PL72768B1 - - Google Patents

Description

Sposób wytwarzania serologicznych preparatów diagnos tycznych Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia serologicznych preparatów diagnostycznych w oparciu o reakcje antygen-przeciwcialo, nadajacych sie da przechowywania i gotowych do uzycia w od¬ czynach plytkowych.Metody serologiczne, oparte na reakcji antygen:— —przeciwcialo, pozwalajace wykazac obecnosc za¬ równo róznych bialek jak i prawidlowych lufo pato¬ logicznych przeciwcial znane sa od dawna.Znane jest wykazanie przy pomocy serologiczne¬ go preparatu diagnostycznego hormonu wzrostowego (P. Weiser: Eine Methodik der Besitimmung hypo- physarer Gonadotropine mittels Hamagglutination- -Hemniungsreaktion, Zbl. Grynak, 87 {1965), H. 46.S. 1569—1573), gonadotropiny kosmówkowej, poja¬ wiajacej sie w moczu kobiet ciezarnych (Joyce L.ReU: Cottnpanative Study of Immunologica! Tests for Pregnancy Diagnosis, Journal oif Clinical Patho- logy, Vol. 22, p. 79 {1969); patologicznych przeciw¬ cial w pewnych chorobach tarczycy (Martti Oka, Pentiti Seppala anid Leena Mikkonen: Latex alide Test in Thyroid Diseases. Acta Medica Scandinavi- ca, Vol. 179, fasc. 2 (1966); patologicznego bialka w surowicy chorych reumatycznych (Singer, J. M.Plotz, Ch. M.: Am. J. Med. 21, 888 (1956), Tonder, O: Studies on the Mechanism of the Waaler-Rose Test, Norwegian University Press, Bergen, Oslo, 1962); patologicznych przeciwcial w zakaznej mononukleo- zie {Beatrice Saemann^Neville: Monoaucleose- -Schnelltest, Obj akttrager-Agglutination formoli- 10 15 25 30 sierter Piferdeerythrocytan. — Schweiz, med. Wsch. 96, Nr 49, 1649^1651 (1960), Hoff. G. and Bauer S.: A New Rapid Slide Test tfor Infectious Moinouclosis J. Amer, med Ass. JAMA 194, 351, (1965) itd.W niektórych sposród wyzej wymienionych metod uzywa sie zliofilizowanych krwinek baranich, oto¬ czonych antygenem lub przeciwcialem, w innych krwinki czerwone zastepuje sie syntetycznym rciaite- rialem, jak np. czasteczkami polistyrenu-lateksu.Niedogodnoscia znanych metod jest, iz obok ba¬ danej 'surowicy lufo moczu, w stanie plynnym lub zliofilizowanym, wymagaja z góry przygotowanych odczynników. Zarówno rozpuszczanie odczynników, jak i pobieranie ich ze specjalnych naczyn labora¬ toryjnych, w których sa przechowywane, kompli¬ kuje te metody. W tych warunkach do ich przepro¬ wadzenia niezbedny staje sie wykwalifikowany per¬ sonel.CeiLeni wynalazku jest wyeliminowanie opisanych trudnosci, zwiazanych z metodami immunologicz¬ nymi, opartymi na aglutynacji krwinek czerwonych lub czasteczek lateksu i opracowanie sposobu, poz¬ walajacego na zastosowanie niezbednych odczynni¬ ków w postaci gotowej do uzycia na plytce testowej przez odparowanie. W ten sposób osiaga sie maksy¬ malna korzysc, poniewaz dla róznych serologicz¬ nych testów diagnostycznych staje sie potrzebna je¬ dynie badana surowica lub mocz.Sposób wedlug wynalazku polega na zmieszaniu kompleksów przygotowanych krwinek czerwonych 727683 baranich lub czastek lateksu uprzednio traktowa¬ nych antygenem lub kompleksów z przeciwcialem z wodnym roztworem neutralnych, pólsyntetycznych lub syntetycznych polimerów lub syntetycznych zy¬ wic, które nie reaguja z substancjami biologicznymi.Po wyschnieciu zdolne sa one do, wytworzenia po¬ wloki na powierzchni plytki testowej, jak równiez ulegaja rozpuszczeniu po dodaniu wody, zawiera¬ jacej ewentualnie czynnik bakteriobójczy. Nastep¬ nie, po umieszczeniu tego roztworu na plytce testo¬ wej i wysuszeniu goi na niej, otrzymuje sie reagent, nadajacy ;sie do przechowywania bez. spadku aktyw¬ nosci. Po wysuszeniu lub odparowaniu plytke po¬ krywa sie warsitwa zabezpieczajaca przed zluszcze- niem, rozpuszczeniem lub rozkladem reagentu.T3# j^tworzeina'powloki stosuje sie alkohol poli- wlnylowyr, poliwinylojpirolidon, eter poliwinylome- tyfowy, karboksymet^loceluloze lub metyloceluloze jako «ymte*(yH:zne lubi pólsyntetyczne rozpuszczalne wj. Wordzie polimery liniowe. Jako tworzace powlo¬ ki .syntetyczne zywice, stosuje sie zywice moczniko¬ wo-formaldehydowa, melaminowoHformaldehydo- wa, kazeinowo-fomialdehydowa lub zywice alkido- wa odpowiadajaca wymogom rozpuszczalnosci w wodzie i nie reagujaca z substancjami biologiczny¬ mi. Jako naturalne polimery do wytworzenia po¬ wloki stosuje sie np. zelatyne lulb gluten. Jako czyn¬ nik bakteriobójczy, dodawany do wodnego roztworu substancji wytwarzajacej powloke, mozna stosowac sól sodowa kwasu etylo-rtecio-(II)-tiosali.cylowego (metriolat) lub tiazydek .sodowy.Plytka testowa moze byc z metalu, szkla, lustra lub innego tworzywa sztucznego pokrytego ewen¬ tualnie lakierem. Pokryte lakierem plytki korzyst¬ nie suszy sie w ciagu 24 godzin. Natomiast wodny roztwór kompleksów antygen-przeciwcialo wraz z substancja tworzaca powloke na powierzchni plyt¬ ki, stosuje sie dopiero po wysuszeniu uprzedniego pokrycia lakierowego.Preparat przygotowany sposobem wedlug wyna¬ lazku i wysuszony na plytce nadaje sie do przepro¬ wadzenia postepowania diagnostycznego, opartego na odczynie bezposredniej i biernej hemaglutynacji, w której uzyto jako reagentu mikroilosci, wysuszo¬ nych na szkielku i nadajacych sie do przechowywa¬ nia przez dlugi okres czasu. Inna korzyscia poste¬ powania zgodnie z wynalazkiem jest fakt, ze reagen¬ ty moga byc wykorzystane w szybki sposób, bezpo¬ srednio w gabinecie konsultacyjnym lub przy lózku chorego. Sa one bowiem wysuszone i gotowe do uzycia, co .pozwala na wykorzystanie ich w sposób znacznie prostszy, niz dotychczas, bez potrzeby spe¬ cjalnego wyposazenia laboratoryjnego, w celach diagnostyczno-lekarskich. Takametoda testowa wy¬ kazuje jeszcze dalsze korzysci umozliwiajac po przeprowadzeniu reakcji z badana surowica lub mo¬ czem utrwalenie wyniku reakcji na plytce przez powtórne pokrycie jej powloka zabezpieczajaca, ale po jej odwróceniu. Dzieki temu wynik reakcji, utrwalony na plytce, da sie przechowac przez dluz¬ szy czas.Jedyna czynnoscia, która nalezy wykonac, alby uzyc reagentu otrzymanego sposobem wedlug wy¬ nalazku 'do testu diagnostycznego jest umieszczenie kropli badanego materialu na plytce. Woda zawarta 4 w badanym materiale rozpusci oslaniajaca powloke, po czym zachodzi zadana reakcja.Nizej podane przyklady wyljasniaja blizej sposób wedlug wynalazku nie ograniczajac jego zakresu. 5 Przyklad L Sporzadzenie serologicznego pre¬ paratu diagnostycznego z antygenem tarczycowym.Do zawiesiny czasteczek polistyrenu-lateksu oto¬ czonych antygenem tarczycowym, przygotowanej znana metoda (TA-test = Hyland Laboratories, Los ii Angeles, Calif. USA) dodaje sie zawiesiny polialko¬ holu winylowego w objetosci równowaznej 50% za¬ wiesiny. Wskazane jest uzycie jednego z handlowych preparatów polialkoholu winylowego, jak Vinavilol 4-88 i(Montecatini) lub Rhodovilol 4j(125)P (Rhone- 15 -Poulenc). Stezenie polialkoholu winylowego w wo¬ dzie lub w fizjologicznym roztworze chlorku sodo¬ wego wynosi umownie 18%. Jako czynnika bakte¬ riobójczego dodaje sie don mertiolatu •lub tiazydku sodowego, rozcienczonego w stosunku 1:5000. 20 Jedna krople i(0,05 ml) tak .przygotowanej zawie¬ siny naklada sie na plytke metalowa, pokryta la¬ kierem i odparowuje wode, zawarta w kropli. Je¬ zeli zachodzi potrzeba, mozna przyspieszyc parowa¬ nie uzywajac wiatraczka. 25 Podstawowym warunkiem jakosci plytki metalo¬ wej jest zapewnienie wyraznego odczytania i oceny wyniku testu diagnostycznego. Na podstawie empi¬ rycznych badan stwierdzono, ze pozadane jest uzy¬ wanie plytek odlanych w prózni z wyzarzonego, po- 30 krytego niklem i magnetyzowanego metalu o wyso¬ kim stopniu czystosci i malej zawartosci gazów, po¬ siadajacego nastepujacy sklad: c Si p s Mn Cu Al Fe 0,06% 0,04% 0,22% 0,02% 0,25% 0,03% 0,03% 99,35% Po odparowaniu wytwarza sie ochronna powloka, która umozliwia przechowanie reagentu, w stanie gotowym do uzycia, przez znaczny okres czasu. Dla 45 przygotowania diagnostycznej mieszaniny mozna zastosowac metyloceluloze zamiast poUalkoholu wi¬ nylowego, o podanej wyzej jakosci.Badanie na okreslenie przeciwcial tarczycowych prowadzi sie w nastepujacy sposób, 0,05 ml surówi- 50 cy badanej naklada sie na antygen, wysuszony na lakierowanej plytce metalowej, na której powloka z polialkoholu winylowego ulegla rozpuszczeniu. Po odczekaniu 30 sekund, substancje miesza sie, na¬ stepnie .plytke delikatnie kolysze i .ocenia wynik te- 55 stu aglutynacyjnego w zwykly sposób po uplywie 5 minut.Przyklad II. Serologiczny preparat diagno¬ styczny z antygenem gamma globulinowym.Do zawiesiny czasteczek polistyrenu-lateksu, oto- 60 czonych antygenem gamma globulinowym, przygo¬ towanej w znany sposób (producenci: Hum&n Oltó- anyagtermaló ss Kutató Intezet, Budapeszt, tzn.HUMAN Institute for the Research and Production of Immunological Substances (dodaje sie wodnego 65 roztworu metylocelulozy w ilosci odpowiadajacej5 50% zawiesiny. Stosuje sie 5% roztwór imetylocelu- lozy, ewentualnie dodajac do zawiesiny czynnika bakteriobójczego, rozcienczonego woda w stosunku 1 :5000.Zawiesine naklada sie na polakierowana plytke metalowa w sposób opisany w przykladzie I i suszy.Badanie czynnika reumatoidalnego przeprowadza sie za pomoca preparatu antygenu gamma globuli- nowego w sposób, podany w przykladzie I, z ta jednak róznica, ze surowice badana nalezy uprzed¬ nio rozcienczyc w stosunku 1:10 buforem z kwasu borowego o wartosci pH =18,2.Pnziyiklad III. Serologiczny preparat diagno¬ styczny z antygenem gamma globulinowym.Do zawiesiny krwinek czerwonych baranich, oto¬ czonych antygenem gamma globulinowym, zakon¬ serwowanej 3% roztworem formaldehydu, przygo¬ towanej w sposób znany, dodaje sie roztworu poli¬ alkoholu winylowego w ilosci odpowiadajacej 50% zawiesiny. Stezenie polialkoholu winylowego jest identyczne z zastosowanym w przykladzie I.Tak przygotowana zawiesine naklada sie na po¬ kryta lakierem plyitke metalowa, zgodnie z przy¬ kladem I i suszy. Zamiast plytki metalowej mozna nakropiic zawiesine na powierzchnie plytki lustrza¬ nej.Próbe w odniesieniu do czynnika reumatoidalnego przeprowadza sie stosujac preparat z antygenem gamma globulinowym w sposób podamy w przy¬ kladzie II.Przyklad IV. Serologiczny preparat diagno¬ styczny z antygenem — gonadotropina kosmówko- wa i przeciwcialem przeciwko temu hormonowi.Do zawiesiny czasteczek polistyrenu-lateksu oto¬ czonych antygenem, którym jest gonadotropina kos- mówkowa tan, New York, USA; Pregnosticon — Planotest = Organon* Oss, Netherlands; Prepurex = Burroughs Wellcome and Co., London, England; DAP-Test = Wampole Lab. Stamford, Conn., USA) dodaje sie roztworu polialkoholu winylowego o stezeniu, jak w przykladzie I, w objetosci odpowiadajacej 50% zawiesiny. Jednoczesnie z wyzej wymienionym an¬ tygenem przygotowuje sie roztwór surowicy odpor¬ nosciowej, zawierajacej przeciwciala przeciwko go- nadotropinie kosmówkowejj rozcienczonej wyzej podanym roztworem polialkoholu winylowego. Sto¬ pien rozcienczenia musi byc tak dobrany, aby ilosc wzieta do reakcji byla zobojetniana przez 1,5—2 I. U. HGG ((miedzynarodowych jednostek gonado- tropiny kosmówkowej) na 1 ml moczu. 0,05 ml porcje zawiesiny antygenu, przygotowanej w sposób podany wyzej, jak równiez roztworu su¬ rowicy odpornosciowej nakrapla sie oddzielnie na pokryta lakierem plytke metalowa i suszy w sposób podany w przykladzie I.Próby ciazowe przeprowadza sie za pomoca pre¬ paratu, otrzymanego sposobem wedlug wynalazku, odpowiedniego obok innych jako wskaznik ciazowy w nastepujacy sposób.Na lakierowana powierzchnie plytki metalowej z wysuszonym antygenem i przeciwsurowica nakra¬ pla sie po 0,0(2 ml moczu, co powoduje rozpuszcze¬ nie .powloki z polialkoholu winylowego, oslaniajacej reagenty. Po uplywie 30 sekund miesza sie krople; 6 po uplywie dalszych 4 minut plytke metalowa de¬ likatnie sie kolysze. Wynik aglutynacji mozna oce¬ nic w ciagu 1 minuty.Przyklad V. Serologiczny preparat diagno- 5 styczny z antygenem-gonadotropina kosmówkowa i przeciwcialem przeciwko temu hormonowi.Do antygenu, którym, jest gonadotropina kosmów¬ kowa, zawierajacego 3% formaldehyd, jako srodek konserwujacy i przygotowanego w znany sposób 10 ewentualnie otaczajacego krwinki czerwone bara¬ nie, dodaje sie roztworu polialkoholu winylowego, zageszczonego jak w przykladzie I, w ilosci odpo¬ wiadajacej 50% objetosci zawiesiny. Dalej postepuje sie jak w przykladzie IV. 15 Postepowanie opisane w kazdym z podanych przy¬ kladów, moze byc przeprowadzone z zastosowaniem jako substancji, wytwarzajacych powloke, zelatyny lub glutenu, jak równiez poliwinylopirolidOJiu, lub karboksymetylocelulozy, a zwlaszcza zwiazków, 20 oipartych na zywicach syntetycznych, takich jak zy¬ wica mocznikowo-formaldehydowa, melaminowo- -formaldehydowa it& 25 PL PL

Claims (7)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania serologicznych preparatów diagnostycznych, opartych na ukladach antygen- -przeciwcialo, nadajacych sie do przechowywanja 30 i gotowych do uzycia w .próbach plytkowych, zna¬ mienny tym, ze kompleksy krwinek baranich lub czastek lateksu, otoczonych antygenem i kompleksy przeciwciala, lub zawiesiny wymienionych komplek¬ sów miesza sie z wodnymi roztworami naturalnych, 35 pólsyntetycznych lub syntetycznych polimerów lub zywic syntetycznych, nie reagujacych z substancja¬ mi biologicznymi i zdolnych do wytworzenia powlo¬ ki po wysuszeniu, oraz rozpuszczajacych sie po do¬ daniu wody, zawierajacej ewentualnie srodek kon- 40 serwujacy, po czym otrzymana mieszanine naklada sie na plytki i suszy.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ja¬ ko tworzacy powloke syntetyczny lub pólsyntetyicz- ny rozpuszczalny w wodzie polimer stosuje sie poli- *5 alkohol winylowy, poliwinylopirolidon, eter poliwi- hylometylowy, karboksymetyloceluloze lub metylo- celuloze.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako zywice syntetyczna, tworzaca powloke stosuje »° sie wodne roztwory zywicy mocznikowo-tformalde- hydowej, melaminalo-^ormaldehydowej, kazeinowo- -formaldehydowej lub zywicy aikidowej.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ja¬ ko naturalny polimer tworzacy powloke stosuje sie 55 zelatyne lub gluten.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ja¬ ko srodek bakteriobójczy stosuje sie sól sodowa kwa¬ su etylo-rtecio-(ll)-tiosalicylowego lub tiazydek so¬ dowy. 60

6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako plyitke testowa stosuje sie plytke metalowa, szklana, lustrzana lub z tworzywa sztucznego.

7. Sposób wedlug zasitrz, ii, znamienny tym, ze sto¬ suje sie plytke testowa metalowa, szklana lub z two- 65 rzywa sztucznego, powleczona lakierem. PL PL