CN105606821A - 一种用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质组合芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质组合芯片及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学检测领域，具体涉及一种用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质组合芯片及其制备与应用。本发明的第一方面，提供了一种蛋白质组合芯片，包括固相载体和捕获分子，所述捕获分子固定于所述固相载体表面上，所述捕获分子含有伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白（Flagellin）、伯氏疏螺旋体外膜蛋白C（OspC）以及伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白（VlsE）。所述蛋白质组合芯片还可含有，捕获分子VlsE？IR6多肽。与传统方法相比，本发明的蛋白质组合芯片在大大提高检测阳性率的基础上，还能够非常方便地区分感染类型。

Description

一种用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质组合芯片及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学检测领域，具体涉及一种用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质组合芯片及其制备与应用。
背景技术
莱姆病(LymeDiseas，LD)是一种由蜱虫传播的旋体感染引起的累及皮肤、神经、关节、心脏等多组织器官损伤的疾病。莱姆病的主要病原体为伯氏疏螺旋体，主要分为三个亚型：狭义伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferisensuestricto)，嘎氏伯氏疏螺旋体(Borreliaafzelii)和伽氏伯氏疏螺旋体(Borreliagarinii)。莱姆病菌株在我国也分为三种基因型，其中B.burgdorferisensuestricto、B.afzelii、B.garinii基因种比率分别为5.81％、23.26％、66.28％。莱姆病在美国以及欧洲，尤其是斯堪的纳维亚半岛以及中欧地区为其高发地区；在中国，莱姆病的发病主要分布在山区以及林区，儿童发病率高于成人。
环形游走性红斑(Erythemamigrans，EM)是莱姆病早期典型症状，未经治疗的莱姆病病人在病情发展的数月到数年之间会发生神经性病变，外周神经以及中枢神经都将受累，导致神经性莱姆病(neuroborreliosis,NB)。但是由于莱姆病感染初期的临床表现的非特异性，即其环形游走性红斑的表现与诸多皮肤性疾病有类似及重叠的表现，以及临床医生对莱姆病的危害认识不足等原因，导致莱姆病易在临床上误诊或漏诊。实验研究表明宿主动物对三种基因型伯氏疏螺旋体感染引起的临床症状有所不同，狭义伯氏疏螺旋体主要引起与关节有关的疾病，嘎氏伯氏疏螺旋体主要引起皮肤疾病，伽氏伯氏疏螺旋体主要引起与神经系统有关的疾病等。目前用于实验室诊断伯氏疏螺旋体感染的方法包括细胞培养技术、免疫组织化学技术、聚合酶链反应以及用全细胞裂解液、重组蛋白和多肽进行的酶联免疫检测或者蛋白质印迹的血清抗体检测等技术。尽管如此，常规血清免疫方法在莱姆病诊断上的价值仍然存在着诸多问题。美国国家疾控中心推荐莱姆病检测的首选方法是用ELISA或者直接免疫荧光法对血清中疏螺旋体产生的抗体的检测，但是结果仍需要免疫印迹方法的确证。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质组合芯片及其制备与应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一种蛋白质组合芯片，包括固相载体和捕获分子，所述捕获分子固定于所述固相载体表面上，所述捕获分子含有伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白(Flagellin)、伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)以及伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)。
优选地，所述固定为点阵固定。
优选地，所述固相载体为金箔芯片。
本发明的优选实施例中所采用的金箔芯片的基底为玻璃片，其上覆盖一层10nm厚度的纯金(纯度99.9％)，金箔之上为一区域化的50μm的TEFLON膜的阵列(96孔*2，8行*12列)，阵列孔径为1.25mm。
进一步优选地，所述固相载体为表面进行了DSU修饰的金箔芯片。所述DSU亦即二硫双(琥珀酰亚氨基十一酸酯)。
优选地，所述固相载体表面伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白(Flagellin)的密度范围是：
6x10-4μg/mm2～0.16μg/mm2。
进一步优选地，所述固相载体表面伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白(Flagellin)的密度范围是：
0.04μg/mm2～0.16μg/mm2。
优选地，所述固相载体表面伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)的密度范围是：
3x10-4μg/mm2～0.16μg/mm2。
进一步优选地，所述固相载体表面伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)的密度范围是：
0.04μg/mm2～0.16μg/mm2。
优选地，所述固相载体表面伯氏疏螺旋体表面蛋白VlsE的密度范围是：
3x10-4μg/mm2～0.16μg/mm2。
进一步优选地，所述固相载体表面伯氏疏螺旋体表面蛋白VlsE的密度范围是：
0.04μg/mm2～0.16μg/mm2。
优选地，所述固相载体表面还固定有VlsEIR6多肽，所述VlsEIR6多肽分别是VlsEIR6多肽1、VlsEIR6多肽2、VlsEIR6多肽3。
优选地，VlsEIR6多肽1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，具体为：AAMKKDDQIAAAIALRGMAKDGKFAVK。VlsEIR6多肽2的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，具体为：AAMKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALKD。VlsEIR6多肽3的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，具体为：AAMKKSDKIAAAIVLRGVAKDGKFAVA。
优选地，所述蛋白质组合芯片的固相载体表面还固定有阴性对照。
所述阴性对照是PBST-BSA溶液或阴性血清。
所述PBST-BSA溶液是由浓度0.01M、PH7.2-7.4的磷酸缓冲液PBS；0.1％(v/v)Tween20；0.1％(w/v)胎牛血清BSA混合构成。
所述阴性血清为临床确诊未感染伯氏疏螺旋体的健康人的血清。
优选地，所述的蛋白质组合芯片的固相载体表面还点阵固定有阳性对照。
所述的阳性对照选用人免疫球蛋白IgG、IgM或阳性血清。
所述的阳性血清是临床确诊的伯氏疏螺旋体感染患者的血清。
本发明的第二方面，提供了上述蛋白质组合芯片的构建方法，包括如下步骤：
将各捕获分子分别进行稀释，获得捕获分子溶液；采用常规方法将捕获分子溶液分别点阵于固相载体表面的不同位置，并固定。
本发明的第三方面还提供了前述蛋白质组合芯片在制备伯氏疏螺旋体检测试剂盒中的用途。
本发明的第四方面提供了一种伯氏疏螺旋体检测试剂盒，所述试剂盒包括前述蛋白质组合芯片。
组合特殊抗原和金箔芯片的选用是本发明蛋白质组合芯片盒的关键创新点。基于本发明的所述试剂盒采用的是荧光方法来进行定量检测，所以试剂盒中还可以包括其他一些试剂。例如：标准品，稀释液，清洗液中的一种或多种。具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据实际需要配置。
所述标准品包括伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白(Flagellin)、伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)以及伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)的IgG或IgM抗体。
优选地，所述的试剂盒还包括阴性对照。
所述阴性对照是PBST-BSA溶液或阴性血清。
所述的阴性血清为临床确诊未感染伯氏疏螺旋体的健康人血清。
优选地，所述试剂盒还包括阳性对照。
所述阳性对照是指临床确诊伯氏疏螺旋体感染患者的血清。
优选地，所述的试剂盒还包括荧光素标记的IgG二抗、荧光素标记的IgM二抗。
优选地，所述荧光素标记为Cy3标记或Cy5标记。
本发明的第五方面还提供了所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
将血清样本点于前述蛋白质组合芯片上，孵育，清洗，再点加将荧光素标记的IgG二抗和荧光素标记的IgM二抗混合溶液。
清洗用于将未完全反应的血清从芯片上除去，可选用本领域常规的用于抗原抗体反应的洗液。优选地，可选用PBST作为洗液。
优选地，清洗时，PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
优选地，所述荧光素标记的IgG二抗为Cy3标记的IgG抗体。更优选为Cy3标记驴抗人IgG抗体。
优选地，所述荧光素标记的IgM二抗为Cy5标记的IgM抗体。更优选为Cy5标记羊抗人IgM抗体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)一方面本发明利用金箔作为基质。其与传统玻璃片、硅片以及高分子材料基质的优势在于，金箔本身为惰性金属，但其与化学物质的结合与传统玻璃片和硅片相比来说更加牢固。并且金箔的生物亲和度较低，不易与基因或者蛋白质等物质产生非特异性吸附，大大降低了非特异性，避免了检测结果假阳性的产生。
(2)在用于实际检测临床莱姆病患者血中抗伯氏疏螺旋体重组鞭毛蛋白(Flagellin)、外膜蛋白C(OspC)、伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)抗原和VlsEIR6多肽IgG抗体和伯氏疏螺旋体重组鞭毛蛋白(Flagellin)、外膜蛋白C(OspC)、伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)抗原和VlsEIR6多肽IgM抗体方面，每张芯片可同时检测56例血清的组合蛋白质标记物，灵敏度、特异性均较高，减少组间检测假阳性和假阴性的发生几率。在与传统方法相比时，运用其在对莱姆病高危地区的人群进行大规模筛查，可提供更为简便和可靠的检测方法。并可在一次实验中对患者的不同基因型感染螺旋体类型进行区别，这样有助于对患者的诊断与治疗。
(3)本发明的蛋白质组合芯片可以在一次试验中检测一个样本的多个不同标志物，提高了筛查效率以及阳性检测率和准确度。
附图说明
图1.为金箔芯片点样布阵示意图。
图2.为傅里叶红外光谱仪扫描化学修饰后金箔芯片平面表征图。
图3A.为VlsE、Flagellin、OspC抗原浓度梯度对荧光强度影响的结果图。
图3B.为VlsE、Flagellin、OspC抗原浓度梯度对荧光强度影响的曲线图。
图4A.为抗VlsE、Flagellin、OspC抗原抗体浓度梯度对荧光强度影响的结果图。
图4B.为抗VlsE、Flagellin、OspC抗原抗体浓度梯度对荧光强度影响的曲线图。
图5A.用芯片扫描仪LuxscanTM10K-A在532nm波长扫描芯片Cy3标记驴抗人IgG抗体检测图。
图5B.用芯片扫描仪LuxscanTM10K-A在635nm波长扫描芯片Cy5标记山羊抗人IgM抗体检测图。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。
本发明各实施例原材料的来源与准备如下：
1.金箔芯片来源：本发明所用金箔芯片来自Interactiva公司(德国，乌尔姆)，其基底为玻璃片，其上覆盖一层10nm厚度的纯金(纯度99.9％)，金箔之上为一区域化的50μm的TEFLON膜的阵列(96孔*2，8行*12列)，阵列孔径为1.25mm，如图1所示。
2.金箔芯片表面化学修饰试剂：
修饰液：浓度为4.0mM的二硫双(琥珀酰亚氨基十一酸酯)(DSU)的二甲基亚砜(DMSO)溶液。二硫双(琥珀酰亚氨基十一酸酯)(DSU)购自日本DOJINDO公司，二甲基亚砜购自美国SIGMA-ALDRICH公司。
3.抗原、抗体、荧光素类
抗原：伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白(重组)(Flagellin)、伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(variablemajorprotein-likesequenceEprotein,VlsE)购自MYBIOSOURCE公司；伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(重组)(OuterspaceproteinC，OspC)购自Aviva公司；
3个VlsEIR6多肽从上海强耀生物公司合成(IR6多肽分别合成自狭义伯氏疏螺旋体菌株B31，嘎氏伯氏疏螺旋体cassette4和伽氏伯氏疏螺旋体菌株IP90的VlsE序列)；本发明中，我们定义IR6多肽1为P1，序列为AAMKKDDQIAAAIALRGMAKDGKFAVK(SEQIDNO.1)；IR6多肽2为P2，序列为AAMKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALKD(SEQIDNO.2)；IR6多肽3为P3，序列为AAMKKSDKIAAAIVLRGVAKDGKFAVA(SEQIDNO.3)。
抗体：兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白抗原IgG抗体，兔抗伯氏疏螺旋体外膜蛋白C抗原IgG抗体、兔抗伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白抗原IgG抗体均购自ROCKLAND公司。
荧光素：Cy3标记山羊抗兔IgG抗体，Cy3标记驴抗人IgG抗体购自Sangon公司；Cy3标记山羊抗人IgM抗体购自KPL公司。
4.PBST溶液是由磷酸缓冲液PBS与0.01MTween20混合构成。
PBST配制：PBS一包溶解在1000ml去离子水中，然后加入1mlTween-20，混匀，平放在摇床上过夜。PBS：0.01M，PH7.2-7.4；Tween-20：0.1％(v/v)。
5.PBST-BSA溶液是由0.01M、PH7.2-7.4的磷酸缓冲液PBS；0.1％(v/v)Tween20及0.1％(w/v)胎牛血清BSA混合构成。
PBST-BSA溶液配制：取50μlBSA(200mg/ml)于10mlPBST溶液中，震荡，静置。得PBST-BSA溶液(需BSA质量浓度是0.1％(w/v))。
磷酸缓冲液(PBS)、Tween20及胎牛血清(BSA)均购自SIGMA-ALDRICH公司。
实施例1载体的选择及表面化学处理
本发明选用金箔芯片，来自Interactiva公司(德国，乌尔姆)，其基底为玻璃片，其上覆盖一层10nm厚度的纯金(纯度99.9％)，金箔之上为一区域化的50μm的TEFLON膜的阵列(96孔*2，8行*12列)，阵列孔径为1.25mm，如图1所示。
步骤1.金箔芯片的清洗：
配制TL1溶液(H2O:H2O2:NH3·H2O＝5:1:1)倒入不锈钢盒中,将芯片放入盒中，82℃水浴6min，去离子水冲洗4-5次，乙醇2次，每次3min；氮气风干，干燥保存。
步骤2.对清洗后金箔芯片进行表面化学修饰，获得固相载体
将修饰液，亦即：浓度为4.0mM的二硫双(琥珀酰亚氨基十一酸酯)(DSU)的二甲基亚砜(DMSO)溶液，点在金箔芯片上(每点1μl)条件下，室温，湿盒中孵育2h。用丙酮清洗5次，每次4分钟；然后再用PBS(PH7.4)溶液清洗3次，每次2分钟。氮气干燥，得固相载体待用。
利用傅里叶红外光谱法(ATR-FTIR)观察金箔芯片修饰后表征情况。如图2所示，可以看出，1818、1787和1729cm-1归属于酯羰基；1070cm-1归属于N-C-O伸缩振动，1209cm-1归属C-N-C伸缩振动,这说明NHS基团在这个单分子层上，即化学基团共价连接到金箔芯片表面上。
实施例2质控实验
制备孵育液1：将VlsE、Flagellin、OspC抗原分别溶于PBST-BSA溶液，分别配置成浓度梯度为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.13μg/mL，1.56μg/mL，0.78μg/mL，0.39μg/mL，0.19μg/mL的抗原溶液。
制备孵育液2：将兔抗VlsEIgG抗体、兔抗FlagellinIgG抗体、兔抗OspCIgG抗体分别溶于PBST-BSA溶液，分别配置成抗体浓度梯度为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.13μg/mL，1.56μg/mL，0.78μg/mL，0.39μg/mL，0.19μg/mL的溶液。
制备孵育液3：将Cy3标记山羊抗兔IgG抗体溶于PBST-BSA溶液，配置成荧光二抗浓度为2.5μg/mL的溶液。
制备孵育液4：将Cy3标记驴抗人IgG抗体和Cy5标记山羊抗人IgM抗体等量溶于PBST-BSA溶液，配置成荧光二抗浓度为2.5μg/mL的Cy3标记驴抗人IgG抗体和Cy5标记山羊抗人IgM抗体混合溶液。
1、伯氏疏螺旋体重组VlsE、Flagellin、OspC抗原浓度梯度孵育质控实验
将实施例1完成表面化学修饰的金箔芯片作为固相载体，孵育液1梯度点到金箔芯片上，室温条件(25℃)下孵育2小时，取出后用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干，得用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质组合芯片。
将浓度为50μg/mL兔抗VlsEIgG抗体、兔抗FlagellinIgG抗体、兔抗OspCIgG抗体溶液分别点样于上述孵育有VlsE、Flagellin、OspC抗原探针的蛋白质组合芯片之上，室温(25℃)条件下孵育1小时。取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干，待用。
将浓度为2.5μg/mL的Cy3标记山羊抗兔IgG抗体溶液点样与上述孵育有抗体的蛋白质组合芯片之上，避光，室温(25℃)条件下孵育0.5小时。取出用PBST清洗3次，每次2分钟。氮气吹干。
使用芯片扫描仪(北京博奥公司，型号：晶芯Luxscan10K-A)对以上蛋白质组合芯片分别进行扫描，结果显示于图3A。如图3A所示，对于VlsE蛋白质组合芯片，从左自右，第1列至第11列分别代表的VlsE浓度分别为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.13μg/mL，1.56μg/mL，0.78μg/mL，0.39μg/mL，0.19μg/mL，最右边一列，亦即从左自右第12列，为PBST-BSA，阴性对照，抗原浓度为零；对于Flagellin蛋白质组合芯片，从左自右，从左自右，第1列至第11列分别代表的Flagellin的浓度分别为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.13μg/mL，1.56μg/mL，0.78μg/mL，0.39μg/mL，0.19μg/mL，最右边一列，亦即从左自右第12列，为PBST-BSA，阴性对照，抗原浓度为零；对于OspC蛋白质组合芯片，从左自右，第1列至第11列分别代表的OspC的浓度分别为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.13μg/mL，1.56μg/mL，0.78μg/mL，0.39μg/mL，0.19μg/mL，最右边一列，亦即从左自右第12列，为PBST-BSA，阴性对照，抗原浓度为零。
图3B为采用不同浓度抗原包被进行检测时所得荧光强度曲线图：将图3A中每一列同一浓度所得4个荧光强度取平均值，以抗原浓度为横坐标，荧光强度平均值为纵坐标，绘制荧光强度曲线图，结果如图3B所示。从图3B可以看出：在兔抗各个莱姆病抗原IgG抗体和Cy3标记山羊抗兔IgG抗体孵育条件不变的情况下，当VlsE、Flagellin、OspC重组抗原孵育浓度分别大于0.39μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL时，所产生的荧光信号强度与阴性对照组产生的荧光信号强度有明显的差异。故显示孵育VlsE、Flagellin、OspC重组抗原的最优浓度应分别在0.39μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL以上。
2、兔抗VlsE、Flagellin、OspC抗原IgG抗体浓度梯度孵育质控实验
将实施例1完成表面化学修饰的金箔芯片作为固相载体浸于浓度均为50μg/mL的VlsE、Flagellin、OspC重组抗原溶液之中，室温(25℃)条件下孵育2小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干；再将孵育液2的兔抗VlsE、Flagellin、OspC抗原IgG抗体溶液分别点样于孵育有VlsE、Flagellin、OspC重组抗原探针的芯片之上，室温(25℃)条件下孵育1小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干；再加2.5μg/mL的Cy3标记山羊抗兔IgG抗体，黑暗，室温(25℃)条件下孵育0.5小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
使用芯片扫描仪对芯片进行扫描，即为兔抗VlsE、Flagellin、OspC抗原IgG抗体浓度梯度孵育质控实验，结果显示如图4A所示。如图4A所示，对于VlsE蛋白质组合芯片：从左自右，第1列至第11列分别代表，兔抗VlsE抗原IgG抗体的浓度分别为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.13μg/mL，1.56μg/mL，0.78μg/mL，0.39μg/mL，0.19μg/mL，最右边一列，亦即从左自右第12列，为PBST-BSA，阴性对照，抗体浓度为0；对于Flagellin蛋白质组合芯片：从左自右，第1列至第11列分别代表，兔抗Flagellin抗原IgG抗体的浓度分别为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.13μg/mL，1.56μg/mL，0.78μg/mL，0.39μg/mL，0.19μg/mL，最右边一列，亦即从左自右第12列，为PBST-BSA，阴性对照，抗体浓度为零；对于OspC蛋白质组合芯片：从左自右，第1列至第11列分别代表，兔抗OspC抗原IgG抗体的浓度分别为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.13μg/mL，1.56μg/mL，0.78μg/mL，0.39μg/mL，0.19μg/mL，最右边一列，亦即从左自右第12列，为PBST-BSA，阴性对照，抗体浓度为零。
图4B为采用不同浓度抗体包被进行检测时所得荧光强度曲线图：将图4A中每一列同一浓度所得4个荧光强度取平均值，以抗体浓度为横坐标，荧光强度平均值为纵坐标，绘制荧光强度曲线图。
从图4B可以看出：在VlsE、Flagellin、OspC重组抗原和Cy3标记山羊抗兔IgG抗体孵育条件不变的情况下，当兔抗VlsE、Flagellin、OspC抗原IgG抗体孵育浓度分别大于0.39μg/mL、0.78μg/mL、0.78μg/mL时，所产生的荧光信号强度与阴性对照组产生的荧光信号强度存在着可辨识的差异。说明此修饰芯片可以检测到肉眼可视兔抗VlsE、Flagellin、OspC抗原IgG抗体浓度在μg/mL级。
实施例3莱姆病患者血清样本检测
选用56例临床已确诊莱姆病患者血清，分成两组，每组28例临床已确诊莱姆病患者血清，分别采用本发明的组合蛋白质组合芯片及检测方法进行检测。
第一组，将其28例临床已确诊莱姆病患者血清分别点样于含有孵育浓度均为50μg/mL的VlsE、Flagellin、OspC重组抗原、3个VlsEIR6多肽探针的芯片的168个孔上，另外12个孔点样液为临床确诊未感染伯氏疏螺旋体的健康人血清，其余12个孔点样液为PBST-BSA溶液，常温条件下孵育1小时，取出后用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。第二组，将其余28例临床已确诊莱姆病患者血清在另一相同芯片上做相同操作。再将浓度为2.5μg/mL的Cy3标记驴抗人IgG抗体和Cy5标记山羊抗人IgM抗体混合溶液点样于孵育有患者血清抗体的组合芯片之上，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。最后用芯片扫描仪LuxscanTM10K-A在532nm和635nm波长分别扫描芯片Cy3标记驴抗人IgG抗体和Cy5标记山羊抗人IgM抗体，结果分别显示为图5A和图5B所示，图5A代表Cy3标记驴抗人IgG抗体检测图，图5B代表Cy5标记山羊抗人IgM抗体检测图。从图5A和图5B中可以看出：其一，在实际检测临床已诊断为莱姆病患者的血清中，阳性患者的血清的荧光强度与健康人群的血清以及PBST-BSA点样的荧光强度之间存在着明显的差异性，说明该芯片在实际诊断莱姆病的血清学检测中有着良好的应用。
根据荧光检测结果进行统计，56例临床确诊莱姆病患者血清中莱姆病伯氏疏螺旋体蛋白和种属特异性多肽阳性率分布情况，如表1所示：
表1
说明：V：VlsE；F：Flagellin；O：OspC。
表1中所示，Flagellin或VlsE、Flagellin或OspC、VlsE或OspC阳性率分别是91.07％(51例)、91.07％(51例)、87.5％(49例)。而Flagellin或VlsE或OspC或P1或P2或P3阳性率增加到92.86％(52例)。
根据荧光检测结果进行统计，56例临床确诊莱姆病菌患者血清中伯氏疏螺旋体蛋白和种属特异性多肽IgG以及IgM抗体在莱姆病患者中的分布，如下表2所示：
表2
VlsE(％) Flagellin(％) OspC(％) P1(％) P2(％) P3(％)
IgM+/IgG+ 26(46.43) 21(37.50) 9(16.07) 26(46.43) 28(51.79) 30(53.57)
IgM+/IgG- 8(14.29) 18(32.14) 17(30.36) 4(7.14) 10(17.86) 8(14.29)
IgM-/IgG+ 16(28.57) 7(12.50) 11(19.64) 12(21.43) 1(1.79) 5(8.93)
IgM-/IgG- 6(10.71) 10(17.86) 19(33.93) 14(25.00) 16(28.57) 13(23.21)
说明：表2中括号外数字表示属于某一类型样品的个数；括号内数字表示属于某一类型样品的个数占56例全部样品的百分比。
分别采用本发明的蛋白质组合芯片与传统方法对56例临床已确诊莱姆病患者血清进行检测，并针对鞭毛蛋白的IgM抗体与ELISA方法比较，结果如表3所示：
表3
“+”：positive；“-”：negtive
*:χ2＝0.25,p>0.05
进行卡方检验：Biochipvs.ELISA，p>0.05，说明芯片方法与传统的ELISA方法检测莱姆病没有显著性差异。
根据上述结果，采用本发明的蛋白质组合芯片对56例临床已确诊神经性莱姆病血清进行检测，其中阳性样品有52例，阳性率为92.86％。可见，采用本发明蛋白质组合芯片不仅仅大大提高了阳性检出率，而且还能够非常方便地分辨出感染类型。
综上所述，通过组合芯片高通量、多靶位点对莱姆病临床血清学分析。并对神经性莱姆病患者IgM和IgG抗体对比分析，分析这些感染抗体变化与莱姆病患者临床表型的关系，以到达莱姆病早期诊断，判断预后，估价疗效的目的。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种蛋白质组合芯片，包括固相载体和捕获分子，所述捕获分子固定于所述固相载体表面上，所述捕获分子含有伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白(Flagellin)、伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)以及伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)。
2.根据权利要求1所述的蛋白质组合芯片，其特征在于，所述固相载体为金箔芯片。
3.根据权利要求1所述的蛋白质组合芯片，其特征在于，所述固相载体为表面进行了DSU修饰的金箔芯片。
4.根据权利要求1所述的蛋白质组合芯片，其特征在于，所述固相载体表面伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白(Flagellin)的密度范围是6x10-4μg/mm2～0.16μg/mm2。
5.根据权利要求1所述的蛋白质组合芯片，其特征在于，所述固相载体表面伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)的密度范围是3x10-4～0.16μg/mm2。
6.根据权利要求1所述的蛋白质组合芯片，其特征在于，所述固相载体表面伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)的密度范围是3x10-4～0.16μg/mm2。
7.根据权利要求1所述的蛋白质组合芯片，其特征在于，所述固相载体表面还固定有捕获分子VlsEIR6多肽，所述VlsEIR6多肽分别是VlsEIR6多肽1、VlsEIR6多肽2、VlsEIR6多肽3，VlsEIR6多肽1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，VlsEIR6多肽2的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，VlsEIR6多肽3的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。
8.如权利要求1～7任一权利要求所述蛋白质组合芯片的构建方法，包括步骤：将各捕获分子分别进行稀释，获得捕获分子溶液；采用常规方法将捕获分子溶液分别点阵于固相载体表面的不同位置，并固定。
9.如权利要求1～7任一权利要求所述蛋白质组合芯片在制备伯氏疏螺旋体检测试剂盒中的用途。
10.一种伯氏疏螺旋体检测试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～7任一权利要求所述蛋白质组合芯片。
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