CN112129948A - 异常糖链糖蛋白检测试剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种异常糖链糖蛋白检测试剂及其制备方法。所述检测试剂以纯化水为溶剂，检测试剂中各组分的含量如下：混合凝集素10‑50mg/L，分散蓝1‑3g/L，二价金属离子稳定剂4‑20mg/L，所述检测试剂通过pH调节剂调至pH≥9.0；所述混合凝集素为刀豆凝集素、曼陀罗凝集素、小扁豆凝集素、麦胚凝集素、E型红腰豆凝集素、L型红腰豆凝集素、桔果粉孢凝集素、花生凝集素、蓖麻凝集素I和朝鲜槐凝集素的混合物，所述混合凝集素经由PEG预修饰处理。本发明的设计原理为：通过混合凝集素，将血液中的异常糖链糖蛋白凝聚成颗粒物，其中分散蓝参与凝聚反应，作为颜色标记物，便于凝聚物颗粒的观察和鉴别。

Description

异常糖链糖蛋白检测试剂及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种异常糖链糖蛋白检测试剂及其制备方法。

背景技术

蛋白质糖基化作为一种重要的翻译后修饰，对蛋白质结构和功能起着重要的作用，已发现在哺乳动物细胞中，约50％的蛋白有糖基化发生，这种修饰在细胞识别、粘附、细胞间相互作用和生长发育等许多细胞功能中发挥关键作用。

异常糖链糖蛋白主要由糖基化不完全或新的糖基转移酶被激活而产生新的糖基化引起，大量研究表明异常糖链糖蛋白的产生与肿瘤关系密切，如恶性肿瘤患者甲胎蛋白、转铁蛋白、碱性磷酸酶、r-谷氨酰转移酶、人绒毛膜促性腺激素、T抗原、a1抗胰蛋白酶及前列腺酸性磷酸酶等糖链结构发生改变，达到一定程度后，此类物质向血液排放，并较多地存在于外周血液种。

凝集素是一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白。它具有能与糖蛋白专一性、非共价可逆结合的特点。凝集素对糖蛋白的结合强度可随分子相互作用的数目增加，凝集素对糖蛋白的结合解离常数为约Kd10^-5～10^-7。

现有技术中，已经存在利用异常糖链糖蛋白与不同植物凝集素的亲和性，用于各种类型的肿瘤的诊断。但现有技术存在如下缺陷：

其一，异常糖链糖蛋白检测试剂的稳定性问题存在缺陷，保质期一般6个月，保藏成本较高；

其二，凝集素的配伍不合理，无法有效的兼顾广谱性与准确性；

其三，复合凝集素未做有效的预处理，其稳定性存在不足，影响试剂检测的可靠性；

其四，复合凝集素的抗蛋白水解能力也需要进一步通过预处理的方式改善。

发明内容

本发明的目的之一在于解决现有技术的不足 ，提供一种新的异常糖链糖蛋白检测试剂，该试剂采用了特定复配的凝集素，能够有效的兼顾广谱性和准确性，另外，复配的凝集素采用预处理，稳定性显著的改善，制备的检测试剂可靠性好，而且预处理后的凝集素抗蛋白水解能力也显著提高。

本发明的目的之二在于解决现有技术的不足，提高一种异常糖链糖蛋白检测试剂的制备方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案如下：

异常糖链糖蛋白检测试剂，所述检测试剂以纯化水为溶剂，检测试剂中各组分的含量如下：混合凝集素10-50mg/L，分散蓝1-3g/L，二价金属离子稳定剂 4-20mg/L，所述检测试剂通过pH调节剂调至pH≥9.0；

所述混合凝集素为刀豆凝集素、曼陀罗凝集素、小扁豆凝集素、麦胚凝集素、E型红腰豆凝集素、L型红腰豆凝集素、桔果粉孢凝集素、花生凝集素、蓖麻凝集素I和朝鲜槐凝集素的混合物，所述混合凝集素经由PEG预修饰处理。

本发明的设计原理为：通过混合凝集素，将血液中的异常糖链糖蛋白凝聚成颗粒物，其中分散蓝参与凝聚反应，作为颜色标记物，便于凝聚物颗粒的观察和鉴别，本申请的发明人通过实践发现，添加一定量的二价金属离子，其能促进保持凝集素的活性和结构，能显著提高检测试剂的稳定性。

关于二价金属离子的添加，保持凝集素的活性和结构的作用机理，申请人进一步探究发现：检测试剂中的混合凝集素在储存中，微观上存在逐步聚集的倾向，聚集形成的团类似囊泡状，二价金属离子的添加，可以大大的降低囊泡的半径，延迟大范围聚集的时间，但不会破坏混合凝集素的活性，也不会破坏混合凝集素固有的结构。实现混合凝集素低半径的聚集，相当于提高了混合凝集素的分散稳定性。

本发明中，混合凝集素使用前要使用PEG进行修饰，以增强其稳定性，使其抵抗蛋白酶水解的能力提高，利于形成均一的、特异性的颗粒物。

进一步的，检测试剂中各组分的含量如下：混合凝集素30mg/L，分散蓝2g/L，二价金属离子稳定剂 10mg/L。此优选方案下，检测试剂的成本、检测性能和稳定性指标更佳。

进一步的，所述二价金属离子稳定剂为锌离子和镁离子，二者含量之比为1:1，锌离子来源于氯化锌，镁离子来源于氯化镁。申请人实验了锌离子、镁离子、钙离子、铜离子等二价金属离子，发现锌离子和镁离子效果最好，尤其是当二者以等比例量使用时，能最大限度的降低囊泡的半径，最大程度的延迟大范围聚集的时间，对混合凝集素的活性和固有的结构保持的最好。

进一步的，所述检测试剂通过pH调节剂调至pH为11.0±0.5。

进一步的，所述混合凝集素中，刀豆凝集素、曼陀罗凝集素和小扁豆凝集素的质量比为1:1:1；麦胚凝集素、E型红腰豆凝集素和L型红腰豆凝集素的质量比为4:1:1，花生凝集素、蓖麻凝集素I和朝鲜槐凝集素的质量比为2:1:1。

此种方案下，凝集素的配伍最合理，能有效的兼顾广谱性与准确性。

进一步的，混合凝集素的PEG预修饰处理的步骤如下：

S1：将碳二亚胺、甲氧基聚乙二醇活性酯和混合凝集素混合，在室温反应2-6h；

S2：使用葡聚糖凝胶SwphadexG-50分离步骤S1的反应体系中的目标产物，获取第一段峰的物质，获得目标产物，即为PEG预修饰后的混合凝集素。

进一步的，碳二亚胺、甲氧基聚乙二醇活性酯和混合凝集素的质量比为1:100:1。

过柱参数：

使用葡聚糖凝胶Sephadex G-50分离目标产物，可见3～4个产物峰，第一段峰为目标产物。

1、 凝胶使用前浸入10倍体积的纯化水中，沸水浴溶胀3小时以上；

2、 待凝胶自然沉降后去除上层水，并再次加入纯化水清洗，清洗后去除上层水；

3、 湿法装柱，使用纯化水平衡15分钟，流速2.0ml/min；

4 、调节流速至0.5ml/min，加入待分离溶液进行分离

5、 每5ml收集1管，在278nm处测定吸光度值（纯化水为参比），绘制吸光度值曲线，取第一个产物峰的管混合即为目标产物。

进一步的，所述pH调节剂采用氢氧化钠。

一种异常糖链糖蛋白检测试剂的制备方法，所述制备方法步骤如下：

S1：准确称取配方量的分散蓝和二价金属离子盐，投入配制容器中，加入部分配方量的纯化水，搅拌1-3小时；

S2：调节步骤S1溶液pH至9.0以上，补齐余下的纯化水，搅拌混匀，得到均匀的分散液，分散液静置6小时以上；

S3：采用孔径8-12微米的过滤器过滤步骤S2的分散液，滤液中加入配方量的PEG预修饰后的混合凝集素，混匀即可，获得异常糖链糖蛋白检测试剂。

进一步的，所述制备方法步骤如下：

S1：准确称取配方量的分散蓝和二价金属离子盐，投入配制容器中，加入80%配方量的纯化水，搅拌2小时；

S2：调节步骤S1溶液pH至11，补齐余下20%的纯化水，搅拌混匀，得到均匀的分散液，分散液静置6小时以上；

S3：采用孔径10微米的过滤器过滤步骤S2的分散液，滤液中加入配方量的PEG预修饰后的混合凝集素，混匀即可，获得异常糖链糖蛋白检测试剂。

本发明异常糖链糖蛋白检测试剂的使用方法如下：

采集全血，制备获得新鲜的干燥全血涂片，滴加本发明的异常糖链糖蛋白检测试剂，涂布均匀，混合凝集素会将异常糖链糖蛋白凝聚成特征性的颗粒物，静置干燥后使用显微镜观察即可定性判别异常糖链糖蛋白的含量。

本发明有以下有益效果：

1、通过二价金属阳离子稳定剂的添加，异常糖链糖蛋白检测试剂的稳定性大大提高，保质期可延长6个月，达到2年的高标准；

2、凝集素的配伍合理，有效的兼顾广谱性与准确性；

3、混合凝集素通过一系列的步骤的预处理，其稳定性得到改善，试剂检测的可靠性有保障；

4、混合凝集素的抗蛋白水解能力也通过预处理，得到了改善。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中所需要的试剂、原料均系市购。

实施例1

异常糖链糖蛋白检测试剂，所述检测试剂以纯化水为溶剂，检测试剂中各组分的含量如下：混合凝集素10mg/L，分散蓝1g/L，二价金属离子稳定剂 4mg/L，所述检测试剂通过pH调节剂调至pH9.0；

所述混合凝集素为刀豆凝集素、曼陀罗凝集素、小扁豆凝集素、麦胚凝集素、E型红腰豆凝集素、L型红腰豆凝集素、桔果粉孢凝集素、花生凝集素、蓖麻凝集素I和朝鲜槐凝集素的混合物，所述混合凝集素经由PEG预修饰处理。

所述混合凝集素中，刀豆凝集素、曼陀罗凝集素和小扁豆凝集素的质量比为1:1:1；麦胚凝集素、E型红腰豆凝集素和L型红腰豆凝集素的质量比为4:1:1，花生凝集素、蓖麻凝集素I和朝鲜槐凝集素的质量比为2:1:1。

混合凝集素的PEG预修饰处理的步骤如下：

S1：将碳二亚胺、甲氧基聚乙二醇活性酯和混合凝集素混合，在室温反应2h；

S2：使用葡聚糖凝胶SwphadexG-50分离步骤S1的反应体系中的目标产物，获取第一段峰的物质，获得目标产物，即为PEG预修饰后的混合凝集素。

碳二亚胺、甲氧基聚乙二醇活性酯和混合凝集素的质量比为1:100:1，所述pH调节剂采用氢氧化钠。

实施例1的异常糖链糖蛋白检测试剂的制备方法，所述制备方法步骤如下：

S1：准确称取配方量的分散蓝和二价金属离子盐，投入配制容器中，加入部分配方量的纯化水，搅拌1小时；

S2：调节步骤S1溶液pH至9.0，补齐余下的纯化水，搅拌混匀，得到均匀的分散液，分散液静置6小时以上；

S3：采用孔径8微米的过滤器过滤步骤S2的分散液，滤液中加入配方量的PEG预修饰后的混合凝集素，混匀即可，获得异常糖链糖蛋白检测试剂。

实施例2

异常糖链糖蛋白检测试剂，所述检测试剂以纯化水为溶剂，检测试剂中各组分的含量如下：混合凝集素50mg/L，分散蓝3g/L，二价金属离子稳定剂 20mg/L，所述检测试剂通过pH调节剂调至pH10.0；

所述混合凝集素为刀豆凝集素、曼陀罗凝集素、小扁豆凝集素、麦胚凝集素、E型红腰豆凝集素、L型红腰豆凝集素、桔果粉孢凝集素、花生凝集素、蓖麻凝集素I和朝鲜槐凝集素的混合物，所述混合凝集素经由PEG预修饰处理。

所述混合凝集素中，刀豆凝集素、曼陀罗凝集素和小扁豆凝集素的质量比为1:1:1；麦胚凝集素、E型红腰豆凝集素和L型红腰豆凝集素的质量比为4:1:1，花生凝集素、蓖麻凝集素I和朝鲜槐凝集素的质量比为2:1:1。

混合凝集素的PEG预修饰处理的步骤如下：

S1：将碳二亚胺、甲氧基聚乙二醇活性酯和混合凝集素混合，在室温反应6h；

S2：使用葡聚糖凝胶SwphadexG-50分离步骤S1的反应体系中的目标产物，获取第一段峰的物质，获得目标产物，即为PEG预修饰后的混合凝集素。

碳二亚胺、甲氧基聚乙二醇活性酯和混合凝集素的质量比为1:100:1，所述pH调节剂采用氢氧化钠。

实施例2的异常糖链糖蛋白检测试剂的制备方法，所述制备方法步骤如下：

S1：准确称取配方量的分散蓝和二价金属离子盐，投入配制容器中，加入部分配方量的纯化水，搅拌3小时；

S2：调节步骤S1溶液pH至10.0，补齐余下的纯化水，搅拌混匀，得到均匀的分散液，分散液静置6小时以上；

S3：采用孔径12微米的过滤器过滤步骤S2的分散液，滤液中加入配方量的PEG预修饰后的混合凝集素，混匀即可，获得异常糖链糖蛋白检测试剂。

实施例3

异常糖链糖蛋白检测试剂，所述检测试剂以纯化水为溶剂，检测试剂中各组分的含量如下：混合凝集素30mg/L，分散蓝2g/L，二价金属离子稳定剂 10mg/L，所述检测试剂通过pH调节剂调至pH11.0；

所述混合凝集素为刀豆凝集素、曼陀罗凝集素、小扁豆凝集素、麦胚凝集素、E型红腰豆凝集素、L型红腰豆凝集素、桔果粉孢凝集素、花生凝集素、蓖麻凝集素I和朝鲜槐凝集素的混合物，所述混合凝集素经由PEG预修饰处理。

所述混合凝集素中，刀豆凝集素、曼陀罗凝集素和小扁豆凝集素的质量比为1:1:1；麦胚凝集素、E型红腰豆凝集素和L型红腰豆凝集素的质量比为4:1:1，花生凝集素、蓖麻凝集素I和朝鲜槐凝集素的质量比为2:1:1。

混合凝集素的PEG预修饰处理的步骤如下：

S1：将碳二亚胺、甲氧基聚乙二醇活性酯和混合凝集素混合，在室温反应4h；

S2：使用葡聚糖凝胶SwphadexG-50分离步骤S1的反应体系中的目标产物，获取第一段峰的物质，获得目标产物，即为PEG预修饰后的混合凝集素。

进一步的，碳二亚胺、甲氧基聚乙二醇活性酯和混合凝集素的质量比为1:100:1，所述pH调节剂采用氢氧化钠。

实施例3异常糖链糖蛋白检测试剂的制备方法，所述制备方法步骤如下：

S1：准确称取配方量的分散蓝和二价金属离子盐，投入配制容器中，加入80%配方量的纯化水，搅拌2小时；

S2：调节步骤S1溶液pH至11，补齐余下20%的纯化水，搅拌混匀，得到均匀的分散液，分散液静置6小时以上；

S3：采用孔径10微米的过滤器过滤步骤S2的分散液，滤液中加入配方量的PEG预修饰后的混合凝集素，混匀即可，获得异常糖链糖蛋白检测试剂。

对比例1

异常糖链糖蛋白检测试剂的组成基本同实施例3，不同之处在于混合凝集素未做PEG预修饰处理。

对比例2：

异常糖链糖蛋白检测试剂的组成基本同实施例3，不同之处在于未添加二价金属阳离子稳定剂。

1、实施例1-3与对比例1-2的异常糖链糖蛋白检测试剂的性能测试结果如下：

1.1稳定性实验

第0月、6月、12月、18月、24月、30月，检测pH值、近紫外吸收光谱分析、阴阳性符合率以及重复性分析，6个月以后 ，实施例1-3的各项指标均优于对比例1-2，尤其是阴阳性符合率以及重复性性能优越。

1.2抗酶解实验

取6支10ml离心管加入适量标准蛋白质母液，定容至10ml，混匀，制得质量浓度分别0、10ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、250ug/ml的蛋白质标准溶液。置于279nm波长处测定其吸光度。以蛋白质质量浓度为横坐标，对应吸光度（A₂₇₉）值为纵坐标，绘制出蛋白质标准曲线。

将配置好的异常糖链糖蛋白检测试剂（修饰过的凝集素）作为样品（必要时将样品稀释一定倍数后取稀释液），取2.5ml样品于3支10ml离心管中，加入0.01mg/ml胰蛋白酶100ul，定容至10ml。室温放置5min，10min，30min。以未作修饰的凝集素配制的异常糖链糖蛋白检测试剂作为对照组，处理同上。置于279nm波长下测定其吸光度（A₂₇₉）。带入标准曲线测定蛋白质浓度。

测试结果表明，实施例1-3的蛋白浓度在正常范围内，且岁时间的推移，浓度变化较小，而对比例的蛋白浓度，随着时间的推移，浓度下降较快，受胰蛋白酶的影响较大。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而 且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发 明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性 的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要 求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的 任何标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (10)

1.异常糖链糖蛋白检测试剂，其特征在于，所述检测试剂以纯化水为溶剂，检测试剂中各组分的含量如下：混合凝集素10-50mg/L，分散蓝1-3g/L，二价金属阳离子稳定剂 4-20mg/L，所述检测试剂通过pH调节剂调至pH≥9.0；

所述混合凝集素为刀豆凝集素、曼陀罗凝集素、小扁豆凝集素、麦胚凝集素、E型红腰豆凝集素、L型红腰豆凝集素、桔果粉孢凝集素、花生凝集素、蓖麻凝集素I和朝鲜槐凝集素的混合物，所述混合凝集素经由PEG预修饰处理。

2.根据权利要求1所述的异常糖链糖蛋白检测试剂，其特征在于，检测试剂中各组分的含量如下：混合凝集素30mg/L，分散蓝2g/L，二价金属离子稳定剂 10mg/L。

3.根据权利要求1或2所述的异常糖链糖蛋白检测试剂，其特征在于，所述二价金属阳离子稳定剂为锌离子和镁离子，二者含量之比为1:1，锌离子来源于氯化锌，镁离子来源于氯化镁。

4.根据权利要求1或2所述的异常糖链糖蛋白检测试剂，其特征在于，所述检测试剂通过pH调节剂调至pH为11.0±0.5。

5.根据权利要求1所述的异常糖链糖蛋白检测试剂，其特征在于，所述混合凝集素中，刀豆凝集素、曼陀罗凝集素和小扁豆凝集素的质量比为1:1:1；麦胚凝集素、E型红腰豆凝集素和L型红腰豆凝集素的质量比为4:1:1，花生凝集素、蓖麻凝集素I和朝鲜槐凝集素的质量比为2:1:1。

6.根据权利要求1所述的异常糖链糖蛋白检测试剂，其特征在于，混合凝集素的PEG预修饰处理的步骤如下：

S1：将碳二亚胺、甲氧基聚乙二醇活性酯和混合凝集素混合，在室温反应2-6h；

S2：使用葡聚糖凝胶SwphadexG-50分离步骤S1的反应体系中的目标产物，获取第一段峰的物质，获得目标产物，即为PEG预修饰后的混合凝集素。

7.根据权利要求6所述的异常糖链糖蛋白检测试剂，其特征在于，碳二亚胺、甲氧基聚乙二醇活性酯和混合凝集素的质量比为1:100:1。

8.根据权利要求1所述的异常糖链糖蛋白检测试剂，其特征在于，所述pH调节剂采用氢氧化钠。

9.一种权利要求1-8任意一项所述异常糖链糖蛋白检测试剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤如下：

S1：准确称取配方量的分散蓝和二价金属离子盐，投入配制容器中，加入部分配方量的纯化水，搅拌1-3小时；

S2：调节步骤S1溶液pH至9.0以上，补齐余下的纯化水，搅拌混匀，得到均匀的分散液，分散液静置6小时以上；

S3：采用孔径8-12微米的过滤器过滤步骤S2的分散液，滤液中加入配方量的PEG预修饰后的混合凝集素，混匀即可，获得异常糖链糖蛋白检测试剂。

10.根据权利要求9所述的异常糖链糖蛋白检测试剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤如下：

S1：准确称取配方量的分散蓝和二价金属离子盐，投入配制容器中，加入80%配方量的纯化水，搅拌2小时；

S2：调节步骤S1溶液pH至11，补齐余下20%的纯化水，搅拌混匀，得到均匀的分散液，分散液静置6小时以上；

S3：采用孔径10微米的过滤器过滤步骤S2的分散液，滤液中加入配方量的PEG预修饰后的混合凝集素，混匀即可，获得异常糖链糖蛋白检测试剂。