CN108333354B - 一种用于人类血清十种糖链联合检测的凝集素芯片及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于人类血清十种糖链联合检测的凝集素芯片及其制备和使用方法，其是在固相载体表面点阵固定有十种特异性凝集素探针，通过包被十种特异性凝集素以实现人血清中十种糖链的联合检测；其中，固相载体为16‑氨基‑1‑十六烷硫醇和DOTA‑NHS‑ester化学修饰的金箔芯片，且DOTA‑NHS‑ester末端的三个羧基用EDC和NHS活化，以固定特异性凝集素为探针。本发明的芯片具有高通量、高选择性、特异性高等优点，更适应于人类肿瘤糖基谱特点的研究。

Description

一种用于人类血清十种糖链联合检测的凝集素芯片及其制备 和使用方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测人类血清糖链水平的凝集素芯片，属于生物技术领域。

背景技术

根据《2017年中国肿瘤登记年报》，中国每天有一万人确诊为癌症，每分钟约7人确诊患癌。预期人寿命86岁时，累积患癌风险高达36％。死亡率排前的癌症主要为肺癌和消化系统癌症。其中，胃癌的发病率和死亡率均位于中国肿瘤年报的第二位，并且胃癌已连续多年位于安徽省肿瘤发病率的第一位。虽然医疗技术、检测手段已有了很大提高，但是由于人们对放射线、胃肠镜等检查的担心和恐惧，使得肿瘤的早期检出率一直不高。同时肿瘤的生物学行为存在明显个体差异，大多数肿瘤缺乏特异的靶向治疗药物，并且没有有效地用于评估疗效的指标，这些都使得患者对肿瘤的治疗效果不满意，治疗手段发展缓慢。

生命代谢过程中，蛋白质糖链改变往往比蛋白质本身更容易受到疾病过程影响。已有报道，细胞膜糖蛋白和糖脂异常、糖基变化是肿瘤细胞显著特征之一，并与肿瘤细胞黏附、侵蚀、转移及肿瘤免疫学密切相关。随着精准医疗理念发展，肿瘤标记物筛查与应用已成为肿瘤生物学治疗重要靶标。目前已有十种糖蛋白被美国FDA批准用于临床，如HER-2、CEA、CA199、AFP和PSA等，已被广泛应用于肿瘤预防、诊断、治疗及预后判断。研究发现，哺乳动物共有十种糖链，其中人类有九种：D-glucose(D-Glc，D-葡萄糖)、D-mannose(D-Man，D-甘露糖)、D-galactose(D-Gal，D-半乳糖)、N-acetylglucosamine(N-GlcNAc，N-乙酰氨基葡萄糖)、N-acetylgalactosamine(N-GalNAc，N-乙酰半乳糖胺)、D-glucuronic acid(D-GlcA，D-葡萄糖醛酸)、L-fucose(L-Fuc，L-岩藻糖)、N-acetylneuraminic acid(Neu5Ac，N-乙酰神经氨酸)和D-xylose(D-Xyl，D-木糖)等。一些非正常修饰如岩藻糖基化、唾液酸化作用、β1,6分支N-glycans以及Tn antigen(被删减的O-glycan)与肿瘤发展密切相关。

目前已发现300余种凝集素，分别来源于细菌、病毒、植物及动物。凝集素对糖链亲和力具有个体特异性，每一种凝集素都具有针对某一种特异性糖基的专一性结合能力。因此，凝集素可作为一种探针来研究细胞膜上特定糖基。传统检测手段对于高通量蛋白质糖基化研究评价众说纷纭。基于此，凝集素芯片可作为多重分析病理学样本高通量检测平台。与以往传统方法相比，凝集素芯片具有高通量、高选择性、特异性高等优点，更适应于人类肿瘤糖基谱特点的研究。

凝集素芯片目前主要应用于胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌以及生殖医学等方面。虽然已有研究发现，胃癌患者血清LCA、ACA以及PHA-E+L结合的糖蛋白的糖链含量比正常胃以及胃炎患者明显增加，并且ACA结合的糖链分子可能与胃癌预后相关。肝癌患者血清糖蛋白岩藻糖含量明显高于正常人。但上述研究标本大多选自患者手术大体材料或体外培养细胞，因此无法进行普通人群大规模样本的高通量筛查，缺乏对肿瘤患者进展、疗效以及预后判断的有效手段。

以往糖链研究多使用商业化凝集素芯片，使用玻璃或凝胶作为包被载体，凝集素探针易于洗脱、芯片几何图片不佳、敏感性较低，尤其是患者血清糖链变化与肿瘤侵袭、转移以及与患者生存期相关性研究缺乏。因此，亟需深入研究肿瘤的糖链特点，寻找可以用于肿瘤的早期发现、治疗评价、复发或进展监控以及生存期预警的特异性糖链。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测人类普通人群及肿瘤患者血清糖链水平的组合凝集素芯片及其制备方法和使用方法。

本发明解决技术问题采用如下技术方案：

本发明首先公开了一种用于人类血清十种糖链联合检测的凝集素芯片，其特点在于：所述凝集素芯片是在固相载体表面点阵固定有十种特异性凝集素探针，通过包被十种特异性凝集素以实现人血清中十种糖链的联合检测；

所述固相载体为16-氨基-1-十六烷硫醇和DOTA-NHS-ester化学修饰的金箔芯片，且DOTA-NHS-ester末端的三个羧基用EDC和NHS活化，以固定特异性凝集素为探针；

所述十种特异性凝集素探针为ConA、PNA、VVA、MAL-I、AAL、LTL、NPL、SNA、RCA-I、和AIL，分别对应于人类血清中的糖链α-Man、α-Glc、Galβ3GalNAc(T抗原)、GalNAc(Tn抗原)、Galβ4GlcNAc、Fucα6GlcNAc、α-Fuc、Neu5Acα6Gal、Gal和Galβ3GalNAc(sTn抗原)。

上述凝集素芯片的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、对金箔芯片进行表面化学修饰，获得固相载体

以浓度为0.8mM的16-氨基-1-十六烷硫醇的乙醇溶液为修饰液1；以浓度为10mM的DOTA-NHS-ester的DMSO溶液为修饰液2；将NHS和EDS溶于0.1M、pH＝3.5的MES缓冲液中作为修饰液3，在所述修饰液3中NHS浓度为50mM、EDC浓度为200mM；

对金箔芯片进行清洗后，浸入所述修饰液1中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，使16-氨基-1-十六烷硫醇通过Au-S键组装到金箔芯片，取出后用无水乙醇溶液清洗、氮气吹干，完成第一层修饰；在干燥的金箔芯片上每孔点样0.78μL修饰液2，然后置于干燥的孵育盒中室温下孵育12小时，取出后用DMSO溶液清洗、氮气吹干，完成第二层修饰；

在进行步骤2的固定探针前，再在金箔芯片上每孔点样0.84μL修饰液3，然后置于密闭的湿盒中室温下孵育0.5小时，使DOTA-NHS-ester末端的三个羧基活化，从而使其可通过酰胺反应稳定结合凝集素探针，取出后用PBST缓冲液清洗、氮气吹干，即获得固相载体待用；

步骤2、固定十种特异性凝集素作为探针

称取HEPES粉末0.2383g和无水氯化钙0.0011g溶于100mL纯水中，调节pH值至8.5，获得HEPES缓冲液；然后将十种凝集素分别溶于所述HEPES缓冲液中，并使各凝集素的终浓度为1mg/mL，获得相应的凝集素溶液；在各凝集素溶液中加入BSA，使BSA质量浓度为0.001％，用于封闭未结合的已活化的羧基，以进一步有效避免实验的非特异性吸附；

将各凝集素溶液点样于步骤1获得的固相载体上，在第1～10列的每一纵列中点样一种凝集素溶液，并在第11列再点样ConA溶液作为空白对照，每孔0.84μL，然后置于湿盒中室温下孵育2小时，取出用PBST缓冲液清洗、氮气吹干，即获得用于人类血清十种糖链联合检测的凝集素芯片；

所述PBST缓冲液是由浓度0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲液与Tween20混合配置而成的，在所述PBST缓冲液中Tween20的体积浓度为0.1％。

具体的，步骤1对金箔芯片进行清洗的方法为：将NH₃、H₂O₂及H₂O按体积比1：1：5混合构成TL1清洗液，将金箔芯片浸入盛有TL1清洗液的不锈钢清洗盒内，82℃水浴6分钟，取出之后用超纯水冲洗，再用无水乙醇清洗、氮气吹干。

本发明还公开了所述凝集素芯片的使用方法，其特点在于，将待测血清预处理后，再进行检测，所述预处理包括如下步骤：

步骤1、去除待测血清中的高丰度蛋白：

取待测血清33μL，用浓度0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲液稀释至100μL，然后通过层析柱去除待测血清中的白蛋白和球蛋白，获得去蛋白后待测血清；

步骤2、测定去蛋白后待测血清的蛋白浓度C

通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定所述去蛋白后待测血清的蛋白浓度C，单位mg/mL；

步骤3、Cy3荧光标记

1)配制0.1M碳酸氢钠缓冲液：在100mL去离子水中分别加入碳酸钠1.06g、碳酸氢钠0.84g，使用前调pH值至8.0；

2)将1mg Cy3NHS溶于50μL DMSO中，获得Cy3溶液；

3)根据步骤2)所测定的去蛋白后待测血清的蛋白浓度C，按式(1)计算所需Cy3溶液的用量V，单位mL；

式中，M₁为荧光标记物Cy3的分子量、M₂为蛋白质分子量，M₁＝829.03、M₂＝65000；

4)将去蛋白后待测血清20μL、体积为V的Cy3溶液与浓度0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲液80μL及0.1M碳酸氢钠缓冲液100μL混合均匀，然后室温下避光孵育1h，即完成待测血清的Cy3荧光标记；

步骤4、用G-25层析柱去除荧光标记后待测血清中多余的Cy3，即完成待测血清的预处理；

将预处理后待测血清点样于所述凝集素芯片任一行的前十列，并在第11列点样浓度0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲液作为空白对照，每孔0.84μL，然后置于湿盒内，室温下孵育0.5h，用PBST缓冲液清洗后再用芯片仪进行检测；

所述PBST缓冲液是由浓度0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲液与Tween20混合配置而成的，在所述PBST缓冲液中Tween20的体积浓度为0.1％；

按与待测血清相同的方式，对健康人血清进行预处理与检测，作为阴性对照。

本发明进一步公开了一种用于人类血清十种糖链联合检测的凝集素芯片的试剂盒，其特点在于，所述试剂盒内包含有：所述的凝集素芯片；浓度0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲液；PBST缓冲液；0.1M碳酸氢钠缓冲液；Cy3溶液；去除血清中高丰度蛋白的层析柱；BCA蛋白浓度测定试剂盒；G-25层析柱；

所述PBST缓冲液是由浓度0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲液与Tween20混合配置而成的，在所述PBST缓冲液中Tween20的体积浓度为0.1％；

所述0.1M碳酸氢钠缓冲液是在100mL去离子水中加入碳酸钠1.06g和碳酸氢钠0.84g，然后调pH值至8.0获得；

所述Cy3溶液是由1mg Cy3NHS溶于50μL DMSO中获得。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

一方面，本发明制备DOTA-NHS-ester新型化学修饰的金箔芯片作为基底。金箔与化学物质的结合与传统玻璃片和硅片相比更加牢固，使用玻璃或凝胶作为包被载体，凝集素探针易于洗脱、芯片几何图片不佳、敏感性较低。而惰性的金箔的生物亲和度较低，不易与基因或者蛋白质等物质产生非特异性吸附。同时，DOTA-NHS-ester联合16-氨基-1-十六烷硫醇是一种新型化学修饰方法，从未见在金箔芯片平台使用的报道，该修饰利用活化的三个羧基末端可以最大程度地捕捉凝集素，将信号放大，结合稳定且具有高敏感性。

另一方面，本发明使用2*96(8行12列)孔芯片模式，具有高通量性，每张芯片可检测16人，每人十种凝集素结合的糖链，分别为α-Man、α-Glc、Galβ3GalNAc(T抗原)、GalNAc(Tn抗原)、Galβ4GlcNAc、Fucα6GlcNAc、α-Fuc、Neu5Acα6Gal、Gal和Galβ3GalNAc(sTn抗原)。以往报道的凝集素芯片，缺乏人类糖基特点的针对性，虽然凝集素种类繁多，却大多为某些糖链的重复检测，不仅增加检测成本，而且无法涵盖所有糖链，无法全面了解人血清糖链情况。本发明的凝集素芯片，采用新型的凝集素芯片组合，能够最大程度地节约检测成本，一次性集中检测所有十种不同的糖链。通过对芯片荧光扫描，可以得到人血清中十种糖链的荧光值。而这十种糖链是目前肿瘤研究的关键性糖链，通过与临床病理学资料的统计对比，可以更细致地了解患者肿瘤的特征，更好地指导临床用药、了解肿瘤进展。以往文献中提及凝集素芯片大多是从人体手术组织中提取样本，缺乏肿瘤前瞻性，无法进行手术前后及其术后复发情况地预测。本发明的凝集素芯片适用于普通人群的大样本筛查及肿瘤早期发现、治疗评价、复发或进展监控以及生存期预警的情况，具有高通量、高选择性、特异性高等优点，更适应于肿瘤糖基谱特点的研究。

附图说明

图1为原子力显微镜扫描化学修饰前后金箔芯片平面表征，其中(a)对应未修饰金箔芯片、(b)对应已修饰金箔芯片；

图2为DOTA-NHS-ester进行表面化学修饰的浓度对人IgG荧光强度的影响，其中：图2(a)为不同浓度的DOTA-NHS-ester进行表面化学修饰所得IgG荧光扫描图；图2(b)为所得荧光强度曲线图。

图3为实验环境温度对DOTA-NHS-ester进行表面化学修饰后荧光强度的影响，其中：图3(a)为不同温度的DOTA-NHS-ester进行表面化学修饰后荧光强度的扫描图；图3(b)为所得荧光强度曲线图。

图4为凝集素ConA免疫特异性检测，其中：图4(a)为不同浓度ConA和不同浓度抗ConA进行免疫特异性检测所得荧光扫描图；图4(b)为所得荧光强度曲线图。

图5为凝集素组合芯片检测胃腺癌患者血清中糖链的扫描结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明，下述实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用材料和试剂的来源与准备如下：

1、金箔芯片

以来自德国乌尔姆Interactiva公司的金箔芯片为基础平面，该芯片以玻璃片为基底，表面覆盖一层0.1μm厚度的纯金(纯度99.9％)，其上被覆50μm的TEFLON膜阵列(96孔×2，8行×12列)，阵列孔径为1.25mm，每孔溶剂最大可为1μL。

2、表面化学修饰

16-氨基-1-十六烷硫醇，购自日本东仁化学公司；

DOTA-NHS-ester购自Macrocyclics公司(美国)；

N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺(EDC)购自Sigma-Aldrich公司(美国)；

2-(N-吗啉代)乙烷磺酸一水(MES)缓冲液购自生工生物工程有限公司(上海，中国)。

以浓度为0.8mM的16-氨基-1-十六烷硫醇的乙醇溶液为修饰液1；以浓度为10mM的DOTA-NHS-ester的DMSO溶液为修饰液2；将NHS和EDS溶于0.1M、pH＝3.5的MES缓冲液中作为修饰液3，在所述修饰液3中NHS浓度为50mM、EDC浓度为200mM。

3、凝集素、抗体、荧光素类

凝集素ConA、PNA、VVA、MAL-I、AAL、LTL、NPL、SNA、RCA-I、和AIL购自Vector公司(美国)；

人IgG购自英国abcam公司

Cy3标记的驴抗人IgG抗体及Cy3标记的驴抗兔IgG抗体购自上海生工生物工程股份有限公司；

Cy3标记的兔抗-ConA购自Sigma公司；

Cy3荧光染料购自AAT Bioquest公司(美国)。

4、缓冲液类

HEPES粉末，PBS粉末、Tween20及胎牛血清(BSA)粉末均购自Sigma公司；

盐酸、碳酸氢钠、氢氧化钠(分析纯)购自上海振企化学试剂有限公司(中国)。

PBST缓冲液：将商品化PBS粉末溶解在去离子水中，形成浓度0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲液；然后加入Tween-20，混匀，获得PBST溶液，在PBST溶液中Tween20的体积浓度为0.1％。

HEPES溶液：称取HEPES粉末0.2383g和无水氯化钙0.0011g溶于100mL纯水中，调节pH值至8.5，获得HEPES缓冲液。

0.1M碳酸氢钠缓冲液：将8.4g碳酸氢钠、10.6g碳酸钠粉末溶于1000mL纯水中，此时PH值约8.0。

5、血清样本预处理：

去除血清中高丰度蛋白的层析柱Proteo Prep immunoaffinity Albumin andIgG Depletion Kit，购自Sigma公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天(中国)；PDMiniTrap G-25层析柱购自GE公司。

研发中，收集临床上28例胃腺癌患者手术前血清样本及10例正常人血清样本用于研发，所有血清分装并储存在-80℃以保持蛋白活性，避免反复冻融。

实施例1、分子自组装单层形成和探针固化

对金箔芯片进行清洗：将NH₃、H₂O₂及H₂O按体积比1：1：5混合构成TL1清洗液，放置不锈钢清洗盒内。将金箔芯片浸入盛有TL1清洗液的不锈钢清洗盒内，82℃水浴6分钟，取出之后用超纯水冲洗4次，再用无水乙醇浸泡清洗(3min/次×2次)、氮气吹干，干燥后置于干净密闭芯片盒中，保存待用。

对金箔芯片进行清洗后，浸入修饰液1中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，使16-氨基-1-十六烷硫醇通过Au-S键组装到金箔芯片，取出后用无水乙醇溶液清洗、氮气吹干，完成第一层修饰；在干燥的金箔芯片上每孔点样0.78μL修饰液2，然后置于干燥的孵育盒中室温下孵育12小时，取出后用DMSO溶液清洗、氮气吹干，完成第二层修饰；DOTA-NHS-ester修饰的芯片可保存数月。

固定探针前，再在金箔芯片上每孔点样0.84μL修饰液3，然后置于密闭的湿盒中室温下孵育0.5小时(使DOTA-NHS-ester末端的三个羧基活化，从而使其可通过酰胺反应稳定结合凝集素探针)，取出后用PBST缓冲液清洗、氮气吹干，即获得固相载体待用。

图1(a)为2.0μm视野下原子力显微镜观察未修饰金箔芯片(即清洗后的金箔芯片)的表面形貌，图1(b)为已修饰金箔芯片(即所得固相载体)的表面形貌。用Nanoscope分析软件可知DOTA-NHS-ester修饰的金表面比未修饰表面粗糙，表明修饰后化学基团共价连接到金表面上，且末端三个羧基活化后更易于蛋白质连接，扩大了信号，增加了检测灵敏度。

实施例2、质控实验

DOTA-NHS-ester孵育时在干燥的孵育盒中进行，其余所有步骤在湿盒中室温孵育，每一步骤结束后，未结合的物质都会用PBST溶液清洗两次，每次三分钟，并用氮气干燥芯片以便下一步孵育。

1、DOTA-NHS-ester修饰浓度质控

以下实验重复三次。

为了优化DOTA-NHS-ester包被浓度，将用DMSO稀释的浓度分别为20mM、10mM和5mM梯度的DOTA-NHS-ester溶液分别点样孵育于按照实施例1所获得的已完成第一层修饰的固相载体上(每孔点样0.78μL，每个浓度一横排)，然后置于干燥的孵育盒中室温孵育12h，取出后用DMSO溶液清洗、氮气吹干，使固相载体在16-氨基-1-十六烷硫醇的基础上完成第二层修饰。第二层修饰完成后再每孔点样0.84μL修饰液3，然后置于密闭的湿盒中室温下孵育0.5小时，使DOTA-NHS-ester末端的三个羧基活化，取出后用PBST缓冲液清洗、氮气吹干，获得一系列固相载体待用。

配制按照梯度稀释的(400mg/mL-0.19mg/mL)不同浓度的人IgG(含0.1％BSA)，每孔0.84μL点样加到各固相载体上，封口膜密封后，室温下湿盒孵育2h；将Cy3标记的驴抗人IgG抗体包被到上述点样孔，避光，湿盒室温孵育1h，然后用LuxscanTM 10K-A(博奥有限公司，中国)芯片仪对以上芯片进行扫描检测，结果显示于图2(a)。图2(b)是以图2(a)中每一排同一浓度DOTA-NHS-ester修饰后包被梯度IgG所得的荧光强度的平均值为纵坐标、以IgG抗原浓度为横坐标绘制的荧光强度曲线图。从图中可以看出，随着DOTA-NHS-ester修饰浓度降低，每组荧光值降低，同时由同一DOTA-NHS-ester浓度修饰的点样孔，随着IgG浓度的降低，荧光值也降低。当DOTA-NHS-ester浓度为20mM时，最高浓度的IgG荧光接近饱和，故DOTA-NHS-ester最佳修饰浓度应在10mM。

2、DOTA-NHS-ester修饰温度质控

以下实验相同条件重复三次。实施例1中第二层DOTA-NHS-ester表面化学修饰的步骤分别于25℃和37℃环境温度下进行，完成芯片修饰及活化后，获得两种固相载体。

将400mg/mL至0.19mg/mL梯度稀释的人IgG(含0.1％BSA)分别点样孵育于两种固相载体上(每点0.84μL)，封口膜密封后，室温下湿盒孵育2h；将Cy3标记的驴抗人IgG抗体包被到上述点样孔，避光，湿盒室温孵育1h；最后再用PBST溶液清洗、氮气吹干。通过芯片扫描仪LuxscanTM 10K-A(博奥有限公司，中国)对以上芯片进行扫描检测，结果显示于图3(a)。图3(b)是以图3(a)中不同实验温度下同一浓度所得荧光强度的平均值为纵坐标、以横排孔号为横坐标绘制的荧光强度曲线图。从图中可以看出，两者荧光值差别不大，而25℃更有益于实验操作，故选择25℃为最优环境温度。

实施例3、凝集素免疫特异性实验

为检测凝集素已确定包被于修饰完成的固相载体上，选择凝集素ConA及其抗体Cy3标记的兔抗-ConA作为实施例3的研究对象。

以HEPES缓冲液对凝集素进行稀释，并在稀释后凝集素溶液中加入BSA，使BSA质量浓度为0.001％。

将梯度稀释(2mg/mL-0.002mg/mL)的ConA(含0.001％BSA)溶液，每孔0.84μL，按照每列相同浓度点样于实施例1制备好的芯片上，置于湿盒内室温下孵育2小时后，用PBST缓冲液清洗、氮气吹干。将梯度稀释(1:1500-1:12000)后的Cy3标记的兔抗-ConA(含0.001％BSA)，按照每横排浓度相同点样，每孔0.84μL，室温下孵育1h，然后用PBST缓冲液清洗、氮气吹干，每孔设一个复孔；将Cy3标记的驴抗兔IgG抗体(1:200，含0.1％BSA)包被到上述点样孔，每孔0.84μL，避光，室温孵育1h，用PBST清洗芯片3min/次×2次，氮气风干。

通过芯片扫描仪LuxscanTM 10K-A(博奥有限公司，中国)对以上芯片进行扫描检测，结果显示于图4(a)。图4(b)是以ConA相同浓度下结合的Cy3标记的兔抗-ConA的荧光值为纵坐标，以ConA的浓度作为横坐标。结果显示随着ConA浓度的降低，荧光值逐步降低；同样随着Cy3标记的兔抗-ConA浓度的降低，荧光值逐步降低。结果说明凝集素ConA已包被在实施例1所建立的芯片平面上，并与Cy3标记的兔抗-ConA特异性结合。

实施例4、组合凝集素芯片检测胃腺癌患者血清中糖链

在实施例1构建的固相载体上，包被凝集素ConA、PNA、VVA、MAL-I、AAL、LTL、NPL、SNA、RCA-I、和AIL探针，浓度均为1mg/mL，每列包被同种凝集素，置于湿盒内室温下孵育2h，构建成组合凝集素芯片，PBST溶液清洗、氮气吹干后备用。

选取胃腺癌患者血清28例，正常人血清10例经预处理后点样于组合凝集素芯片上，置于湿盒内室温下避光孵育1h。同时在每列最后一孔以PBS代替血清作为空白对照。图5为7例胃癌血清、1例正常人血清检测结果。其荧光值经统计分析研究发现胃癌患者血清中糖链水平明显高于正常人群(P<0.05)；部分糖链与胃腺癌的组织学类型、肿瘤浸润、生存期密切相关(P<0.05)。

此结果说明，本发明的凝集素芯片适用于人类血清肿瘤学筛查及肿瘤患者肿瘤早期发现、治疗评价、复发或进展监控以及生存期预警。

以上仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用于人类血清十种糖链联合检测的凝集素芯片在制备胃癌血清样本检测试剂盒中的用途，其特征在于：所述凝集素芯片是在固相载体表面点阵固定有十种特异性凝集素探针，通过包被十种特异性凝集素以实现人血清中十种糖链的联合检测；

所述固相载体为16-氨基-1-十六烷硫醇和DOTA-NHS-ester化学修饰的金箔芯片，且DOTA-NHS-ester末端的三个羧基用EDC和NHS活化，以固定特异性凝集素为探针；

所述十种特异性凝集素探针为ConA、PNA、VVA、MAL-I、AAL、LTL、NPL、SNA、RCA-I、和AIL，分别对应于人类血清中的糖链α-Man、α-Glc、Galβ3GalNAc(T抗原)、GalNAc(Tn抗原)、Galβ4GlcNAc、Fucα6GlcNAc、α-Fuc、Neu5Acα6Gal、Gal和Galβ3GalNAc(sTn抗原)。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述凝集素芯片的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、对金箔芯片进行表面化学修饰，获得固相载体

以浓度为0.8mM的16-氨基-1-十六烷硫醇的乙醇溶液为修饰液1；以浓度为10mM的DOTA-NHS-ester的DMSO溶液为修饰液2；将NHS和EDS溶于0.1M、pH＝3.5的MES缓冲液中作为修饰液3，在所述修饰液3中NHS浓度为50mM、EDC浓度为200mM；

对金箔芯片进行清洗后，浸入所述修饰液1中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，使16-氨基-1-十六烷硫醇通过Au-S键组装到金箔芯片，取出后用无水乙醇溶液清洗、氮气吹干，完成第一层修饰；在干燥的金箔芯片上每孔点样0.78μL修饰液2，然后置于干燥的孵育盒中室温下孵育12小时，取出后用DMSO溶液清洗、氮气吹干，完成第二层修饰；

在进行步骤2的固定探针前，再在金箔芯片上每孔点样0.84μL修饰液3，然后置于密闭的湿盒中室温下孵育0.5小时，使DOTA-NHS-ester末端的三个羧基活化，从而使其可通过酰胺反应稳定结合凝集素探针，取出后用PBST缓冲液清洗、氮气吹干，即获得固相载体待用；

步骤2、固定十种特异性凝集素作为探针

称取HEPES粉末0.2383g和无水氯化钙0.0011g溶于100mL纯水中，调节pH值至8.5，获得HEPES缓冲液；然后将十种凝集素分别溶于所述HEPES缓冲液中，并使各凝集素的终浓度为1mg/mL，获得相应的凝集素溶液；在各凝集素溶液中加入BSA，使BSA质量浓度为0.001％，用于封闭未结合的已活化的羧基，以进一步有效避免实验的非特异性吸附；

将各凝集素溶液点样于步骤1获得的固相载体上，在第1～10列的每一纵列中点样一种凝集素溶液，并在第11列再点样ConA溶液作为空白对照，每孔0.84μL，然后置于湿盒中室温下孵育2小时，取出用PBST缓冲液清洗、氮气吹干，即获得用于人类血清十种糖链联合检测的凝集素芯片；

所述PBST缓冲液是由浓度0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲液与Tween20混合配置而成的，在所述PBST缓冲液中Tween20的体积浓度为0.1％。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：步骤1对金箔芯片进行清洗的方法为：将NH₃、H₂O₂及H₂O按体积比1：1：5混合构成TL1清洗液，将金箔芯片浸入盛有TL1清洗液的不锈钢清洗盒内，82℃水浴6分钟，取出之后用超纯水冲洗，再用无水乙醇清洗、氮气吹干。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒内包含有：权利要求1中所述的凝集素芯片；浓度0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲液；PBST缓冲液；0.1M碳酸氢钠缓冲液；Cy3溶液；去除血清中高丰度蛋白的层析柱；BCA蛋白浓度测定试剂盒；G-25层析柱；

所述PBST缓冲液是由浓度0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲液与Tween20混合配置而成的，在所述PBST缓冲液中Tween20的体积浓度为0.1％；

所述0.1M碳酸氢钠缓冲液是在100mL去离子水中加入碳酸钠1.06g和碳酸氢钠0.84g，然后调pH值至8.0获得；

所述Cy3溶液是由1mg Cy3 NHS溶于50μL DMSO中获得。

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