CN106645717A - 一种快速检测沙眼衣原体和淋病的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速检测沙眼衣原体和淋病的试剂盒及其应用，属于医疗检测领域。其具体是在PVC板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有稀土荧光微球标记抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成的试纸卡。

Description

一种快速检测沙眼衣原体和淋病的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种快速检测沙眼衣原体和淋病的试剂盒及其应用，属于医疗检测领域。

背景技术

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，Ct)具有独特的发育周期，有原体(Elementary Body)和网状体(Reticulate Body)两种形式。其独特的生命周期是原体感染细胞发育为网状体，网状体再分裂为原体释放，进而再次感染细胞的循环过程。Ct是一种在人体内长期生存并又广泛传播的病原体，是我国性传播疾病(sexually transmitteddiseases，STDs)的主要病原之一，它在一定条件下能引起异位妊娠、早产、流产及尿道感染等多种疾病。研究发现，Ct感染尚与许多自身免疫疾病发病有关，如衣原体感染后可引起反应性关节炎、Reiter综合征等。Ct主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)具有5个保守区和4个可变区。由于其保守结构和好的免疫原性，MOMP是检测Ct的最理想的抗原之一。

实验室检查衣原体的方法有：衣原体细胞培养法、血清学方法和核酸扩增法。其中以衣原体细胞培养法最敏感、最可靠，但由于操作繁琐、费用高、培养时间长且受标本采集、运送、保存及实验技术的影响，一般实验室难以开展。核酸扩增法由于应用特异性引物，大大增强了检测的敏感性和特异性，但对实验室条件、仪器设备、人员专业素质要求很高，且容易因为核酸扩增产物的交叉污染而出现假阳性。血清学检查简便快速的特性使其在临床上得到广泛应用。

淋病(gonorrhea)是淋病奈瑟菌(简称淋菌)引起的以泌尿生殖系统化脓性感染为主要表现的性传播疾病，是一种古老而又常见的性病。近年来发病率居我国(中国)性传播疾病首位，淋菌为革兰氏阴性双球菌，呈肾型，成双排列，离开人体不易生存，一般消毒剂容易将其杀灭，淋病的病原体即奈瑟菌，是1879年由Neisseria首次分离出的淋病双球菌，因而淋病双球菌又称为奈瑟双球菌(Neisseria gon-orrhoeas)。淋病双球菌呈肾形，两个凹面相对，大小一致，长约0.7微米，宽0.5微米。它是嗜二氧化碳的需氧菌，革兰染色阴性，最适宜在潮湿，含2.5-5％二氧化碳的环境中生长。常存在多核白细胞内，椭圆或球形，常成双排列，无鞭毛、无荚膜、不存在芽孢，对外界理化条件的抵抗力差，最怕干燥，在干燥环境中1-2小时即可死亡。在高温或低温条件下都易致死。对各种化学消毒剂的抵抗力也很弱。

目前，沙眼衣原体和淋病的检测方法耗费时间较长，由于STD疾病患者的隐私性考虑，很难获得患者的足够配合。而胶体金免疫层析技术得到了广泛应用，其检测方法最为简便、快捷；但是胶体金免疫层析技术仅能获得定性检测结果，而用于定量检测时往往精密度和准确度较差，并且稳定性不佳。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种快速定量检测沙眼衣原体和淋病的试剂盒，其具体是在PVC板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有稀土荧光微球标记抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成的试纸卡。

在一个实施方案中，稀土荧光微球标记抗体由稀土荧光微球标记淋病抗原单克隆抗体和稀土荧光微球标记沙眼衣原体抗原单克隆抗体组成。

在另一个实施方案中，所述稀土荧光微球掺杂有铕元素；所述稀土荧光微球的直径为50-100nm。

在本发明另一个实施方案中，所述吸附荧光微球标记的抗体的结合垫通过以下方法制备：

1)稀土荧光微球的活化；

2)稀土荧光微球标记的抗体制备：

a、将沙眼衣原体抗原单克隆抗体与上述活化的稀土荧光微球混合，反应过夜；然后加入硼氢化钠反应；封闭液封闭，封闭液组成为pH8.5的100mM Tris-HCl缓冲液中(含0.5％OVA、0.5％BSA和0.1％木质素磺酸钠)，离心洗涤3遍，重悬于的pH8.5的100mM Tris-HCl缓冲液中(含0.5％OVA、0.5％BSA和0.2％木质素磺酸钠)，4℃避光保存备用。

b、将淋病抗原单克隆抗体与上述活化的稀土荧光微球混合，反应过夜；然后加入硼氢化钠反应；封闭液封闭，封闭液组成为pH8.5的100mM Tris-HCl缓冲液中(含0.5％OVA、0.5％BSA和0.1％木质素磺酸钠)，离心洗涤3遍，重悬于的pH8.5的100mM Tris-HCl缓冲液中(含0.5％OVA、0.5％BSA和0.2％木质素磺酸钠)，4℃避光保存备用。

c、将步骤a和步骤b制备的稀土荧光微球微球标记抗体按体积比1：1混合备用。

3)将玻璃纤维膜浸泡于含1.5％木质素磺酸钠、0.5％BSA和0.5％OVA(卵清白蛋白)的100mM Tris-HCl缓冲液中，pH8.5；浸泡，然后取出并烘箱烘干，将玻璃纤维膜置于喷台上，用微定量喷头将稀土荧光微球标记抗体溶液喷到玻璃纤维膜，即得。

在本发明又一个实施方案中，所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜的制备方法如下：

用包被稀释液分别将淋病抗原单克隆抗体、沙眼衣原体抗原单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体制成溶液，将淋病抗原单克隆抗体和沙眼衣原体抗原单克隆抗体溶液作为检测线喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，羊抗小鼠IgG抗体制成溶液作为质控线喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，然后置于烘箱中烘干。

在一个具体实施方案中，所述包被稀释液为含0.5％OVA、0.5％BSA和0.5％木质素磺酸钠的100mM Tris-HCl缓冲液，pH8.5。

在本发明又一个实施方案中，所述样品垫的制备方法如下：

将玻璃纤维膜浸泡于0.25M Tris缓冲液(pH7.5)，含1.2％Triton X-100，2.5％BSA的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干4小时。

在本发明中，所述试纸卡的组装过程如下：在PVC板上依次粘贴经过处理的样品垫、吸附有稀土荧光微球标记的抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后得到试纸大板，按照要求切割成4mm宽，将试纸装入塑料卡内形成试纸卡。

所述试剂盒，检测方法为：1)将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；2)精确吸取100μl血清样本，样本为全血时吸取150μl样本，加入到样本孔中，15-30分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果；3)设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果。

在本发明的快速定量检测试剂盒的制备过程中，在封闭液和喷涂液中添加了木脂素磺酸钠，其作为表面活性剂时，不仅抗体稳定性效果极佳，并且由于其配体作用导致对铕元素荧光微球发光强度随着时间延长没有出现减弱现象。另外，考虑到淋病抗原单克隆抗体和沙眼衣原体抗原单克隆抗体可能会导致的相互影响，因此本发明对封闭液及喷涂液中所使用的封闭蛋白进行了详细筛选，最终发现OVA和BSA的组合效果最佳，其与木质素磺酸钠组合可以达到最佳的稳定效果，保证试剂盒中所使用的单抗的稳定性。

具体实施方式

还可进一步通过实施例来理解本发明，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。

在本发明中，在无特殊说明的前提下，“％”代表重量百分比。

实施例1快速检测试剂盒的制备

包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜的制备：

用包被稀释液将淋病抗原单克隆抗体(鼠抗人单克隆抗体，购自艾美捷(abnova)科技有限公司)、沙眼衣原体抗原单克隆抗体(鼠抗人MOMP单克隆抗体，购自艾美捷(abnova)科技有限公司)和羊抗小鼠IgG抗体制成溶液，具体为：将2mg/ml的淋病抗原单克隆抗体和1.5mg/ml的沙眼衣原体抗原单克隆抗体分别用包被稀释液制成检测线喷涂液，将5mg/ml的羊抗小鼠IgG抗体用包被稀释液制成质控线喷涂液；膜液量为2μl/cm，将它们分别作为淋病检测线、沙眼衣原体检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，两条检测线之间以及和质控线间隔均为5mm，然后置于烘箱中，37℃烘干4小时。包被稀释液为含0.5％OVA、0.5％BSA和0.5％木质素磺酸钠的100mM Tris-HCl缓冲液，pH8.5。

吸附荧光微球标记的抗体的结合垫制备：

1)稀土荧光微球的醛基化：

取15mg稀土荧光微球，用50mM，pH9.0的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为10分钟，最后重悬于200μl的上述碳酸盐缓冲液中。加入400μl醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时。采用同样的离心法洗涤和重悬到200μl的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用。

2)稀土荧光微球标记的抗体的制备：

a、将2mg的沙眼衣原体抗原单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4℃反应过夜。然后，加入硼氢化钠至终浓度15mM，4℃反应6小时；再加入等体积的封闭液(100mM的Tris-HCl缓冲液，pH8.5，含0.5％OVA、0.5％BSA和0.1％木质素磺酸钠)，4℃封闭过夜；然后用50mM pH6.5的Tris-HCl缓冲液，采用离心法洗涤3遍，重悬于200μl的100mM Tris-HCl缓冲液中含0.5％OVA、0.5％BSA和0.2％木质素磺酸钠)，4℃避光保存备用。

b、将2mg淋病抗原单克隆抗体与上述活化的稀土荧光微球混合，制备方法同步骤a；

c、将步骤a和步骤b制备的稀土荧光微球微球标记抗体按体积比1：1混合备用。

3)将玻璃纤维膜浸泡于含1.5％木质素磺酸钠、0.5％BSA和0.5％OVA(卵清白蛋白)的100mM Tris-HCl缓冲液中，pH8.5；4℃浸泡4小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用。将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将步骤2制备的稀土荧光微球标记的单克隆抗体溶液喷到玻璃纤维膜，37℃烘干4小时，即得。

在检测线中涂布的单克隆抗体和结合垫中的荧光微球标记用的单克隆抗体为配对抗体，购自艾美捷(abnova)科技有限公司。

所述样品垫的制备：

将玻璃纤维膜浸泡于0.25M Tris缓冲液(pH7.5)，含1.2％TritonX-100，2.5％BSA的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干4小时。

试纸卡的组装：在PVC板上依次粘贴经过处理的样品垫、吸附有稀土荧光微球标记的抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后得到试纸大板，按照要求切割成4mm宽，将试纸装入塑料卡内形成试纸卡。

实施例2试剂盒线性范围、精密度和灵敏度测试(淋病奈瑟菌)

将淋病奈瑟菌标准株(NC29400和NC29403，购自中国药品生物制品检定所)在培养基中扩增提纯，用PBS缓冲液制备成0.1、0.5、1、5、10、20和50mg/L的标准品溶液，备用；

试纸卡进行测定：

检测方法：将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡(实施例1制备)，平放；精确吸取100μl标准品样本，加入到试纸卡的样本孔中，20分钟后用荧光免疫层析分析仪进行检测。

线性：以荧光强度值和对应的标准品浓度建立标准曲线，NC29400的标准曲线为Y(荧光强度)＝143.9X+5.2，R2值>0.999，NC29403的标准曲线为Y(荧光强度)＝168.3X+6.1，R2值>0.999，说明本发明试纸卡在0.1-50mg/L范围内线性良好。

灵敏度：采用PBS缓冲液作为空白对照，以空白对照2倍荧光强度作为最低检测浓度(即灵敏度)，结果表明：0.05mg/L标准品平行测定5次的平均荧光强度为12.7RLU(NC29400)和15.3RLU(NC29403)；而空白对照的平均荧光强度为4.3RLU；说明试纸卡的灵敏度可达0.05mg/L。

精密度：将20mg/L标准品溶液采用实施例1制备试纸卡重复测定10次，计算CV。结果表明CV为2.79％。

在整个测试中，沙眼衣原体检测线一直为阴性，说明两者不存在交叉影响。

实施例3试剂盒线性范围、精密度和灵敏度测试(沙眼衣原体)

将沙眼衣原体膜蛋白用PBS缓冲液制备成0.01、0.05、0.1、1、5、10和20ng/ml的标准品溶液，备用；

试纸卡进行测定：

检测方法：将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡(实施例1制备)，平放；精确吸取100μl标准品样本，加入到试纸卡的样本孔中，20分钟后用荧光免疫层析分析仪进行检测。

线性：以荧光强度值和对应的标准品浓度建立标准曲线，具体为Y(荧光强度)＝101.7X+3.8，R2值>0.999，说明本发明试纸卡在0.01-20ng/ml范围内线性良好。

灵敏度：采用PBS缓冲液作为空白对照，以空白对照2倍荧光强度作为最低检测浓度(即灵敏度)，结果表明：0.01ng/ml标准品平行测定5次的平均荧光强度为4.9RLU；而空白对照的平均荧光强度为2.2RLU。说明试纸卡的灵敏度可达0.01ng/ml。

精密度：将10ng/ml标准品溶液采用实施例1制备试纸卡重复测定10次，计算CV。结果表明CV为1.81％。

实施例4稳定性测试

将实施例1制备的试纸卡在37℃环境下放置3个月，然后按照实施例2的方法测定试剂盒的标准曲线及R²值，并采用20mg/L的NC29403和10ng/ml的沙眼衣原体膜蛋白对试剂盒进行精密度考察(平行测定10次，计算CV％)，具体结果如下：

对比例1试纸卡制备同实施例1，区别在于，在制备各步骤中不添加木质素磺酸钠。

对比例2试纸卡制备同实施例1，区别在于，在制备各步骤中将木质素磺酸钠替换为等量的SDS。

对比例3试纸卡制备同实施例1，区别在于，在制备各步骤中将OVA替换为等量的BSA。

实施例5临床测试

从医院STD门诊收集淋病奈瑟菌感染或沙眼衣原体感染及健康人的唾液或尿液样本，采用实施例1试纸卡对样本进行测定，并且采用相同样本通过ELISA方法进行检测验证，结果见下表：

本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (7)

1.一种快速定量检测沙眼衣原体和淋病的试剂盒，其具体是在PVC板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有稀土荧光微球标记抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成的试纸卡。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，稀土荧光微球标记抗体由稀土荧光微球标记淋病抗原单克隆抗体和稀土荧光微球标记沙眼衣原体抗原单克隆抗体组成。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀土荧光微球掺杂有铕元素；所述稀土荧光微球的直径为50-100nm。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述吸附荧光微球标记的抗体的结合垫通过以下方法制备：

1)稀土荧光微球的活化；

2)稀土荧光微球标记的抗体制备：

a、将沙眼衣原体抗原单克隆抗体与上述活化的稀土荧光微球混合，反应过夜；然后加入硼氢化钠反应；封闭液封闭，封闭液组成为pH8.5的100mM Tris-HCl缓冲液中(含0.5％OVA、0.5％BSA和0.1％木质素磺酸钠)，离心洗涤3遍，重悬于的pH8.5的100mM Tris-HCl缓冲液中(含0.5％OVA、0.5％BSA和0.2％木质素磺酸钠)，4℃避光保存备用。

b、将淋病抗原单克隆抗体与上述活化的稀土荧光微球混合，反应过夜；然后加入硼氢化钠反应；封闭液封闭，封闭液组成为pH8.5的100mM Tris-HCl缓冲液中(含0.5％OVA、0.5％BSA和0.1％木质素磺酸钠)，离心洗涤3遍，重悬于的pH8.5的100mM Tris-HCl缓冲液中(含0.5％OVA、0.5％BSA和0.2％木质素磺酸钠)，4℃避光保存备用。

c、将步骤a和步骤b制备的稀土荧光微球微球标记抗体按体积比1：1混合备用。

3)将玻璃纤维膜浸泡于含1.5％木质素磺酸钠、0.5％BSA和0.5％OVA(卵清白蛋白)的100mM Tris-HCl缓冲液中，pH8.5；浸泡，然后取出并烘箱烘干，将玻璃纤维膜置于喷台上，用微定量喷头将稀土荧光微球标记抗体溶液喷到玻璃纤维膜，即得。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜的制备方法如下：

用包被稀释液分别将淋病抗原单克隆抗体、沙眼衣原体抗原单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体制成溶液，将淋病抗原单克隆抗体和沙眼衣原体抗原单克隆抗体溶液作为检测线喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，羊抗小鼠IgG抗体制成溶液作为质控线喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，然后置于烘箱中烘干。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述包被稀释液为含0.5％OVA、0.5％BSA和0.5％木质素磺酸钠的100mM Tris-HCl缓冲液，pH8.5。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品垫的制备方法如下：

将玻璃纤维膜浸泡于0.25M Tris缓冲液(pH7.5)，含1.2％Triton X-100，2.5％BSA的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干4小时。