CN104374921B - 一种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于莱姆病鞭毛抗原(Flagellin)免疫血清学诊断的蛋白质芯片及其制备方法和应用，其特征在于：在固相载体表面点阵固定有伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针；固相载体为16‑氨基‑1‑十六烷硫醇修饰的金箔芯片，在16‑氨基‑1‑十六烷硫醇上结合有4‑(N‑马来酰亚胺基甲基)环己烷‑1‑羧酸琥珀酰亚胺酯和4‑(二甲氨基)吡啶。本发明的蛋白质芯片可以准确的探测出莱姆病患者血清中的抗鞭毛抗原IgG抗体和抗鞭毛抗原IgM抗体，操作简单、检测结果稳定。

Description

一种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片及其制备方法和应用
一、技术领域
本发明涉及一种蛋白质芯片，具体涉及伯氏疏螺旋体感染的莱姆病病人血清中相关的抗鞭毛抗原抗体的检测蛋白质芯片及其制备与使用。
二、技术背景
莱姆病(Lyme Diseas，LD)是一种由蜱虫传播的疏螺旋体感染人体，以多个器官损伤为特征的感染性疾病。在世界范围内，莱姆病在美国以及欧洲，尤其是斯堪的纳维亚半岛以及中欧地区为其高发地区，在中国，莱姆病的发病主要分布在大兴安岭地区以及大别山地区。莱姆病的主要病原体为疏螺旋体，分为三个亚型：伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，阿弗西尼疏螺旋体(Borrelia afzelii)和伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)。儿童发病率高于成人。环形游走性红斑(Erythema migrans，EM)是伯氏疏螺旋体感染的临床特征性表现，未经治疗的莱姆病病人在病情发展的数月到数年之间会发生神经性病变，外周神经以及中枢神经都将受累。但是由于莱姆病感染初期的临床表现的非特异性，即其环形游走性红斑的表现与诸多皮肤性疾病有类似及重叠的表现，以及临床医生对莱姆病的危害认识不足等原因，导致莱姆病易在临床上误诊或漏诊。
目前，在实验室诊断方面，许多技术可应用于确诊伯氏疏螺旋体的感染，其中包括细胞培养技术、免疫组织化学技术、聚合酶链反应以及用全细胞裂解液、重组蛋白和多肽进行的酶联免疫检测或者蛋白质印迹的血清抗体检测等技术。尽管如此，常规血清免疫方法在莱姆病诊断上的价值仍然存在着诸多问题。美国国家疾控中心推荐莱姆病检测的首选方法是用ELISA或者直接免疫荧光法对血清中疏螺旋体产生的抗体的检测，但是结果仍需要免疫印迹方法的确证。
目前公认的是，伯氏疏螺旋体菌体在感染后，人体免疫反应对其产生抗体主要针对于其鞭毛抗原(Flagellin)和外表面蛋白C抗原(Outer space protein C，OspC)。其中，鞭毛抗原是伯氏疏螺旋体主要的免疫性抗原。在感染伯氏疏螺旋体的早期和晚期都能够发现抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原抗体在血清中的表达。与其他菌体抗原相比，抗鞭毛抗原抗体检测目前是用于诊断伯氏疏螺旋体感染莱姆病较为理想的血清学指标。其中，血清中的IgG抗体分子量小，在疾病的发生中产生晚，维持时间长，消失慢，浓度高，可作为疾病既往感染的指标；而血清中的IgM抗体分子量大，在感染的初期就可检测到，维持时间短，消失快，是作为疾病急性期感染的指标。
生物芯片是近几年来迅速发展起来的集物理学、化学、材料科学和生命科学于一体的高新技术，利用微电子芯片技术的集成化和平行处理原理，将大量具有生物学意义的特殊标志物的生物样品有序地固化在玻璃片、硅片、金属片和高分子材料等基质表面，并利用微量反应提及，一次杂交就可以对许多血清中的生物标志物、突变或多态性进行特异、快速、精确检测。尤其是随着生物芯片技术以其高通量、高敏感性和高特异性的优势，其在生物学领域应用以及实验室技术方面应用已广泛被接受，在针对疾病大规模的人群筛查方面更是优势明显，已经在基因筛查、基因诊断、蛋白质相互作用以及细胞功能研究等领域获得成功应用。蛋白质芯片不仅可以研究蛋白间相互作用，并且由于其可以对痕迹材料进行检测，大大增加了检测物的敏感性，所以在疾病标志物的实验室诊断方面，其应用越来越广。
为了弥补临床上诊断伯氏疏螺旋体感染引起的莱姆病中产生的检测时限长、易误诊漏诊等情况的发生，因而，研发一种新型蛋白质芯片，对导致莱姆病的伯氏疏螺旋体鞭毛抗原产生的血清IgG抗体和IgM抗体进行检测，将大大提高临床诊断率以及对疾病高发区的人群进行有效筛查，这无疑具有潜在的临床价值和社会效益。
三、发明内容
本发明的目的之一在于提供一种诊断伯氏疏螺旋体感染的莱姆病患者血清中抗鞭毛抗原IgG抗体和抗鞭毛抗原IgM抗体的蛋白质芯片及其制作方法和使用方法。
本发明的另一个目的在于提供一种诊断伯氏疏螺旋体感染的莱姆病患者血清中抗鞭毛抗原IgG抗体和抗鞭毛抗原IgM抗体的蛋白质芯片试剂盒。
本发明解决技术问题采用如下技术方案：
本发明公开了一种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片，其特点在于：在固相载体表面点阵固定有伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针；所述固相载体为16-氨基-1-十六烷硫醇修饰的金箔芯片，在所述16-氨基-1-十六烷硫醇上结合有4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和4-(二甲氨基)吡啶。
本发明同时公来了用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片的制备方法，其特点在于按如下步骤进行：
步骤1：对金箔芯片进行表面化学修饰，获得固相载体
以浓度为0.8mM的16-氨基-1-十六烷硫醇的乙醇溶液为修饰液1，以100mg 4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯与50mg 4-(二甲氨基)吡啶溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺构成的混合液为修饰液2；对金箔芯片进行清洗后，浸入所述修饰液1中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，取出后用无水乙醇溶液清洗、氮气吹干；然后再浸于所述修饰液2之中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，取出后依次用N,N-二甲基甲酰胺和PBST溶液清洗、氮气吹干，获得固相载体待用；所述PBST溶液是由磷酸缓冲液PBS与Tween 20混合构成，在所述PBST溶液中Tween 20的浓度为0.01M；
步骤2：固定伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针
将伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度不低于12.5μg/mL的蛋白溶液；
将固相载体浸于所述蛋白溶液中，在4℃～37℃孵育0.5～12h，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干，即得用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质芯片；
其中，步骤1对金箔芯片进行清洗的方法优选为：将NH3、H2O2及H2O按体积比1：1：5混合构成TL1清洗液，将金箔芯片浸入盛有TL1清洗液的不锈钢清洗盒内，82℃水浴6分钟，清洗2次，取出之后用超纯水冲洗，再用无水乙醇清洗，最后用氮气吹干。
本发明上述用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片的使用方法，其特点在于：
将Cy3标记驴抗人IgG抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度不低于4.9μg/mL的IgG荧光二抗溶液；
将Cy3标记山羊抗人IgM抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度不低于4.9μg/mL的IgM荧光二抗溶液；
将待诊断患者血清点样于所述蛋白质芯片的任意两个伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针上，常温条件下孵育抗体1小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干；
将所述IgG荧光二抗溶液和所述IgM荧光二抗溶液分别点样于一个孵育有抗体的探针之上，然后用PBST溶液清洗、氮气吹干；
若探针处呈现荧光色，则待诊断患者血清中含有抗鞭毛抗原IgG抗体或抗鞭毛抗原IgM抗体，若探针处无荧光色，则待诊断患者血清中不含抗鞭毛抗原IgG抗体或抗鞭毛抗原IgM抗体；
在使用时，还应同时将健康人血清同时点样于同一蛋白质芯片的其他伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针上，作为阴性对照。
本发明还公开了基于上述蛋白质芯片的用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的试剂盒，其特点在于：包含上述的蛋白质芯片、PBST-BSA溶液、将Cy3标记驴抗人IgG抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成的浓度不低于4.9μg/mL的IgG荧光二抗溶液和将Cy3标记山羊抗人IgM抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度不低于4.9μg/mL的IgM荧光二抗溶液；
所述PBST溶液是由磷酸缓冲液PBS与Tween 20混合构成，在所述PBST溶液中Tween20的浓度为0.01M；
所述的PBST-BSA溶液是由磷酸缓冲液PBS、Tween 20及胎牛血清BSA混合构成，在所述PBST-BSA溶液中Tween 20的浓度为0.01M，胎牛血清BSA的质量百分数为0.1％。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明一方面利用金箔作为基质。其与传统玻璃片、硅片以及高分子材料基质的优势在于，金箔本身为惰性金属，但其与化学物质的结合与传统玻璃片和硅片相比来说更加牢固。并且金箔的生物亲和度较低，不易与基因或者蛋白质等物质产生非特异性吸附，大大降低了非特异性，避免了检测结果假阳性的产生。
本发明第二方面，在十六烷基修饰的基础上，对传统方法进行改良，进行活化的马来酸的修饰，利用具有活性的羧基末端与蛋白质结合，与传统马来酸修饰相比，这种新型活化马来酸修饰金箔芯片能结合更多蛋白质，提高了检测敏感性。
在用于实际检测临床莱姆病患者血中抗鞭毛抗原IgG抗体和抗鞭毛抗原IgM抗体方面，每张芯片可同时检测188例血清，灵敏度、特异性均较高，减少了假阳性和假阴性的发生几率。其次，芯片的稳定性和可重复性较好，增加了实验室诊断的准确性。尤其在与传统方法相比时，运用其在对莱姆病高危地区的人群进行大规模筛查，可提供更为简便和可靠的检测方法。
附图说明
图1为金箔芯片点样布阵图；
图2为原子力显微镜扫描清洗后金箔芯片平面表征；
图3为原子力显微镜扫描化学修饰后金箔芯片平面表征；
图4为伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原浓度梯度质控结果，其中兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体浓度为50μg/mL，Cy3标记山羊抗兔IgG抗体浓度为2500μg/mL；
图5为兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体浓度梯度质控结果，其中伯氏疏螺旋体鞭毛抗原浓度为50μg/mL，Cy3标记山羊抗兔IgG抗体浓度为2500μg/mL；
图6为Cy3标记山羊抗兔IgG抗体浓度梯度质控结果，其中伯氏疏螺旋体鞭毛抗原浓度为50μg/mL，兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体浓度为50μg/mL；
图7为伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原孵育时间-温度质控结果；
图8为莱姆病患者抗鞭毛抗原IgG抗体、阴性血清和阴性对照实际检测图；
图9为莱姆病患者抗鞭毛抗原IgM抗体、阴性血清和阴性对照实际检测图。
具体实施例
本发明各实施例原材料的来源与准备如下：
1、金箔芯片来源：本发明所用金箔芯片来自Interactiva公司(德国，乌尔姆)，其基底为玻璃片，其上覆盖一层10nm厚度的纯金(纯度99.9％)，金箔之上为一区域化的50μm的TEFLON膜的阵列(96孔*2，8行*12列)，阵列孔径为1.25mm，如图1所示。
2、金箔芯片表面化学修饰试剂：
修饰液1：浓度为0.8mM的16-氨基-1-十六烷硫醇的乙醇溶液。(16-氨基-1-十六烷硫醇购自日本DOJINDO公司)
修饰液2：100mg 4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯与50mg 4-(二甲氨基)吡啶溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺。(以上试剂均购自美国SIGMA-ALDRICH公司)
3、抗原、抗体、荧光素类
伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原购自MYBIOSOURCE公司；兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体购自ROCKLAND公司；Cy3标记山羊抗兔IgG抗体购自Sangon公司；Cy3标记驴抗人IgG抗体购自Sangon公司；Cy3标记山羊抗人IgM抗体购自KPL公司；磷酸缓冲液(PBS)、Tween 20及胎牛血清(BSA)均购自SIGMA-ALDRICH公司。
4、PBST溶液是由磷酸缓冲液PBS与0.01M Tween 20混合构成。
PBST-BSA溶液是由磷酸缓冲液PBS、0.01M Tween 20及0.1％胎牛血清BSA混合构成。
实施例1、金箔芯片表面化学修饰
步骤1、金箔芯片的清洗：由NH3：H2O2：H2O＝1：1：5的体积比例混合获得TL1清洗液。将金箔芯片置于盛有TL1清洗液的不锈钢清洗盒内，82℃水浴6分钟，清洗2次，取出之后用超纯水冲洗2分钟，2次，再用无水乙醇清洗2分钟，2次，之后用氮气吹干，置于干净密闭芯片盒中，待用。
步骤2、对清洗后金箔芯片进行表面化学修饰，获得固相载体
将清洗后的金箔芯片浸于修饰液1之中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，取出后用无水乙醇溶液清洗3次，每次2分钟，然后氮气吹干；再将此金箔芯片浸于修饰液2之中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，取出后用N,N-二甲基甲酰胺清洗3次，每次3分钟，再用PBST溶液(PH 7.4)清洗3次，每次2分钟，用氮气吹干，得固相载体待用。
图2和图3为利用原子力显微镜(AFM)观察金箔芯片修饰前后表征情况。可以看出，修饰后的平面表面较修饰前的平面表面更为粗糙，表示经修饰后，化学基团共价连接到金箔芯片表面上。这种修饰是首次在金箔平面上开展，与传统的马来酸修饰相比，提高了马来酸的活性，使其更容易于与蛋白质连接，增加了试剂检测的敏感性。
实施例2质控实验
制备孵育液1：将伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原溶于PBST-BSA溶液，配置成蛋白浓度梯度为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.12μg/mL，1.65μg/mL，0.78μg/mL，0.39μg/mL，0.19μg/mL的鞭毛抗原溶液。
制备孵育液2：将兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体溶于PBST-BSA溶液，配置成抗体浓度梯度为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.12μg/mL，1.65μg/mL，0.78μg/mL，0.39μg/mL，0.19μg/mL的溶液。
制备孵育液3：将Cy3标记山羊抗兔IgG抗体溶于PBST-BSA溶液，配置成荧光二抗浓度梯度为5000μg/mL，2500μg/mL，1250μg/mL，625μg/mL，312.5μg/mL，156.2μg/mL，78.1μg/mL，39.1μg/mL，19.5μg/mL，9.8μg/mL，4.9μg/mL的溶液。
制备孵育液4：将Cy3标记驴抗人IgG抗体溶于PBST-BSA溶液，配置成荧光二抗浓度梯度为5000μg/mL，2500μg/mL，1250μg/mL，625μg/mL，312.5μg/mL，156.2μg/mL，78.1μg/mL，39.1μg/mL，19.5μg/mL，9.8μg/mL，4.9μg/mL的IgG荧光二抗溶液。
制备孵育液5：将Cy3标记山羊抗人IgM抗体溶于PBST-BSA溶液，配置成荧光二抗浓度梯度为5000μg/mL，2500μg/mL，1250μg/mL，625μg/mL，312.5μg/mL，156.2μg/mL，78.1μg/mL，39.1μg/mL，19.5μg/mL，9.8μg/mL，4.9μg/mL的IgM荧光二抗溶液。
1、鞭毛抗原浓度梯度孵育质控实验。
将实施例1完成表面化学修饰的金箔芯片作为固相载体浸于孵育液1中，室温条件(25℃)下孵育2小时，取出后用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干，得用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质芯片。
将浓度为50μg/mL兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原抗体溶液点样于上述孵育有伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针的蛋白质芯片之上，室温(25℃)条件下孵育1小时。取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干，待用。
将浓度为2500μg/mL的Cy3标记山羊抗兔IgG抗体溶液点样与上述孵育有抗体的芯片之上，室温(25℃)条件下孵育1小时。取出用PBST清洗3次，每次2分钟。氮气吹干。
使用芯片扫描仪(北京博奥公司，型号：晶芯Luxscan 10K-A)对以上蛋白质芯片进行扫描，结果显示于图4。从图中可以看出：在兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体和Cy3标记山羊抗兔IgG抗体孵育条件不变的情况下，当伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原孵育浓度大于12.5μg/mL时，所产生的荧光信号强度与阴性对照组产生的荧光信号强度有明显的差异。故显示孵育伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原的最优浓度应在12.5μg/mL以上。
2、抗鞭毛抗原IgG抗体浓度梯度孵育质控实验。
将实施例1完成表面化学修饰的金箔芯片作为固相载体浸于浓度为50μg/mL的伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原溶液之中，室温(25℃)条件下孵育2小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干；再将孵育液2的兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体溶液点样于孵育有伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针的芯片之上，室温(25℃)条件下孵育1小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干；再加2500μg/mL的Cy3标记山羊抗兔IgG抗体，室温(25℃)条件下孵育1小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
使用芯片扫描仪对芯片进行扫描，即为抗鞭毛抗原IgG抗体浓度梯度孵育质控实验，结果显示与图5。从图中可以看出：在伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原和Cy3标记山羊抗兔IgG抗体孵育条件不变的情况下，当兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体孵育浓度大于6.25μg/mL时，所产生的荧光信号强度与阴性对照组产生的荧光信号强度存在着可辨识的差异。说明此修饰芯片可以检测到抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体的数量级在μg/mL级。
3、Cy3标记山羊抗兔IgG抗体浓度梯度孵育质控实验。
将实施例1完成表面化学修饰的金箔芯片作为固相载体浸于浓度为50μg/mL的伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原溶液之中，室温(25℃)条件下孵育2小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干；再将浓度为50μg/mL的兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体溶液点样于孵育有伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针的芯片之上，室温(25℃)条件下孵育1小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。再将稀释浓度为5000μg/mL，2500μg/mL，1250μg/mL，625μg/mL，312.5μg/mL，156.2μg/mL，78.1μg/mL，39.1μg/mL，19.5μg/mL，9.8μg/mL，4.9μg/mL的孵育液3点样于孵育有抗体的芯片之上，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
使用芯片扫描仪对芯片进行扫描，即为荧光素抗IgG抗体的质控实验，结果显示于图6。从图中可以看出：在兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体和伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原孵育条件不变的情况下，当Cy3标记山羊抗兔IgG抗体孵育浓度大于4.9μg/mL时，所产生的荧光信号强度与阴性对照组产生的荧光信号强度有明显的差异。故显示孵育Cy3标记山羊抗兔IgG抗体的最优浓度应在4.9μg/mL以上。
4、浓度-温度质控实验。
将实施例1完成表面化学修饰的金箔芯片作为固相载体浸于浓度为50μg/mL的伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原溶液，分别在37℃，室温(25℃)和4℃条件下孵育12小时、6小时、3小时、1小时和0.5小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干；再将浓度为50μg/mL的兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体溶液点样于孵育有伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针的芯片之上，室温(25℃)条件下孵育1小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。再将稀释浓度为2500μg/mL的Cy3标记山羊抗兔抗IgG抗体溶于PBST-BSA溶液点样于孵育有抗体的芯片之上，取出用PBST-BSA清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
芯片扫描仪对芯片进行扫描，即为Cy3标记山羊抗兔IgG抗体的质控实验，结果显示于图7。从图中可以看出：
1、荧光强度随着孵育时间的延长而延长，当孵育时间大于1小时，荧光强度随着孵育时间的延长变化不是很明显。故在实际检测中，为了缩短孵育时间，建议探针制作的孵育时间大于1小时即可满足需求。
2、在孵育温度的选择上，荧光强度在室温(24℃)条件下强于37℃和4℃条件下的荧光强度。故在实际检测中，建议在室温(24℃)条件下进行孵育实验。
实施例3莱姆病患者血清样本检测
将88例临床确诊为伯氏疏螺旋体感染的莱姆病患者血清分别点样于含有孵育浓度为50μg/mL的伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原的探针的芯片的88个孔上，另外4个孔点样液为临床确诊未感染伯氏疏螺旋体的健康人血清，其余4个孔点样液为PBST-BSA溶液，常温条件下孵育1小时，取出后用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。在另一相同芯片上做相同操作。再分别将1:2500稀释的Cy3标记驴抗人IgG抗体和1:2500稀释的Cy3标记山羊抗人IgM抗体溶于PBST-BSA溶液后点样于两个孵育有抗体的芯片之上，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。使用芯片扫描仪对芯片进行扫描。结果分别显示为图8和图9。从图中可以看出：在实际检测临床已诊断为莱姆病患者的血清中，阳性患者的血清的荧光强度与健康人群的血清以及PBST-BSA点样的荧光强度之间存在着明显的差异性。说明该芯片在实际诊断伯氏疏螺旋体感染的抗鞭毛抗体的血清学检测中有着良好的应用。
实施例4可重复性实验
表1为组内可重复性实验，每32个孔作为一组，共三组，按照步骤孵育浓度为50μg/mL的伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原、浓度为50μg/mL的兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体和浓度为2500μg/mL的Cy3标记山羊抗兔IgG抗体。
表1
表2为组间可重复性实验，每块芯片上32个孔作为一组，每天实验一次，连续3天实验，按照步骤孵育浓度为50μg/mL的伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原、浓度为50μg/mL的兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体和浓度为2500μg/mL的Cy3标记山羊抗兔抗IgG抗体。
表2
表1和表2中，SD是标准差，CV是变异系数，这两种指标可以反映生物芯片在抗鞭毛抗体检测中的稳定性及不会出现大的偏差。
从表1、2中可以看出：该用芯片检测抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体的结果不受不同的点样孔以及不同的点样时间的限制，重复性较好，稳定性较高。

Claims (3)

1.一种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片，其特征在于：在固相载体表面点阵固定有伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针；所述固相载体为16-氨基-1-十六烷硫醇修饰的金箔芯片，在所述16-氨基-1-十六烷硫醇上结合有4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和4-(二甲氨基)吡啶；
所述的用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片的制备方法，是按如下步骤进行：
步骤1：对金箔芯片进行表面化学修饰，获得固相载体
以浓度为0.8mM的16-氨基-1-十六烷硫醇的乙醇溶液为修饰液1，以100mg 4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯与50mg 4-(二甲氨基)吡啶溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺构成的混合液为修饰液2；对金箔芯片进行清洗后，浸入所述修饰液1中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，取出后用无水乙醇溶液清洗、氮气吹干；然后再浸于所述修饰液2之中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，取出后依次用N,N-二甲基甲酰胺和PBST溶液清洗、氮气吹干，获得固相载体待用；所述PBST溶液是由磷酸缓冲液PBS与Tween 20混合构成，在所述PBST溶液中Tween 20的浓度为0.01M；
步骤2：固定伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针
将伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度不低于12.5μg/mL的蛋白溶液；
将固相载体浸于所述蛋白溶液中，在4℃～37℃孵育0.5～12h，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干，即得用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质芯片；
所述PBST-BSA溶液是由磷酸缓冲液PBS、Tween 20及胎牛血清BSA混合构成，在所述PBST-BSA溶液中Tween 20的浓度为0.01M，胎牛血清BSA的质量百分数为0.1％。
2.根据权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于：步骤1对金箔芯片进行清洗的方法为：将NH3、H2O2及H2O按体积比1：1：5混合构成TL1清洗液，将金箔芯片浸入盛有TL1清洗液的不锈钢清洗盒内，82℃水浴6分钟，清洗2次，取出之后用超纯水冲洗，再用无水乙醇清洗，最后用氮气吹干。
3.一种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的蛋白质芯片、PBST-BSA溶液、将Cy3标记驴抗人IgG抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成的浓度不低于4.9μg/mL的IgG荧光二抗溶液和将Cy3标记山羊抗人IgM抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度不低于4.9μg/mL的IgM荧光二抗溶液；
所述PBST-BSA溶液是由磷酸缓冲液PBS、Tween 20及胎牛血清BSA混合构成，在所述PBST-BSA溶液中Tween 20的浓度为0.01M，胎牛血清BSA的质量百分数为0.1％。
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