lösung eines mit der biologischen Substanz kompatibel, fUmbindenden und auf Wasaerzugabe löslichen natürlichen, halbsynthetischen Polymeres oder Kunststoffes, ferner gegebenenfalls ein bakterizides Mittel enthalten und sie auf einen Objektträger aufgebracht und eingetrocknet sind,
9. Serodiagnosti3che Teatsubstanz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß 3ie als filmbildende synthetische oder halbsynthetische wasserlösliche Polymere Polyvinylalkohol Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylmethyläther, Carboxymethylcellulose, Methylcellulose oder ein anderes Polymer linearer Struktur enthält.
10. Serodiagnootische Teatsubstanz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie als f umbildendes Kunstharz die wäßrige Lösung einer Substanz auf Harnst off-Formaldehyd-, Melamin-Fonaaldehyd-, casein-Formaldehyd- oder Alkydharz-Basis enthält. N
11. Serodiagnostische Tef3t3nbstanz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichne b , daß 3ie als filmbildende natürliche Polymere Gelatine oder Leim enthält.
12. Serodiagnostische Testsubstanz nach Anspruch 8, dadurch gek ennz ei chnet , daß sie als bakterizide Substanz Merthiolat oder Natriümthiazid enthält.
13· Serodiagnostische Teatsubstanz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß der Objektträger eine Metall-, Glas—, Spiegel— oder Kunststoffplatte ist,
14. Serodiagnoatische Testsubstanz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet» daß der Objektträger eine mit Lack überzogene Metallplatte ist.
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