CN104849455B - 一种基于梅毒血清学检测蛋白芯片制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种用于检测梅毒的蛋白质芯片及其制备与应用。本发明的所述蛋白质芯片的固相载体表面点阵固定有梅毒螺旋体重组抗原rTpN15‑17‑47。所述蛋白质芯片可以分别检测出梅毒患者血清中的IgG和IgM抗体，灵敏度高，可视检测限低至：0.19µg/mL；阳性率高达99.0%，均高于传统的TRUST和TPPA检测法。

Description

一种基于梅毒血清学检测蛋白芯片制备与应用
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种用于检测梅毒的蛋白质芯片及其制备与应用。
背景技术
梅毒由苍白(梅毒)螺旋体引起的慢性、系统性性传播疾病。其传播途径主要是性传播、母婴传播，很少通过器官移植传播。梅毒分为一期梅毒、二期梅毒、潜伏期、三期梅毒。一期梅毒通常是透过直接和他人的感染病灶做性接触而感染，在初次接触约3到90天后(平均21天)，在接触点会出现称为硬下疳的皮肤病灶。硬下疳是一个坚硬、不痛、不痒、底部明确、边缘清楚的皮肤溃疡。二期梅毒约在第一期感染四到十星期后发生，在躯干及四肢包括手掌及脚掌等部位可能会出现红至粉红色、不搔痒的对称性皮疹。一期及二期梅毒症状可以不经治疗自动消失。二期梅毒若不经治疗，感染症状可能会进入潜伏的、无症状的阶段几个月、几年或数十年。这个阶段包括早期潜伏期(2年之内出现感染)和晚期潜伏期(感染时间持续2年)。一期和二期梅毒具有较强的传染性。少数潜伏期梅毒患者进入三期梅毒，其症状包括神经梅毒、心血管疾病和损伤皮肤、骨骼和内脏(称为梅毒瘤)。
WHO估计每年的发病率为每年1200万例，超过90％的病例在发展中国家，东欧的发病率也在显著增加。先天性梅毒导致自然流产、死胎、新生儿死亡及疾病。对于全球健康问题特别重要的一点是意识到梅毒可增加2.3-8.6％患HIV的风险率。梅毒晚期疾病高度破坏的性质,使梅毒成为全球重要的健康问题。
梅毒的实验室检测方法包括：(1)直接检测暗视野显微镜法(DFM)和直接荧光法(DFA)检查梅毒螺旋体；(2)梅毒血清学检测方法：非螺旋体抗原和梅毒螺旋体特异性抗原检测方法。由于梅毒螺旋体不能子在体外培养和取血方便，因此血清学检测方法是检测梅毒最主要的方法。非螺旋体抗原检测方法包括：微量沉淀反应(MPR)、玻片沉淀试验(MSP)、快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)、性病研究实验室试验(VDRL)、甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)。梅毒螺旋体特异性抗原检测方法包括：酶联免疫吸附实验(ELISA)、梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)、梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)、血清荧光抗体吸收试验(FTA ABS)、免疫印迹法、酶免疫测定(EIA)、微量血凝法检测梅毒螺旋体(MHA-TP)和化学发光法(CLIA)。两种血清学检测方法都不能单独作出正确的诊断，非螺旋体抗原检测方法可作为治疗监测，但其敏感性和特异性较低，需要梅毒螺旋体特异性抗原检测方法验证。另一方面由于梅毒螺旋体特异性抗原检测方法监测阳性可能会持续一生，所以不能辨别梅毒感染是近期或以前感染和治疗或未治疗，又需要非螺旋体抗原检测方法确诊。因此,使用梅毒螺旋体特异性抗原测试筛选和非螺旋体抗原血清学测试确认测试是一个长期实践的逆转。
因此，需要继续寻找一种简单、快速、可靠、经济的诊断梅毒的方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的第一目的在于提供一种用于检测梅毒的蛋白质芯片，所述蛋白质芯片可以分别检测出梅毒患者血清中的IgG和IgM抗体，操作简单，检测结果稳定，效率更高，仅需2.5小时即可及时准确地确认被检测者是否患有梅毒。
本发明的另一目的在于提供所述用于检测梅毒的蛋白质芯片的制备及其应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
将梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47固定于固相载体表面，形成蛋白质芯片，用于梅毒的检测。
本发明的第一方面，提供了一种用于检测梅毒的蛋白质芯片，所述蛋白质芯片的固相载体表面点阵固定有梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47。
优选地，所述固相载体采用金箔芯片。
本发明的优选实施例中所采用的金箔芯片的基底为玻璃片，其上覆盖一层10nm厚度的纯金(纯度99.9％)，金箔之上为一区域化的50μm的TEFLON膜的阵列(96孔*2，8行*12列)，阵列孔径为1.25mm。
更优选地，所述固相载体采用表面进行了DSU修饰的金箔芯片。所述DSU亦即二硫双(琥珀酰亚氨基十一酸酯)。
优选地，所述蛋白质芯片的固相载体表面还点阵固定有阴性对照。
所述阴性对照是PBST溶液或阴性血清。
所述PBST溶液是由浓度0.01M，PH 7.2-7.4的磷酸缓冲液PBS与Tween 20混合配置而成的，PBS与Tween 20的体积比为100:1。
所述阴性血清为临床确诊未感染梅毒螺旋体的健康人的血清。
优选地，所述的蛋白质芯片的固相载体表面还点阵固定有阳性对照。
所述的阳性对照选用人免疫球蛋白IgG、IgM或阳性血清。
所述的阳性血清是临床确诊为感染梅毒螺旋体的梅毒患者的血清。
本发明的第二方面，提供了上述用于检测梅毒的蛋白质芯片的制备方法，包括如下步骤：
将梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47进行稀释，获得rTpN15-17-47溶液；采用常规方法将rTpN15-17-47溶液点阵于固相载体表面，并固定。
优选地，所述rTpN15-17-47溶液的终浓度为0.19～200μg/mL。
优选地，所述固相载体优选DSU修饰的金箔芯片。更优选地，所述rTpN15-17-47溶液的终浓度为50μg/mL。
优选地，采用PBST溶液对rTpN15-17-47进行稀释。
所述PBST溶液是由浓度0.01M，PH 7.2-7.4的磷酸缓冲液PBS与Tween 20混合配置而成的，PBS与Tween 20的体积比为100:1。
优选地，所述固定的条件优选室温条件下将点样好的芯片置于黑暗条件下固定1～16小时。
优选地，还可将阴性对照和阳性对照点样于固相载体表面。
所述阴性对照为PBST溶液或阴性血清。
所述的阴性血清为临床确诊未感染梅毒螺旋体的健康人的血清。
优选地，还将阳性对照点样于固相载体表面。
所述阳性对照是指临床确诊为感染梅毒螺旋体的梅毒患者的血清。
本发明的第三方面还公开了前述蛋白质芯片在制备梅毒检测试剂中的用途。
本发明的第四方面提供了一种梅毒检测试剂盒，所述试剂盒包括前述蛋白质芯片。
优选地，所述蛋白质芯片的固相载体表面点阵固定有梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47。
优选地，所述固相载体为金箔芯片。更优选地，所述固相载体为DSU修饰的金箔芯片。
特殊抗原和金箔芯片的选用是本发明试剂盒的关键。基于本发明的所述试剂盒采用的是荧光方法来进行定量检测，所以试剂盒中还可以包括其他一些试剂。例如：标准品，稀释液，清洗液中的一种或多种。具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据实际需要配置。
所述标准品包括抗梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47的IgG或IgM抗体。
优选地，所述的试剂盒还包括阴性对照。
所述阴性对照是PBST溶液或阴性血清。
所述的阴性血清为临床确诊未感染梅毒螺旋体的健康人的血清。
优选地，所述试剂盒还包括阳性对照。
所述阳性对照是指临床确诊为感染梅毒螺旋体的梅毒患者的血清。
优选地，所述的试剂盒还包括荧光素标记的IgG二抗、荧光素标记的IgM二抗。
优选地，所述荧光素标记为Cy3标记或Cy5标记。
本发明的第五方面还提供了所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
将血清样本点于蛋白质芯片上，孵育，清洗，再点加将荧光素标记的IgG二抗和荧光素标记的IgM二抗。
优选地，所述蛋白质芯片上，梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47的终浓度为50μg/mL。
优选地，所述孵育具体为室温条件下孵育1～16个小时。
清洗用于将未完全反应的血清从芯片上除去，可选用本领域常规的用于抗原抗体反应的洗液。优选地，可选用PBST作为洗液。
优选地，清洗时，PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
优选地，所述荧光素标记的IgG二抗和所述荧光素标记的IgM二抗的浓度为2.5μg/mL。
优选地，所述荧光素标记的IgG二抗为Cy3标记的IgG抗体。更优选为Cy3标记驴抗人IgG抗体。
优选地，所述荧光素标记的IgM二抗为Cy5标记的IgM抗体。更优选为Cy5标记羊抗人IgM抗体。
本发明所具有的有益效果为：
(1)蛋白质芯片可以分别检测出梅毒患者血清中的IgG和IgM抗体，灵敏度高：可视检测限低至0.19μg/mL；阳性率高达99.0％，均高于传统的TRUST和TPPA检测法。
(2)本发明的蛋白质芯片检测重复性好，特异性高，能够满足医院临床实验室快速筛检的需要。有助于判断患者是否处于急性感染或前期感染，治疗或者未治疗，对梅毒患者的检测和筛查具有重要的临床价值和社会效益。
附图说明
图1：为金箔芯片点样布阵图；其中阴性对照是指PBST空白对照；阴性血清是指临床确诊未感染梅毒螺旋体的健康人的血清；阳性血清是指临床确诊为感染梅毒螺旋体的梅毒患者的血清。
图2：为原子力显微镜扫描清洗后未进行化学修饰前金箔芯片平面表征；
图3：原子力显微镜扫描进行化学修饰后金箔芯片平面表征；
图4：梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47在芯片上包被时间和温度对荧光强度的影响；其中，图4A为相同浓度的rTpN15-17-47在芯片上包被不同时间和不同温度所得荧光扫描图；图4B为rTpN15-17-47在芯片上包被不同时间和不同温度所得荧光强度曲线图。
图5：梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47浓度梯度对荧光强度的影响；其中，图5A为不同浓度rTpN15-17-47在芯片上包被相同时间和相同温度所得荧光扫描图；图5B为不同浓度rTpN15-17-47在芯片上包被相同时间和相同温度所得荧光强度曲线图。
图6：抗梅毒抗体浓度梯度对荧光强度的影响；其中，图6A为采用不同浓度抗梅毒抗体包被进行检测时所得荧光扫描图；图6B为采用不同浓度抗梅毒抗体包被进行检测时所得荧光强度曲线图。
图7：Cy3标记的荧光二抗浓度梯度对荧光强度的影响；其中，图7A为采用不同浓度Cy3标记的荧光二抗进行检测时所得荧光扫描图；图7B为采用不同浓度Cy3标记的荧光二抗进行检测时所得荧光强度曲线图。
图8：可重复性实验检测图。
图9：梅毒患者与对照组血清稀释度对荧光强度的影响；其中，图9A：上面3排是病例组(任取3例病例组)，下面3排是对照组(任取3例对照组)；图9B：计算病例组荧光平均值与对应稀释度对照组荧光平均值的比值。
图10：梅毒患者样本IgG和IgM检测图；其中，图10A为梅毒患者样本IgM检测图；图10B为梅毒患者样本IgG检测图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
本发明各实施例原材料的来源与准备如下：
1.金箔芯片来源：
本发明所用金箔芯片来自Interactiva公司(德国，乌尔姆)，其基底为玻璃片，其上覆盖一层10nm厚度的纯金(纯度99.9％)，金箔之上为一区域化的50μm的TEFLON膜的阵列(96孔*2，8行*12列)，阵列孔径为1.25mm，如图1所示。
2.金箔芯片表面化学修饰试剂：
修饰液：浓度为4.0mM的二硫双(琥珀酰亚氨基十一酸酯)(DSU)的二甲基亚砜(DMSO溶液。[二硫双(琥珀酰亚氨基十一酸酯)购自日本DOJINDO公司,二甲基亚砜购自美国SIGMA-ALDRICH公司)。
3.抗原、抗体、荧光素类
梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47、多克隆兔抗梅毒螺旋体重组抗原IgG抗体购自MYBIOSOURCE公司；Cy3标记山羊抗兔IgG抗体、Cy3标记驴抗人IgG抗体购自Sangon公司；Cy5标记山羊抗人IgM抗体购自KPL公司；磷酸缓冲液(PBS)、Tween 20及胎牛血清(BSA)均购自SIGMA-ALDRICH公司。
4.PBST溶液：
是由磷酸缓冲液PBS与0.01M Tween 20混合构成。
.PBS-T配制：PBS一包溶解在1000ml去离子水中，然后加入1ml Tween-20，混匀，平放在摇床上过夜。PBS：0.01M，PH 7.2-7.4；Tween-20：0.1％(v/v)。
5.PBST-BSA溶液：
是由磷酸缓冲液PBS、0.01M Tween 20及0.1％胎牛血清BSA混合构成。
PBS-T-BSA溶液配制：取50μl BSA(200mg/ml)于10ml PBST溶液中，震荡，静置。得PBST-BSA溶液(需BSA质量浓度是0.1％(w/v))。
实施例1、金箔芯片表面化学修饰
步骤1：金箔芯片的清洗
配制TL1溶液(H2O：H2O2：NH3·H2O＝5：1：1，体积比)倒入不锈钢盒中，将金箔芯片放入盒中，82℃水浴6min，去离子水冲洗4-5次，乙醇2次，每次3min；氮气风干，干燥保存。
步骤2：对清洗后金箔芯片进行表面化学修饰，获得固相载体
将修饰液DSU点在清洗后的金箔芯片上(每点0.85μl)，黑暗条件下室温，湿盒中孵育2h。用丙酮清洗5次，每次4分钟；然后再用PBS(PH7.4)溶液清洗3次，每次2分钟。氮气干燥，得固相载体，待用。
图2和图3分别为利用原子力显微镜(AFM)观察金箔芯片在DSU修饰前后表征情况。可以看出，DSU修饰后的平面表面较修饰前的平面表面更为粗糙，表示经修饰后，化学基团共价连接到金箔芯片表面上。
实施例2、质控实验
制备孵育液1：将梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47溶于PBST-BSA溶液，配置成浓度梯度为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.13μg/mL，1.56μg/mL，0.78μg/mL，0.39μg/mL，0.19μg/mL的溶液。
制备孵育液2：将多克隆兔抗梅毒抗原(rTpN15-17-47)IgG抗体溶于PBST-BSA溶液，配置成抗体浓度梯度为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.13μg/mL，1.56μg/mL，0.78μg/mL，0.39μg/mL，0.19μg/mL的溶液。
制备孵育液3：将Cy3标记山羊抗兔IgG抗体溶于PBST-BSA溶液，配置成荧光二抗浓度梯度为5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL，0.078μg/mL，0.039μg/mL，0.019μg/mL的溶液。
制备孵育液4：将Cy3标记驴抗人IgG抗体溶于PBST-BSA溶液，配置成荧光二抗浓度梯度为5μg/mL，2.5μg/mL的溶液。
制备孵育液5：将Cy3标记驴抗人IgG抗体和Cy5标记山羊抗人IgM抗体等量溶于PBST-BSA溶液，配置成荧光二抗浓度梯度为5μg/mL，2.5μg/mL的Cy3标记驴抗人IgG抗体和Cy5标记山羊抗人IgM抗体混合溶液。
1、抗原孵育温度-时间质控实验
将50μg/mL的梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47溶液点到实施例1完成表面DSU化学修饰的金箔芯片固相载体上，分别在37℃，室温(25℃)和4℃条件下孵育16小时、8小时、4小时、2小时、1小时和0小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干；再将浓度为50μg/mL的多克隆兔抗梅毒抗原IgG抗体溶液点样于孵育有梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47探针的固相载体之上，室温(25℃)条件下孵育1小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。再将稀释浓度为2.5μg/mL的Cy3标记山羊抗兔抗IgG抗体溶于PBST-BSA溶液点样于孵育有抗体的固相载体之上，黑暗室温孵育0.5小时，取出用PBST-BSA清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
采用芯片扫描仪对固相载体进行扫描，即为抗原孵育温度-时间的质控实验，结果显示如图4所示。其中，图4A为相同浓度的rTpN15-17-47在芯片上包被不同时间和不同温度所得荧光扫描图；图4B为rTpN15-17-47在芯片上包被不同时间和不同温度所得荧光强度曲线图。
从图中可以看出：
(1)荧光强度随着孵育时间的延长而延长，当孵育时间大于1小时，荧光强度随着孵育时间的延长变化不是很明显。故在实际检测中，为了缩短孵育时间，建议探针制作的孵育时间大于1小时即可满足需求。
(2)孵育温度，荧光强度在室温(25℃)条件下强于37℃和4℃条件下的荧光强度。故在实际检测中，建议在室温(25℃)条件下进行孵育实验。
2、梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47浓度梯度孵育质控实验
将实施例1完成表面DSU化学修饰的金箔芯片作为固相载体，孵育液1梯度点到金箔芯片上，室温条件(25℃)下孵育1小时，取出后用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干，得用于梅毒免疫血清学诊断的蛋白质芯片。
将浓度为50μg/mL多克隆兔抗梅毒抗原IgG抗体溶液点样于上述孵育有梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47探针的蛋白质芯片之上，室温(25℃)条件下孵育1小时。取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干，待用。同时将PBST点样于同一蛋白质芯片的其他梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47探针上，作为阴性对照。
将浓度为2.5μg/mL的Cy3标记山羊抗兔IgG抗体溶液点样与上述孵育有抗体的芯片之上，黑暗，室温(25℃)条件下孵育0.5小时。取出用PBST清洗3次，每次2分钟。氮气吹干。
使用芯片扫描仪(北京博奥公司，型号：晶芯Luxscan 10K-A)对以上蛋白质芯片进行扫描，结果显示如图5所示。其中，图5A为不同浓度rTpN15-17-47在芯片上包被相同时间和相同温度所得荧光扫描图：从左到右，第1列至第11列分别代表的抗原浓度是200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.13μg/mL，1.56μg/mL，0.78μg/mL，0.39μg/mL，0.19μg/mL，第12列为阴性对照，抗原浓度为0；图5B为不同浓度rTpN15-17-47在芯片上包被相同时间和相同温度所得荧光强度曲线图：将图5A中每一列同一浓度所得8个荧光强度取平均值，以抗原浓度为横坐标，荧光强度平均值为纵坐标，绘制荧光强度曲线图。
从图中可以看出：在多克隆兔抗梅毒抗原IgG抗体和Cy3标记山羊抗兔IgG抗体孵育条件不变的情况下，当梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47孵育浓度大于0.19μg/mL时，所产生的荧光信号强度与阴性对照组产生的荧光信号强度有明显的差异。故显示孵育梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47的最优浓度应在0.19μg/mL以上。
3、多克隆兔抗梅毒抗原IgG抗体浓度梯度孵育质控实验
将实施例1完成表面DSU化学修饰的金箔芯片作为固相载体浸于浓度为50μg/mL的梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47溶液之中，室温(25℃)条件下孵育1小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干；再将孵育液2的多克隆兔抗梅毒抗原IgG抗体溶液点样于孵育有梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47探针的芯片之上，室温(25℃)条件下孵育1小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干；再加2.5μg/mL的Cy3标记山羊抗兔IgG抗体，黑暗，室温(25℃)条件下孵育0.5小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。同时将PBST点样于同一蛋白质芯片的其他梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47探针上，作为阴性对照。
使用芯片扫描仪对芯片进行扫描，即为多克隆兔抗梅毒抗原IgG抗体浓度梯度孵育质控实验，结果显示如图6。其中，图6A为采用不同浓度抗梅毒抗体包被进行检测时所得荧光扫描图：从左到右，第1列至第11列分别代表的抗体浓度是200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.13μg/mL，1.56μg/mL，0.78μg/mL，0.39μg/mL，0.19μg/mL，第12列为阴性对照，抗体浓度为0；图6B为采用不同浓度抗梅毒抗体包被进行检测时所得荧光强度曲线图：将图6A中每一列同一浓度所得8个荧光强度取平均值，以抗原浓度为横坐标，荧光强度平均值为纵坐标，绘制荧光强度曲线图。
从图中可以看出：在梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47和Cy3标记山羊抗兔IgG抗体孵育条件不变的情况下，当多克隆兔抗梅毒抗原IgG抗体孵育浓度大于0.39μg/mL时，所产生的荧光信号强度与阴性对照组产生的荧光信号强度存在着可辨识的差异。说明此修饰芯片可以检测到多克隆兔抗梅毒抗原IgG抗体的数量级在0.39μg/mL级。
4、Cy3标记山羊抗兔IgG抗体浓度梯度孵育质控实验
将实施例1完成表面化学修饰的金箔芯片作为固相载体浸于浓度为50μg/mL的梅毒rTpN15-17-47重组抗原溶液之中，室温(25℃)条件下孵育1小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干；再将浓度为50μg/mL的多克隆兔抗梅毒抗原IgG抗体溶液点样于孵育有梅毒rTpN15-17-47重组抗原探针的芯片之上，室温(25℃)条件下孵育1小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。再将稀释浓度为5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL，0.078μg/mL，0.039μg/mL，0.019μg/mL的孵育液3点样于孵育有抗体的芯片之上，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。同时PBST同时点样于同一蛋白质芯片的其他梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47探针上，作为阴性对照。
使用芯片扫描仪对芯片进行扫描，即为荧光素抗IgG抗体的质控实验，结果显示于图7。其中，图7A为采用不同浓度Cy3标记的荧光二抗进行检测时所得荧光扫描图：从左到右，第1列至第9列，二抗的浓度分别为5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL，0.078μg/mL，0.039μg/mL，0.019μg/mL；图7B为采用不同浓度Cy3标记的荧光二抗进行检测时所得荧光强度曲线图：将图7A中每一列同一浓度所得8个荧光强度取平均值，以二抗浓度为横坐标，荧光强度平均值为纵坐标，绘制荧光强度曲线图。
从图中可以看出：在梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47和多克隆兔抗梅毒抗原IgG抗体孵育条件不变的情况下，当Cy3标记山羊抗兔IgG抗体孵育浓度大于0.019μg/mL时，所产生的荧光信号强度与阴性对照组产生的荧光信号强度有明显的差异。故显示孵育Cy3标记山羊抗兔IgG抗体的最优浓度应在0.019μg/mL以上。
实施例3、可重复性实验
每32个孔作为一组，共三组，按照实施例1～3的方法步骤孵育浓度为50μg/mL的梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47、浓度为50μg/mL的兔抗梅毒螺旋体抗原IgG抗体和浓度为2.5μg/mL的Cy3标记山羊抗兔IgG抗体。可重复性实验结果，如表1和图8所示。
表1
如表1所示，SD是标准差，CV是变异系数，这两种指标可以反映蛋白质芯片在抗rTpN15-17-47IgG抗体检测中的稳定性及不会出现大的偏差。
如图8所示：三组荧光结果不受不同的点样孔的限制，重复性较好，稳定性较高。
从表1和图8中可以看出：该用蛋白芯片检测抗梅毒螺旋体抗原rTpN15-17-47IgG抗体的结果不受不同的点样孔的限制，重复性较好，稳定性较高。
实施例4、血清稀释度实验
任意取临床确诊为梅毒螺旋体感染的梅毒患者血清和临床确诊未感染梅毒疏螺旋体的健康人血清各3例。将每例血清用PBST-BSA按照梯度1:2.5,1:5,1:10,1:20,1:40,1:80,1:160；1:320,1:640，1:1280.1:2560稀释。然后点样到含有孵育浓度为50μg/mL的梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47的探针的芯片上，其余8个空点样液为PBST-BSA溶液，常温条件下孵育1小时，取出后用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。再加2.5μg/mL的Cy3标记驴抗人IgG抗体，黑暗，室温(25℃)条件下孵育0.5小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
使用芯片扫描仪对芯片进行扫描，结果显示如图9。图9A：上面3排是病例组(任取3例病例组)，下面3排是对照组(任取3例对照组)；图9B：计算病例组荧光平均值与对应稀释度对照组荧光平均值的比值。
我们设定病例组3个血清荧光值的平均值与对照组3个血清荧光值比大于4的稀释度可以用于实验检测。
实施例5、梅毒患者血清样本检测
将184例临床确诊为梅毒螺旋体感染的梅毒患者血清分别点样于含有孵育浓度为50μg/mL的梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47的探针的芯片的184个孔上，另外4个孔点样液为临床确诊未感染梅毒螺旋体的健康人血清，其余4个孔点样液为PBST-BSA溶液，常温条件下孵育1小时，取出后用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。再将孵育液5点样于孵育有患者血清抗体的芯片之上，黑暗，室温(25℃)条件下孵育0.5小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
使用芯片扫描仪对芯片进行扫描，结果分别显示为图10。其中，图10A为梅毒患者血清中IgM检测图；图10B为梅毒患者血清中IgG检测图。从图中可以看出：在实际检测临床已诊断为梅毒患者的血清中，阳性患者的血清的荧光强度与健康人群的血清以及PBST-BSA点样的荧光强度之间存在着明显的差异性。
根据荧光检测结果进行统计，血清中IgG以及IgM阳性结果，如表2所示：
表2
可以看出，在286例确诊为梅毒患者的血清检测结果中，其中有283例样品IgG或IgM阳性以及IgG和IgM均为阳性，计算阳性率为99.0％，均高于传统的TRUST和TPPA检测法。本发明的蛋白质芯片灵敏度高，可视最低检测限是0.19μg/mL。
进行卡方检验：rTpN15-17-47-Biochip(p>0.05vs.TPPA and p<0.01vs TRUST).
综上所述，本发明的蛋白芯片可以分别检测患者体内的抗rTpN15-17-47抗原IgG和IgM,提高了早期梅毒患者的检测率,在实际诊断梅毒螺旋体感染的抗rTpN15-17-47抗原抗体的血清学检测中有着良好的应用。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (5)

1.一种梅毒检测试剂盒，所述试剂盒包括用于检测梅毒的蛋白质芯片，所述蛋白质芯片的固相载体表面点阵固定有梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47；所述固相载体采用表面进行了DSU修饰的金箔芯片；所述的试剂盒还包括荧光素标记的IgG二抗和荧光素标记的IgM二抗。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述蛋白质芯片的固相载体表面还点阵固定有阴性对照。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述蛋白质芯片的固相载体表面还点阵固定有阳性对照。
4.一种制备如权利要求1～3任一权利要求所述的检测试剂盒中蛋白质芯片的方法，包括如下步骤：
将梅毒螺旋体重组抗原rTpN15-17-47进行稀释，获得rTpN15-17-47溶液；将rTpN15-17-47溶液点阵于固相载体表面，并固定。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述rTpN15-17-47溶液的终浓度为0.19～200μg/mL。
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