CN115656526A

CN115656526A - 糖化血红蛋白质控品的制备方法、复溶装置和复溶剂

Info

Publication number: CN115656526A
Application number: CN202211655494.8A
Authority: CN
Inventors: 杨宗兵; 王军
Original assignee: Beijing Shuimujiheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Shuimujiheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-22
Filing date: 2022-12-22
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2042-12-22
Also published as: CN115656526B

Abstract

糖化血红蛋白质控品的制备方法、复溶装置和复溶剂，属于医学检验技术领域。本发明将糖化血红蛋白质控品冻干粉和复溶剂分别存放在复溶装置的冻干粉瓶和复溶剂瓶内，冻干粉和复溶剂的比例可根据所配置的溶液浓度调节，并可将复溶装置按照不同浓度做成不同规格；复溶装置内的冻干粉和复溶剂可常温长期储存，无需冷链运输和保存。复溶时，操作者只需移除阻隔装置将冻干粉和复溶剂混匀即可，无需专门的操作工具，也无需专业操作技能，最大限度地避免了复溶过程中的各种客观或者主观影响因素，使复溶得到的糖化血红蛋白质控品溶液均匀性得到充分保证。复溶后的糖化血红蛋白质控品溶液状态稳定，不起泡，不沉淀，可持续使用14天以上。

Description

糖化血红蛋白质控品的制备方法、复溶装置和复溶剂

技术领域

本发明属于医学检验技术领域，涉及糖化血红蛋白质控品的制备方法、复溶装置和复溶剂。

背景技术

糖化血红蛋白(Glycated hemoglobin GHb)，可以反映过去三个月平均的血糖控制水平，在临床上已经作为评估长期血糖控制状况的金标准，也是临床决定是否需要调整降糖治疗的重要依据。糖化血红蛋白是红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类相结合的产物，包括HBA1a、HbA1b、HbA1c，其中HbA1c约占70％。GHb是通过缓慢、持续及不可逆的糖化反应形成，其含量的多少取决于血糖浓度以及血糖与血红蛋白接触时间，而与抽血时间、患者是否空腹、是否使用胰岛素等因素无关。

测定糖化血红蛋白含量的方法按照理化性质不同，可以分为两大类：一类是基于糖化与非糖化所带电荷不同，如电泳法、离子交换色谱法；另一类是基于糖化与非糖化血红蛋白的结构不同，如亲和层析法、免疫法和酶法等。目前最常用的HbA1c测定方法是离子交换层析法和胶乳免免疫比浊法。美国早已实行了糖化血红蛋白检测的标准化，统一采用高压液相色谱法（HPLC法）检测糖化血红蛋白，美国糖尿病协会（ADA）已将HbA1c作为诊断糖尿病的新指标。

公布号为CN113959807A的中国发明申请，公开了一种糖化血红蛋白校准质控品的制备方法，利用新鲜猪血作为制备血红蛋白校准质控品的材料，通过清洗、糖基化反应、透析纯化制备得到高值质控品，并利用配置的处理液获得百分含量为5％、12％的校准品和6％、10％的质控品，一次性直接获得覆盖正常测试范围及异常测试范围的校准质控品。

公布号为CN114755085A的中国发明申请，公开了一种糖化血红蛋白质控品的制备及其应用，首先制备得到两种浓度糖化血红蛋白浓缩液，然后将两种浓度的糖化血红蛋白浓缩液稀释后按照特定比例混合制备得到高值糖化血红蛋白质控品溶液和低值糖化血红蛋白质控品溶液；最后通过添加特定比例的甘露醇和聚乙二醇6000制备得到高值糖化血红蛋白质控品冻干粉和低值糖化血红蛋白质控品冻干粉。

糖化血红蛋白质控品其作用是评估体检测系统在检测过程中的稳定性，与质控品靶值偏倚程度。糖化血红蛋白质控品必须覆盖正常测试范围及异常测试范围，对于GHb非糖尿病病人的测试结果一般在4％-6.5％，糖尿病病人的测试结果一般在6.5％-14％。所以糖化血红蛋白质控品的范围，低水平在4％-6.5％，高水平在8％-11％，覆盖正常值和异常值。同时，糖化血红蛋白质控品的均匀性（冻干粉剂型）和稳定性（液体剂型）对于室内质量控制是关键指标。

现有技术的糖化血红蛋白质控品冻干粉剂型可以常温保存，无需冷链运输，但在复溶过程中常常由于各种客观或者主观因素，导致复溶后的糖化血红蛋白质控品溶液浓度产生误差，影响糖化血红蛋白质控品的均匀性。现有技术的糖化血红蛋白质控品液体剂型，无需复溶，但是需要冷链运输和保存，稳定性往往难以满足要求。

发明内容

本发明针对现有技术糖化血红蛋白质控品冻干粉剂型均匀性和液体剂型稳定性存在的问题，提供糖化血红蛋白质控品的制备方法、复溶装置和复溶液，制备的糖化血红蛋白质控品冻干粉可以非常简便地实现复溶操作，复溶得到的糖化血红蛋白质控品溶液均匀性好，状态稳定，不起泡，不沉淀，可持续使用14天以上，可应用于糖化血红蛋白测定系统的室内质量控制。本发明的具体技术方案如下。

糖化血红蛋白质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：以人全血或动物全血为原料，用清洗液洗涤，然后离心处理，得到红细胞；

S2：用细胞破碎液对步骤S1得到的红细胞进行破碎处理；

S3：离心处理去掉杂质，得到纯净的血红蛋白溶液；

S4：向步骤S3得到的血红蛋白溶液中加入糖基化液进行反应，得到糖基化的血红蛋白溶液；

S5：透析步骤S4得到的糖基化的血红蛋白溶液，去掉杂质，得到高值糖化血红蛋白溶液；

S6：将步骤S5得到的高值糖化血红蛋白溶液和步骤S3得到的血红蛋白溶液按比例混合，得到所需浓度的糖化血红蛋白溶液；

S7：向步骤S6得到的糖化血红蛋白溶液中加入冻干保护剂（同时也是赋形剂）和防腐剂，进行冻干处理，得到糖化血红蛋白质控品冻干粉；

S8：将步骤S7得到的冻干粉装入复溶装置的冻干粉瓶内，复溶装置包括冻干粉瓶和复溶剂瓶，复溶剂瓶内装有复溶剂，冻干粉瓶和复溶剂瓶由可移除的阻隔装置隔离；

S9：需要复溶时，移除步骤S8复溶装置中的阻隔装置，使冻干粉和复溶剂混匀，得到糖化血红蛋白质控品溶液。

本发明提供的糖化血红蛋白质控品的制备方法，通过将糖化血红蛋白质控品冻干粉和复溶剂分别存放在复溶装置的冻干粉瓶和复溶剂瓶内，冻干粉和复溶剂的比例可以根据所配置的溶液浓度调节，并可将复溶装置按照不同浓度做成不同规格；复溶装置内的冻干粉和复溶剂可以常温长期储存，无需冷链运输和保存。复溶时，操作者只需移除阻隔装置将冻干粉和复溶剂混匀即可，无需专门的操作工具（例如移液枪），也无需专业操作技能，最大限度地避免了复溶过程中的各种客观或者主观影响因素，使复溶得到的糖化血红蛋白质控品溶液均匀性得到充分保证。

在一些具体实施方案中，步骤S1中的清洗液的成分包括8-10g/L的NaCl和0.1-2％的防腐剂。

在一些具体实施方案中，步骤S2中细胞破碎液与红细胞的比例为1∶（10-100），破碎处理温度为2-8℃，破碎处理时间为18-24h。

在一些具体实施方案中，步骤S4中反应温度为25-42℃，反应时间为1-7天。

在一些具体实施方案中，步骤S4中糖基化液的成分包括5%-30%葡萄糖和0.1-2％防腐剂。

在一些具体实施方案中，步骤S5中透析的具体方法为：将步骤S4得到的糖基化的血红蛋白溶液装入透析袋中，透析处理除去葡萄糖，反应时间为24-48h；糖基化的血红蛋白溶液和透析液的比例为1∶（1-10）。

在一些具体实施方案中，步骤S6中的冻干保护剂包括：甘油、海藻糖、牛血清白蛋白（BSA）、山梨糖醇、蔗糖、甘露醇中的一种或几种，添加浓度为1-20%。

应用于上述制备方法的复溶装置，其特征在于，包括冻干粉瓶和复溶剂瓶，冻干粉瓶包括冻干粉瓶瓶体和冻干粉瓶瓶盖，复溶剂瓶包括复溶剂瓶瓶体、复溶剂瓶瓶嘴和复溶剂瓶瓶盖，复溶剂瓶瓶体的材质为可挤压的材料，冻干粉瓶和复溶剂瓶由可移除的阻隔装置隔离。开启冻干粉瓶瓶盖，装入冻干粉，然后密闭冻干粉瓶瓶盖；开启复溶剂瓶瓶盖，按所需比例装入复溶剂，然后密闭复溶剂瓶瓶盖。装有冻干粉和复溶剂的复溶装置可以在常温下运输和长期储存，需要复溶时，移除阻隔装置，使冻干粉和复溶剂混匀。开启复溶剂瓶瓶盖，挤压复溶剂瓶瓶体，糖化血红蛋白质控品溶液即可从复溶剂瓶瓶嘴流出。

在一些具体实施方案中，所述可移除的阻隔装置为旋钮和隔膜，旋钮一部分位于冻干粉瓶，另一部分位于复溶剂瓶内，隔膜位于旋钮两部分之间；所述复溶剂瓶瓶体的材质为聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯中的任意一种。需要移除阻隔装置时，使旋钮两部分向相反方向旋转，破坏隔膜，冻干粉瓶和复溶剂瓶实现连通。

应用于上述制备方法的复溶剂，其特征在于，复溶剂由以下组分构成：二甲基硅油0.1-1‰、氯化钠0.8-1.0％、聚乙二醇1-5‰、羟甲纤维素钠0.1-1％、壳聚糖0.5-5‰、乳酸钠0.5-5％、灰黄霉素0.3-0.8g/L、链霉素2-10万单位/L、青霉素2-10万单位/L、庆大霉素2-6万单位/L、纯化水余量。

本发明中除另有说明的以外，比例、百分比、千分比均以质量为基准。

本发明具有以下有益技术效果：本发明得到的糖化血红蛋白质控品冻干粉可以在常温下运输和长期储存，无需冷链条件；复溶装置可以按照不同浓度做成不同规格，方便使用；复溶时，操作者只需移除阻隔装置将冻干粉和复溶剂混匀即可，无需专门的操作工具，也无需专业操作技能，最大限度地避免了复溶过程中的各种客观或者主观影响因素，使复溶得到的糖化血红蛋白质控品溶液均匀性得到充分保证；复溶后的糖化血红蛋白质控品溶液状态稳定，不起泡，不沉淀，可持续使用14天以上。

附图说明

图1是本发明提供的复溶装置结构示意图。

1-复溶剂瓶瓶盖，2-复溶剂瓶瓶嘴，3-复溶剂瓶瓶体，4-隔膜，5-冻干粉瓶瓶体，6-冻干粉瓶瓶盖，7-旋钮。

具体实施方式

下面结合说明书附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明的保护范围。

实施例1

本发明对于人血原材料的基本要求为抗凝后的人血浆，将以下组份按比例加入到人血浆中：EDTA2K 0.1‰、氟化钠0.1‰、羟甲纤维素钠0.5％、壳聚糖1%。

将人全血离心后得到人全血的红细胞，然后进行以下操作：

S1：对人全血的红细胞进行洗涤，用9g/L氯化钠溶液清洗红细胞，2000-3000rpm离心15min，弃掉上清液，重复三次以上操作，保留红细胞。

S2：用纯化水浸泡处理进行细胞壁破碎，红细胞与纯化水的比例为1:50，2-8℃环境静置24h，使得红细胞完全破裂，待进行下一步处理。

S3：红细胞破碎后的溶液，8000rpm离心30min，保留上清红色溶液，去掉沉淀杂质，获得纯净的血红蛋白溶液。

S4：向S3溶液中加入20%葡萄糖和0.1%防腐剂叠氮钠，放置于恒温摇床，反应温度为37℃，转速150-200rpm，反应时间72h，进行糖基化反应。

S5：检测糖基化后的糖化血红蛋白（HbA1C）浓度，HbA1C浓度达到11%-15%，停止糖基化反应，准备进行透析处理。使用已处理好的透析袋，装入糖基化的血红蛋白溶液，放入纯化水容器中，血红蛋白溶液与纯化水的比例约1∶50，磁力搅拌器搅拌进行透析。每隔4h换一次水，透析处理48h，去掉多余的葡萄糖等杂质。

S6：将S5制备的高值糖化血红蛋白溶液和和S3制备的血红蛋白溶液按一定比例混合，制备成所需浓度的糖化血红蛋白溶液。

S7：向S6制备的糖化血红蛋白溶液中加入冻干保护剂、防腐剂：蔗糖12%、叠氮钠0.1%，使用过滤器进行过滤，滤膜孔径0.45um，将过滤后的澄清溶液分装入西林瓶，进行冻干处理，制备成冻干粉。

实施例2

配置复溶剂：二甲基硅油0.5‰、氯化钠0.9％、聚乙二醇3％、羟甲纤维素钠0.5％、壳聚糖1%、乳酸钠3％、灰黄霉素0.5g/L、链霉素7万单位/L、青霉素7万单位/L、庆大霉素4万单位/L、纯化水余量。该复溶剂有利于复溶快速完成，复溶过程没有气泡产生，复溶后的糖化血红蛋白溶液可保持14天状态稳定。

实施例3

复溶装置，如图1所示，包括冻干粉瓶和复溶剂瓶，冻干粉瓶包括冻干粉瓶瓶体5和冻干粉瓶瓶盖6，复溶剂瓶包括复溶剂瓶瓶体3、复溶剂瓶瓶嘴2和复溶剂瓶瓶盖1，复溶剂瓶瓶体的材质为聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯中的任意一种，冻干粉瓶和复溶剂瓶由可移除的阻隔装置隔离。可移除的阻隔装置为旋钮7和隔膜4，旋钮7一部分位于冻干粉瓶，另一部分位于复溶剂瓶内，隔膜4位于旋钮7两部分之间。

将实施例1制备的冻干粉装入复溶装置的冻干粉瓶中，将实施例2制备的复溶剂按比例装入复溶装置的复溶剂瓶中，装有冻干粉和复溶剂的复溶装置可以在常温下运输和长期储存。需要复溶时，使旋钮7两部分向相反方向旋转，破坏隔膜4，冻干粉瓶和复溶剂瓶实现连通，使冻干粉和复溶剂混匀。开启复溶剂瓶瓶盖1，挤压复溶剂瓶瓶体3，糖化血红蛋白质控品溶液即可从复溶剂瓶瓶嘴2流出。

实施例4

检验实施例3由冻干粉复溶得到的糖化血红蛋白质控品溶液的均匀性能。

均匀性性能指标的要求为：瓶间变异系数(CV)＜10%。统计学计算过程为行业标准的基本要求。

按照下列方法进行均匀性检验，并计算瓶间均匀性的变异系数CV _瓶间。

在均匀性检验取样的选择时不考虑质控物生产量的因素，随机抽取10个最小包装单元的质控品并随机编号1-10，每个包装单元分别测量3次。测量顺序：考虑测量系统随时间等因素引起的随机变异，3次测量采用不同的顺序进行，例如1、3、5、7、9、2、4、6、8、10，10、9、8、7、6、5、4、3、2、1，2、4、6、8、10、1、3、5、7、9。

式中：

记录检测结果，并按照公式（1）～（9）进行计算F、S _bb、S _r和CV _瓶间；

当F≤1时，检验结果显示瓶间均匀性良好，以S _r代替S _bb计算CV _瓶间，结果应符合要求；

当F≤F _0.05(v1,v2)时，检验结果显示瓶间均匀性良好，计算结果CV _瓶间应符合要求；

当F＞F _0.05(v1,v2)、S _bb≤0.3δ[0.3δ计算方法：质控品可接受值乘以1.5%（CV）]时，认为瓶间均匀性良好，计算结果CV应符合要求；

当F＞F _0.05(v1,v2)、S _bb >0.3δ[0.3δ计算方法：质控品可接受值乘以1.5%（CV）]时，认为瓶间均匀性较差。

表1 实施例3由冻干粉复溶得到的糖化血红蛋白质控品低浓度溶液均匀性检测结果

表2 实施例3由冻干粉复溶得到的糖化血红蛋白质控品中浓度溶液均匀性检测结果

表3 实施例3由冻干粉复溶得到的糖化血红蛋白质控品高浓度溶液均匀性检测结果

检验结果如表1-表3所示。可以看出，实施例3由冻干粉复溶得到的糖化血红蛋白质控品溶液的均匀性良好。

实施例5

检验实施例3由冻干粉复溶得到的糖化血红蛋白质控品溶液的稳定性能。

稳定性能指标的要求：复溶后2℃~8℃避光保存可稳定14天，在稳定期内赋值结果的变化趋势不显著。

检验方法：质控品开瓶复溶后，在2℃～8℃条件下避光贮存，分别在0、3、6、9、12、15天测量，每个时间点重复3次，计算平均值，结果按照下表进行t检验分析，对于95%的置信水平，当

时表示趋势不显著，否则趋势显著；或进行F值检验分析，P＞0.05时表示趋势不显著，否则趋势显著。

表4 实施例3由冻干粉复溶得到的糖化血红蛋白质控品低浓度溶液稳定性检测结果

表中斜率、截距、回归标准误差和斜率标准偏差的计算公式如下（表5-9与之相同）：

表5 实施例3由冻干粉复溶得到的糖化血红蛋白质控品中浓度溶液稳定性检测结果

表6 实施例3由冻干粉复溶得到的糖化血红蛋白质控品高浓度溶液稳定性检测结果

检验结果如表4-表6所示。可以看出，实施例3由冻干粉复溶得到的糖化血红蛋白质控品溶液的稳定性良好。

实施例6

检验实施例1得到的糖化血红蛋白质控品冻干粉的时效稳定性能。

时效稳定性能的要求为：在10-30℃条件下可稳定12个月，在稳定期内赋值结果的变化趋势不显著。

性能实验的方法为：按照先密后梳或等距原则在有效期内至少选取5个时间点作为稳定性监测的时间点，分别在生产后各个时间点留样，每个时间点取出2瓶配制溶液，每瓶测定3次，计算每个时间点2瓶样本检测结果的平均值。根据上表进行t检验分析，对于95%的置信水平，当

时表示趋势不显著，否则趋势显著。

表7 实施例1得到的糖化血红蛋白质控品冻干粉的时效稳定性（配制低浓度溶液）

表8 实施例1得到的糖化血红蛋白质控品冻干粉的时效稳定性（配制中浓度溶液）

表9 实施例1得到的糖化血红蛋白质控品冻干粉的时效稳定性（配制高浓度溶液）

检验结果如表7-表9所示。可以看出，实施例1得到的糖化血红蛋白质控品冻干粉的时效稳定性良好。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施方式，可以理解的是，上述实施方式是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施方式进行变化、修改、替换和变型。本发明的保护范围由权利要求书及其等同技术方案限定。

Claims

1.糖化血红蛋白质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2：用细胞破碎液对步骤S1得到的红细胞进行破碎处理；

S3：离心处理去掉杂质，得到纯净的血红蛋白溶液；

S7：向步骤S6得到的糖化血红蛋白溶液中加入冻干保护剂和防腐剂，进行冻干处理，得到糖化血红蛋白质控品冻干粉；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中的清洗液的成分包括8-10g/L的NaCl和0.1-2％的防腐剂。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中细胞破碎液与红细胞的比例为1∶（10-100），破碎处理温度为2-8℃，破碎处理时间为18-24h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中反应温度为25-42℃，反应时间为1-7天。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中糖基化液的成分包括5%-30%葡萄糖和0.1-2％防腐剂。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中透析的具体方法为：将步骤S4得到的糖基化的血红蛋白溶液装入透析袋中，透析处理除去葡萄糖，反应时间为24-48h；糖基化的血红蛋白溶液和透析液的比例为1∶（1-10）。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S7中的冻干保护剂包括：甘油、海藻糖、牛血清白蛋白、山梨糖醇、蔗糖、甘露醇中的一种或几种，添加浓度为1-20%。

8.应用于权利要求1-7任一项所述的制备方法的复溶装置，其特征在于，包括冻干粉瓶和复溶剂瓶，冻干粉瓶包括冻干粉瓶瓶体和冻干粉瓶瓶盖，复溶剂瓶包括复溶剂瓶瓶体、复溶剂瓶瓶嘴和复溶剂瓶瓶盖，复溶剂瓶瓶体的材质为可挤压的材料，冻干粉瓶和复溶剂瓶由可移除的阻隔装置隔离。

9.根据权利要求8所述的复溶装置，其特征在于，所述可移除的阻隔装置为旋钮和隔膜，旋钮一部分位于冻干粉瓶，另一部分位于复溶剂瓶内，隔膜位于旋钮两部分之间；所述复溶剂瓶瓶体的材质为聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯中的任意一种。

10.应用于权利要求1-7任一项所述的制备方法的复溶剂，其特征在于，复溶剂由以下组分构成：二甲基硅油0.1-1‰、氯化钠0.8-1.0％、聚乙二醇1-5‰、羟甲纤维素钠0.1-1％、壳聚糖0.5-5‰、乳酸钠0.5-5％、灰黄霉素0.3-0.8g/L、链霉素2-10万单位/L、青霉素2-10万单位/L、庆大霉素2-6万单位/L、纯化水余量。