CN117705541B - 用于血样pd-1检测的质控品及其制备与质控方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于血样PD‑1检测的质控品及其制备与质控方法。选取葡萄球菌溶血素提取血样中的白细胞，在含有水溶性淀粉、菊粉的冻干保护液中冻干，制备方法简单，对血液中的白细胞损伤少，有较好的分群效果，在保证数据的可信度的同时也极大降低成本；提取白细胞步骤中选择溶血的方案，冻干过程中添加本发明研发的对白细胞和PD‑1蛋白起到特定保护作用的冻干保护液，质控方法的复溶步骤中添加一种全新的复溶液，含有聚乙烯吡咯烷酮，上述措施能保持稳定的细胞形态，细胞分群效果好；对血样选取高低值两种，较为严格的血样要求可最大化的缩小不同机型间检测相同样本PD‑1表达水平的差异。
Description
技术领域
本发明属于生物样本检测技术领域，具体涉及用于血样PD-1检测的质控品及其制备与质控方法。
背景技术
PD-1（CD279）属于一类免疫球蛋白超加速成员的Ⅰ型跨膜糖蛋白，结构由288个氨基酸组成，又称为程序性死亡蛋白-1。PD-1在人类多种类型实质器官组织、免疫细胞和恶性肿瘤细胞中普遍表达，且前人研究证实其表达在诱导后的多种类型肿瘤细胞中的表达活性有显著上升，与此同时，在恶性肿瘤的肿瘤微环境中的免疫细胞上同样存在着异常表达。在流式细胞仪检测的PD-1是一种连续性表达，无明显的分群效果，因此其相同血液样本中PD-1在不同机型上的阳性表达率差距较大。目前尚未有研究者能在不同机型的流式细胞仪上检测相同血液样本的CD3+PD-1、CD4+PD-1和CD8+PD-1的阳性表达率达到稳定。
现有技术中通过配制不同的保存剂处理新鲜血液，研究出能计数淋巴细胞的全血质控品，具体方法如下：先采取新鲜的人静脉血，EDTA-K2抗凝（终浓度1.8mg/mL），再分别加入不同种类及不同浓度的各种保存剂或几种混合，2~8℃冰箱内保存，比较新鲜血液和保存后全血质控品计数淋巴细胞亚群的结果，优化出保存剂的配方及浓度，最终得到在60天内能使用稳定的用于流式细胞仪计数血液淋巴细胞亚群的室内质控。该方法制备的全血质控品保存时间一般， PD-1质控作用较差。
现有技术中通过液氮冻存的方式对外周血单个核细胞进行冻存，具体方法如下：先静脉采集健康成人的新鲜外周血，用EDTA-K2抗凝管收集，充分混匀后用无菌PBS倍比稀释；再将稀释后的全血按2∶1比例缓慢加入淋巴细胞分离液，400g离心30分钟后缓慢吸出中间的白膜层，用不含血清的1640培养液洗细胞2次，每次离心的转速和时间分别为1500 r/min和10 min。将离心后得到的细胞沉淀弹匀，缓慢滴加已预冷的冻存液，调整细胞浓度为1×106/mL，每管1 ml，装入已预冷的程序冻存盒中，置-70℃冰箱过夜，次日转入液氮长期保存。该方法涉及外周血分离技术，冻存剂液氮能稳定持久保存淋巴细胞，但操作复杂，生产和储存成本过高，在常规4℃储存环境下无法保存。
因此，本领域迫切开发一种简便、高效、低成本的能在不同机型的流式细胞仪上检测PD-1稳定性的方法，本发明克服现有技术的不足，提供一种用于血样PD-1检测的质控品及其制备方法与质控方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了用于血样PD-1检测的质控品及其制备与质控方法，采取高值、低值两种血液样本分组制备，以溶血的方式进行白细胞的提取，设计并提供了全新的冻干保护液，为质控方法提供了全新的复溶液，降低成本，操作简便，且制备的PD-1质控品稳定性高，质控效果好。
血液中含有红细胞、白细胞、血小板。白细胞，又称白血球，是血液中重要的细胞成分，是机体免疫系统的重要组成部分，包括淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞5种类型。淋巴细胞属于白细胞的一种，是人体具有特异免疫识别功能的细胞系，在机体抗感染、抗肿瘤等免疫过程中发挥着重要的作用，其中CD3、CD4和CD8分子是淋巴细胞的表面抗原。本发明提供的方法可以制备一种检测PD-1的质控品，该质控品可以用来调节不同机型的流式细胞仪CD3+PD-1、CD4+PD-1和CD8+PD-1的阴性位置。
一方面，本发明提供了一种用于血样PD-1检测的质控品的制备方法，包括步骤：
S1：混合血液样本；
S2：溶血，离心得白细胞；
S3：冻干；
所述溶血为在血液样本中添加用于溶解红细胞的溶血素。
混合血液样本，指取一例以上的血液样本进行混合；溶血（Hemolysis） 指的是红细胞溶解，简称溶血，这一过程中红细胞破裂；溶血素（Hemolysin）是指任何能使红细胞溶解的物质。
现有的全血直接制备，制备得到的质控品白细胞含量低，质控品中成分复杂，其他成分对质控效果有较大干扰，质控效果不佳，且容易发生变质；现有的离心吸取白膜层的处理方式，操作复杂，质控品质量与操作人员操作水平直接相关，例如容易吸取到血液中的其他成分或吸取的白细胞数量不足。
在本发明中，血液样本与溶血素充分混合进行溶血，能够对血液中的红细胞进行溶解，因此后续离心时能够完整分层，直接去除上层血红蛋白溶液即可得到白细胞。加入溶血素进行溶血，有利于在流式细胞仪上直观看到淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞。
相较于上述方式，添加溶血素能够增加对白细胞的提取效果，溶血素可以完全溶解红细胞，且白细胞的分群效果较好，因此制备出的质控品质量高，CD3+PD-1阳性率接近新鲜血样，且添加溶血素的方法更快捷方便直接得到白细胞，操作难度较低。
对比其他方式，添加溶血素进行溶血的方式制备得到的质控品的稳定性更高，能在37℃下储存30天保持稳定，在实际使用中能够在4℃低温下储存一年并保持稳定。
进一步的，所述步骤S2中的溶血素为葡萄球菌溶血素。
溶血素包括细菌类、免疫类、化学类三类。细菌类通常由细菌产生，如链球菌和葡萄球菌等。它们具有较高的特异性，能够与红细胞发生特异性结合，导致红细胞溶解。免疫类通常由免疫球蛋白或补体等成分组成。它们能够与红细胞发生免疫反应，导致红细胞溶解。这类试剂的特异性较高，但制备过程较为复杂。化学类通常由化学物质组成，如盐酸、硫酸等。它们能够与红细胞发生化学反应，导致红细胞溶解。这类试剂的制备过程较为简单，但特异性较低。
上述溶血素中化学型溶血素首先被排除，化学型溶血素容易导致白细胞破裂，PD-1蛋白变性等，不适合作为本发明的溶血素；其次，免疫型的溶血素虽然特异性高，但是溶血效果不佳，导致最终仍残留有红细胞等，对白细胞的提取产生影响，导致CD3+PD-1阳性率低；细菌型溶血素在本发明中效果最佳，但是不同的细菌型溶血素效果不同，只有葡萄球菌溶血素能够使得溶血效果充分，使得CD3+PD-1阳性率几乎与新鲜血样相同。
进行高温加速试验后，葡萄球菌溶血素溶血制备得到的质控品能在37℃下储存30天保持稳定，在实际使用中能够在4℃低温下储存一年并保持稳定。溶血素增加质控品稳定性的原因可能在于，制备过程中虽然溶血后进行了离心，但质控品中仍含有红细胞、溶血素等多种物质，一方面，溶血素尤其是葡萄球菌溶血素减少了红细胞残留量，另一方面，溶血素的存在对白细胞尤其是对淋巴细胞起到了保护作用，具体机理仍需进一步研究证明。
进一步的，所述步骤S2中的溶血素与血液样本体积比为20:1。
本发明对溶血素和血液样本的体积进行了多种比例的试验，结果表明20:1体积比之下进行溶血的效果更好，制备得到的质控品的CD3+PD-1阳性率几乎等于新鲜血样中的阳性率。
进一步的，所述步骤S3为：加入冻干保护液进行冻干；所述冻干保护液包括水溶性淀粉、菊粉。
与现有技术中计数淋巴细胞亚群的全血质控品相比，本发明在质控品的状态上进行了改进，本发明为冻干状态，更方便运输、使用，保存时间更久；但是冻干过程中白细胞易破裂和死亡，PD-1蛋白也存在变性的风险，不利于质控品的制备和保藏；本发明进行了大量试验，得到了一种特异提高质控品稳定性的冻干保护液，在该冻干保护液下进行冻干，可以更好地保护白细胞，相较于其它冻干保护液的白细胞死亡率高且冻干后的细胞量少。
在研究过程中，首先采用超纯水、1%甘油、2%维生素C、2%聚谷氨酸、5%山梨醇、1%海藻糖作为初步的冻干保护液，对比其他成分的冻干保护液，只有这一种成分的冻干保护液能够保证冻干前后质控品的PD-1阳性率不变，只有冻干前后质控品的CD3+PD-1阳性率不变才能保证冻干状态的质控品能够起到有效的质控效果。
上述初步的冻干保护液维持冻干前后质控品的CD3+PD-1阳性率不变，可能的原理在于：甘油具有防冻剂的作用，可以减少一些活物质的细胞在冻结、升华或贮存中会因细胞膜破裂、细胞脱水、细胞质浓缩等物理化学原因的死亡；维生素C作为抗氧化剂，一定程度上增加了冻干过程中质控品的稳定性；在冻干过程中可能会发生美拉德反应，即氨基化合物（蛋白质、多肽、氨基酸等）和羰基化合物（还原糖、不饱和脂肪酸、醛、酮等）之间经缩合、聚合生成类黑精等褐色物质的反应，这样会影响冻干品的质量，于是本发明加入了聚谷氨酸以减少美拉德反应对冻干的影响；山梨醇对细胞的稳定起到了作用，使得冻干过程中细胞的稳定性提高；加入了海藻糖，海藻糖的存在使得冻干过程对血液中的白细胞损伤较小。
但是在上述初步冻干保护液的作用下冻干，质控品在37℃下储存进行加速试验，随着时间增加质控品的CD3+PD-1阳性率明显发生下降，这表示冻干的质控品发生了一定程度的变质，质控品已不具备质控功能；因此，需要进一步试验以找到能够维持冻干质控品长期储存稳定的一种冻干保护液。
本发明选择了在初步冻干保护液中增加水溶性淀粉和菊粉，得到了最终的冻干保护液：超纯水、1%甘油、2%维生素C、2%聚谷氨酸、5%山梨醇、1%海藻糖、10%水溶性淀粉、2%菊粉。上述冻干保护液的保护下进行冻干能够最大限度保证质控品的长期储存稳定，在37℃下储存30天质控品的CD3+PD-1阳性率没有发生明显降低，在实际使用中可以在4℃下储存一年。
在冻干保护液中加入水溶性淀粉、菊粉，同时使用水溶性淀粉和菊粉时，能够协同发挥效果，显著提高质控品储存的稳定性；
上述水溶性淀粉和菊粉协同发挥效果的原因可能在于：菊粉和水溶性淀粉的化学性质导致的，菊粉分子约由31个β-D-呋喃果糖和1~2个吡喃菊糖残基聚合而成，果糖残基之间能通过β-2,1-键连接，在水中有较好的溶解性，这使它能与水性系统相结合，当与水完全混合后会形成一种奶油状结构，水溶性淀粉溶于水中会形成体型网络的空间结构，在微观层面上，菊粉分子能够在体系中充分分散，并通过氢键、静电等作用附着于水溶性淀粉上，从而充分包裹白细胞，为白细胞提供支撑力，在冻干完成后，白细胞几乎没有受到冻干过程中的伤害，因此能够保持长期稳定。
对比含有和不含有水溶性淀粉、菊粉的冻干保护液，含有水溶性淀粉、菊粉的冻干保护液保护下冻干得到的质控品的稳定性高，在37℃下储存30天内 CD3+PD-1阳性率和用于制备质控品的新鲜血液没有显著差别，含有菊粉的冻干保护液保护下冻干的质控品在实际使用中可以在4℃下储存一年不发生变质。
水溶性淀粉(Water-Solubility Starch)，是淀粉经过酸、酶或其他方法处理而成的淀粉衍生物，水溶性淀粉为白色或黄白色粉末，在冷水中即可全溶，具有可溶性大（分散性好）、吸附性强、胶凝性高（粘稠、溶解后形成胶状物质）的特点；水溶性淀粉的化学结构与淀粉相同，如式（1）所示。
式（1）
菊粉分子约由31个β-D-呋喃果糖和1~2个吡喃菊糖残基聚合而成，果糖残基之间能通过β-2,1-键连接。是由D-果糖经β（1→2）糖苷键链接而成的线性直链多糖，末端常带有一个葡萄糖残基，聚合度（DP）为2~60，其中平均聚合度DP≤9的菊粉又称为短链菊粉，从天然植物中提取的菊粉同时含有长链与短链；菊粉结构如式（2）所示，式（2）中n取值为2~60。
式（2）
优选的，所述步骤S3中的冻干保护液包括超纯水、10%水溶性淀粉、1%海藻糖、2%菊粉、5%山梨醇、2%聚谷氨酸、1%甘油、2%维生素C。
上述多个组分在冻干保护液中是协同产生效果的，缺少任何一种组分或降低任何一种组分的浓度都会对整体的冻干保护效果产生影响。
进一步的，所述步骤S3中的冻干保护液和白细胞的体积比为10:1。
冻干保护液与白细胞的体积比会影响整体上对白细胞的冻干效果，本发明通过试验发现在10:1的体积比下白细胞的冻干效果更好，白细胞死亡率和破碎率低，细胞数量多，因此PD-1质控品的质控效果更好。
进一步的，所述步骤S1中根据血液样本的PD-1含量将血液样本分为低值、高值两组，两组血液样本分开混合；低值血液样本包括无任何疾病症状且血常规正常为标准的新鲜血液样本，高值血液样本包括患有类风湿性关节炎或肿瘤疾病或CD3+T淋巴细胞减少的患者的新鲜血液样本。
用高低两种水平且水平间差异在10%~20%之间的质控品来调节不同机型的PD-1阴性门，选用具备此间差异水平的质控品来调节，可最大化的缩小不同机型间检测相同样本PD-1表达水平的差异，CD3+PD-1绝对偏差小于5%的样本占比可达95%以上。PD-1含量差异有两个高低两种水平，可以尽可能扩大调控范围，覆盖更多不同PD-1水平的样本，进而缩小单一水平调控带来的误差，最大化的缩小不同机型间检测相同样本PD-1表达水平的差异。
另一方面，本发明提供了所述方法制备而来的用于血样PD-1检测的质控品。
另一方面，本发明提供了所述质控品的质控方法，包括步骤：
S1：质控品添加复溶液复溶；
S2：质控样品、检测抗体混合孵育；
S3：根据质控品CD3+PD-1的阳性表达率确定流式细胞仪上CD3+PD-1的阴性位置，并手动调节CD4+PD-1和CD8+PD-1的阴性位置与CD3+PD-1的阴性位置达到一致；
所述质控品包括PD-1含量低值、高值两组血液样本制备的质控品。
理论上同个样本在不同流式细胞仪上的CD3+PD-1、CD4+PD-1、CD8+PD-1阳性表达水平检测结果应具有一致性，但目前实际检测出的同个样本在不同流式细胞仪上的CD3+PD-1、CD4+PD-1、CD8+PD-1阳性表达水平检测结果差异较大，导致数据的不可信且检测PD-1项目能应用流式细胞仪的机型减少，然而通过质控方法使在不同机型的流式细胞仪上检测相同血液样本的CD3+PD-1、CD4+PD-1、CD8+PD-1阳性表达水平检测结果达到相对一致，缩小了不同机型上的检测结果差异，使得数据更可信且能更广泛应用不同机型的流式细胞仪在检测PD-1项目上。
本发明使用的复溶液，相比较于其它超纯水和PBS溶剂，复溶液能使质控品在流式细胞仪上保持稳定的细胞形态，细胞分群效果更好。
进一步的，所述复溶液包括聚乙烯吡咯烷酮K40、PBS。
聚乙烯吡咯烷酮K40是一种合成水溶性高分子化合物，具有胶体保护作用，既能对细胞膜提供一定的保护作用, 也能降低冻干-再水化过程对细胞的损伤。采取本发明的复溶液复溶冻干的质控品，维持细胞结构的完整，增强流式检测时细胞的分群效果，方便精确的圈出淋巴细胞群，进而降低流式细胞仪间的绝对偏差。
优选的，所述复溶液包括1×PBS、10%聚乙烯吡咯烷酮K40。
另一方面，本发明提供了一种溶血素用于制备白细胞质控品的用途，所述溶血素包括葡萄球菌溶血素。
另一方面，本发明提供了一种溶血素用于提高白细胞质控品稳定性的用途，所述溶血素包括葡萄球菌溶血素。
上述稳定性包括两个方面：1、进行白细胞分离时白细胞的稳定性，体现在白细胞死亡率和破裂率降低，白细胞细胞数量增加；2、制备得到的质控品在储存过程中不易发生变质，冻干品中成分稳定。
另一方面，本发明提供了一种溶血素用于降低流式细胞仪间绝对偏差的用途，所述溶血素包括葡萄球菌溶血素。
另一方面，本发明提供了一种冻干保护液用于提高白细胞质控品稳定性的用途，所述冻干保护液包括水溶性淀粉、菊粉。
上述稳定性包括两个方面：1、质控品冻干过程中白细胞的稳定性，体现在白细胞死亡率和破裂率降低，白细胞细胞数量增加；2、制备得到的储存过程中不易发生变质，冻干品中成分稳定。
进一步的，所述冻干保护液包括超纯水、水溶性淀粉、海藻糖、菊粉、山梨醇、聚谷氨酸、甘油、维生素C。
另一方面，本发明提供了一种冻干保护液用于降低流式细胞仪间绝对偏差的用途，所述冻干保护液包括水溶性淀粉、菊粉。
进一步的，所述冻干保护液包括超纯水、水溶性淀粉、海藻糖、菊粉、山梨醇、聚谷氨酸、甘油、维生素C。
另一方面，本发明提供了一种复溶液用于降低流式细胞仪间绝对偏差的用途，所述复溶液包括PBS、聚乙烯吡咯烷酮K40。
本发明的有益效果为：
1、与计数淋巴细胞亚群的全血质控品相比，本发明在质控品的状态上进行了改进，本发明为冻干状态，更方便运输、使用，保存时间更久；与淋巴细胞免疫表型质控品相比，本发明在质控品的制备工艺上进行了改进，省去了复杂的外周血分离、冻存步骤，更加简便，稳定性更可控，也极大降低了质控品的成本；本发明的质控品制备方法简单，制备过程中对血液中的白细胞损伤少，可使质控品有较好的分群效果，在保证检测数据的可信度的同时也极大降低成本；
2、在提取白细胞步骤中选择溶血的方案，将血液样本与溶血素混合，能够增加对白细胞的提取效果，溶血素可以能完全溶解红细胞且白细胞的分群效果较好，因此制备出的质控品质量高，PD-1阳性率接近新鲜血样，且添加溶血素的方法更快捷方便直接得到白细胞，操作难度较低；对多种溶血素进行试验，找到了最有效的一种溶血素；
3、在质控品冻干过程中添加本发明研发的对白细胞和PD-1蛋白起到特定保护作用的冻干保护液，相较于其它冻干保护液的白细胞死亡率高且冻干后的细胞量少，在该冻干保护液下进行冻干，可以更好地保护白细胞；
4、为质控方法中的复溶，提供了一种全新的复溶液，在该复溶液复溶下能保持稳定的细胞形态，细胞分群效果显著高于其他复溶液；
5、无任何疾病症状且血常规正常为标准的新鲜血液样本作为低值PD-1质控品，患有类风湿性关节炎、肿瘤疾病、CD3+T淋巴细胞减少等患者的新鲜血液样本作为高值PD-1质控品，在该血液标准下筛选出的血液进行冻干能有两种水平的PD-1质控品；相比较于随机的血液，不能得到两种差异较大水平的PD-1质控品，较为严格的血样要求可以更好的控制质控品的稳定性；选用具备此间差异水平的质控品来调节，可最大化的缩小不同机型间检测相同样本PD-1表达水平的差异，CD3+PD-1绝对偏差小于5%的样本占比可达95%以上。
附图说明
图1：血样PD-1质控品的制备、质控方法流程图；
图2：不含水溶性淀粉、菊粉的冻干保护液的流式细胞术结果；
图3：含水溶性淀粉、菊粉的冻干保护液的流式细胞术结果；
图4：超纯水复溶的质控品的流式细胞术结果；图5：PBS复溶的质控品的流式细胞术结果；图6：在PBS为基液配制10%聚乙二醇复溶的质控品的流式细胞术结果；图7：在PBS为基液配制10%聚乙烯吡咯烷酮K40复溶的质控品的流式细胞术结果；
图8：在PBS为基液配制5%聚乙烯吡咯烷酮K40复溶的质控品的流式细胞术结果；
图9：在PBS为基液配制15%聚乙烯吡咯烷酮K40复溶的质控品的流式细胞术结果；
图2~图9中圈出的P1为淋巴细胞。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本实施例中未特别指出的试剂均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1：用于血样PD-1检测的质控品的制备、质控方法
血样PD-1质控品的制备、质控方法流程图如图1所示。
1、血样（来自九江市第一人民医院）筛选
选用以无任何疾病症状且血常规正常为标准的新鲜血液样本作为低值PD-1质控品，患有类风湿性关节炎、肿瘤疾病、CD3+T淋巴细胞减少等患者的新鲜血液样本作为高值PD-1质控品；筛选出符合质控品要求的低值和高值PD-1新鲜血液样本，每个血液样本取1mL，按高值组、低值组分开进行混合。
2、血液溶血
将混合后的血液按照1：20的比例（体积比）添加葡萄球菌溶血素（来源为江西赛基）进行溶血，溶血15分钟后离心取沉淀，并再用1mL的PBS混匀离心取沉淀；
3、添加冻干保护液
冻干保护液：超纯水、10%水溶性淀粉、1%海藻糖、2%菊粉、5%山梨醇、2%聚谷氨酸、1%甘油、2%维生素C；所述比例均为质量分数，成分化合物均购自阿拉丁；
将血液溶血离心后所剩下的白细胞按1：10的比例（体积比）添加冻干保护液混匀，按每300μL/瓶分批装在小瓶内进行冻干，冻干时间为48小时；
4.冻干质控品复溶
将冻干后的质控品用100μL复溶液（1×PBS、10%聚乙烯吡咯烷酮K40，来源为阿拉丁）进行复溶，混匀5s后室温静置15分钟；待充分溶解后即可使用，溶解后的冻干质控品需在30分钟内使用；
5.使用复溶后的PD-1质控品进行样本制备
吸取50μL复溶后的质控样品，加入稀释后的PD-1流式检测试剂盒抗体（抗体包括CD45-PE-cy7、CD3-FITC、CD4-APC、CD8-Percp、PD-1-PE，来源为江西塞基）进行避光孵育15分钟，孵育完后加入1mL的PBS混匀，400g离心5分钟后弃上清，最后加入300μL的PBS重悬。
6.质控品上机检测
首先用荧光校准微球校准仪器的各项参数，各项参数都通过后开始检测质控品，采用CD45荧光和SSC设门方式，圈出淋巴细胞，按PD-1检测方法计数低值和高值质控品的CD3+PD-1的阳性表达率。
7.质控品调节不同机型的PD-1阴性门
根据低值和高值两种质控品CD3+PD-1的阳性表达率在不同机型的流式细胞仪（机型1-BD CantoⅡ，机型2-迈瑞E6 ，机型3-必达科BeamCyte-1026）上按照其操作方法确定CD3+PD-1的阴性位置，质控品的CD3+PD-1阳性表达率的绝对偏差≤2%，并调节CD4+PD-1和CD8+PD-1的阴性位置与CD3+PD-1的阴性位置达到一致。
待不同机型的PD-1阴性位置调好之后，通过PD-1流式检测试剂盒说明方法检测不同的血样的CD3+PD-1、CD4+PD-1、CD8+PD-1的阳性值，一根血样重复制作3次分别在三台机型上检测，并记录下同一根血样在不同机型上检测的CD3+PD-1、CD4+PD-1、CD8+PD-1的阳性值，分别计算每两台机型之间的绝对偏差和95%置信区间；在下述实施例2~实施例5中绝对偏差均取十次平行测试（10根血样）结果的CD3+PD-1绝对偏差的均值，CD4+PD-1和CD8+PD-1绝对偏差与CD3+PD-1绝对偏差趋势相同且数值相近，因此以CD3+PD-1绝对偏差来代表整体的机型间绝对偏差。
质控品调节PD-1阴性位置的结果如实施例6所述。
实施例2：白细胞提取方法的试验
现有的一些血样的质控品制备方法中，有不对血样进行处理直接制备的，也有采取分离手段的，例如为从血样中分离得到白细胞，采用离心分离的方法，在离心后吸取白膜层；然而本发明采用如实施例1所述的加入葡萄球菌溶血素的方法对白细胞进行提取，能取得更好的效果，本实施例对比上述的白细胞提取方法，按照实施例1的方法进行质控品的制备和质控方法的应用，区别在于改变实施例1中步骤2的具体方法；将高值血液样本（患有类风湿性关节炎、肿瘤疾病、CD3+T淋巴细胞减少等患者的新鲜血液样本）按照实施例1的方法进行质控品的制作，分别采取上述全血直接制备、离心吸取白膜、葡萄球菌溶血素溶血的方式，其他均与实施例1相同，然后采用流式细胞术对新鲜血样和按照实施例1方法复溶后的冻干质控品中的PD-1进行检测，在对样本检测时，需设定空白对照、同型对照。按照侧向散射光-前向散射光(SSC-FS)联合设门，统计2000个淋巴细胞，分析CD3+PD-1的表达。比较不同方法下CD3+PD-1表达水平的差异，看哪个方法最接近新鲜血样的检测结果。采用阳性率(%)进行表示，上述试验采用同一新鲜血样，每组重复三次，结果如表1所示。
表1：不同白细胞提取方法与CD3+PD-1阳性率
根据试验结果，按照本发明的加入溶血素提取白细胞的方法，对比不进行处理的和离心吸取白膜的处理方式，复溶质控品的CD3+PD-1阳性率最为稳定，且值几乎与新鲜血样中的CD3+PD-1阳性率相同；离心吸取白膜的处理方式结果偏高且不稳定，全血直接制备的CD3+PD-1阳性率偏低且不稳定。
此外，对不同白细胞提取方法进行高温加速试验，分别按照上述三种方法进行质控品的制备，在37℃下分别储存1天、7天、30天，以模拟在常规的4℃低温下储存15天、三个月、一年，取出高温加速储存的质控品并按照上述方法进行CD3+PD-1阳性率的测试，结果如表2所示。
表2：不同白细胞提取方法与质控品稳定性
根据上述试验结果，按照本发明的加入溶血素提取白细胞的方法，对比不进行处理的和离心吸取白膜的处理方式，制备所得的质控品稳定性也得到了提升，在37℃下储存30天几乎不发生白细胞破裂或PD-1变性，CD3+PD-1阳性率同初始用于制备质控品的新鲜血样几乎相同；而全血直接制备的或离心吸取白膜层的方式的质控品稳定性差，随着时间增加质控品中CD3+PD-1阳性率下降，则质控品的质控效果消失。
添加溶血素可以能完全溶解红细胞且白细胞的分群效果较好，因此制备出的质控品质量高，CD3+PD-1阳性率接近新鲜血样，且添加溶血素的方法更快捷方便直接得到白细胞，操作难度较低，能增加质控品的稳定性；然而吸出白膜层的方法操作难度较高，容易吸取到非白细胞的其它物质或者吸取不完全，对技术人员的要求较高，在实践中其结果不稳定，且容易引入对质控存在干扰的其他物质，不利于质控品的制备；全血直接制备的质控品CD3+PD-1阳性率低，不利于后续质控，且由于其成分复杂，在储存中易变质。
接下来，按照实施例1的方法，区别在于选择不同的白细胞提取方法制备质控品，并进行质控，测定不同机型之间的CD3+PD-1绝对偏差，结果如表3所示。
表3：不同白细胞提取方法制备质控品的CD3+PD-1绝对偏差
根据上述试验结果，不同白细胞提取方法对质控时机型间的CD3+PD-1绝对偏差具有巨大影响，与上述阳性率和稳定性实验结果吻合：全血直接制备的质控品进行质控时机型间的绝对偏差最高，离心、吸取白膜层的方式制备的质控品进行质控时机型间的绝对偏差也较高，原因在于全血中含有大量非白细胞的成分，吸取白膜层过程中容易吸取不充分或吸取到其他物质，均会对质控产生严重干扰；溶血素溶血的方式排除了全血中其他物质的干扰和人工误差，从结果上看溶血素溶血的方式的绝对误差极低，能够控制机型间绝对误差在3%以下。
实施例3：溶血素的试验
溶血素是指任何能使红细胞溶解并释放出血红蛋白的物质，有利于在流式细胞仪上直观看到淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞。
溶血素包括细菌类、免疫类、化学类三类。细菌类通常由细菌产生，如链球菌和葡萄球菌等。它们具有较高的特异性，能够与红细胞发生特异性结合，导致红细胞溶解。免疫类通常由免疫球蛋白或补体等成分组成。它们能够与红细胞发生免疫反应，导致红细胞溶解。这类试剂的特异性较高，但制备过程较为复杂。化学类通常由化学物质组成，如盐酸、硫酸等。它们能够与红细胞发生化学反应，导致红细胞溶解。这类试剂的制备过程较为简单，但特异性较低。
本实施例对上述溶血素进行测试，将高值血液样本（患有类风湿性关节炎、肿瘤疾病、CD3+T淋巴细胞减少等患者的新鲜血液样本）按照实施例1的方法进行质控品的制作，但是在不同的溶血素中进行溶血，其他均与实施例1相同，然后采用流式细胞术对新鲜血样和按照实施例1方法复溶后的冻干质控品中的PD-1进行检测，在对样本检测时，需设定空白对照、同型对照。按照侧向散射光-前向散射光(SSC-FS)联合设门，统计2000个淋巴细胞，分析CD3+PD-1的表达。比较不同方法下CD3+PD-1表达水平的差异，看哪个方法最接近新鲜血样的检测结果。采用阳性率(%)进行表示，上述试验采用同一新鲜血样，每组重复三次，结果如表4所示。
表4：不同溶血素与CD3+PD-1阳性率
根据试验结果，在上述溶血素中化学型溶血素首先排除，化学型溶血素容易导致白细胞破裂，PD-1蛋白变性等，不适合作为本发明的溶血素；其次，免疫型的溶血素虽然特异性高，但是溶血效果不佳，导致最终仍残留有红细胞等，对白细胞的提取产生影响，导致CD3+PD-1阳性率低；细菌型溶血素在本发明中效果最佳，但是不同的细菌型溶血素效果不同，只有葡萄球菌溶血素能够使得溶血效果充分，使得CD3+PD-1阳性率几乎与新鲜血样相同。
此外，本实施例对上述较优的三种溶血素（葡萄球菌溶血素、链球菌溶血素、抗RBC抗体）进行稳定性测试，分别按照上述三种溶血素的溶血方法进行质控品的制备，在37℃下分别储存1天、7天、30天，以模拟在常规的4℃低温下储存15天、三个月、一年，取出高温加速储存的质控品并按照上述方法进行PD-1阳性率的测试，结果如表5所示。
表5：不同溶血素与质控品稳定性
根据上述试验结果，不同溶血素与质控品稳定性也存在较大关联，在葡萄球菌溶血素的作用下，质控品的CD3+PD-1阳性率在37℃储存30天内几乎保持不变，在实际使用中可以保证长达1年的有效期，而链球菌溶血素和抗RBC抗体在加速试验中稳定性较低。
接下来，按照实施例1的方法，区别在于采用不同的溶血素制备质控品，并进行质控，测定不同机型之间的CD3+PD-1绝对偏差，结果如表6所示。
表6：不同溶血素制备质控品的CD3+PD-1绝对偏差
根据上述试验结果，采用不同的溶血素制备对质控时机型间的CD3+PD-1绝对偏差具有巨大影响，结果大体上与上述阳性率和稳定性实验结果吻合：葡萄球菌溶血素作为溶血素进行制备，能够质控不同机型间的CD3+PD-1绝对偏差在3%以内。
溶血素与血液的比例会影响溶血效果，进而影响制备所得质控品质量以及质控方法的有效性，本实施例继续对溶血素和血液的体积比进行试验，按照上述相同方法进行测试，区别在于保持溶血素为葡萄球菌溶血素，调整溶血素和血液的体积比，结果如表7所示。
表7：溶血素和血液的体积比与CD3+PD-1阳性率
根据试验结果，溶血素与血液的体积比在20:1时，溶血效果最佳，有利于白细胞的提取，最终制备得到的质控品中CD3+PD-1阳性率与新鲜血样相当，为最优选。
实施例4：冻干保护液的试验
与现有技术中构建计数淋巴细胞亚群的全血质控品相比，本发明在质控品的状态上进行了改进，本发明为冻干状态，更方便运输、使用，保存时间更久；但是冻干过程中，细胞往往容易死亡，导致细胞数减少，这对于质控方法的有效性是不利的。本发明对冻干过程进行了多次试验，给出了能够增加质控品稳定性、保护白细胞的一种冻干保护液。
在研究过程中，本发明对多种冻干保护液进行了试验，具体试验方法为将高值血液样本（患有类风湿性关节炎、肿瘤疾病、CD3+T淋巴细胞减少等患者的新鲜血液样本）按照实施例1的方法进行质控品的制作，但是在不同的冻干保护液保护之下冻干，冻干完成后直接取样进行第一次测试，如表8中“0天”列所示，另外分别在37℃储存1天、7天、30天，以模拟在常规的4℃储存环境下储存15天、3个月、1年，然后采用流式细胞术对新鲜血样和按照实施例1方法复溶的储存的冻干质控品中的PD-1进行检测，在对样本检测时，需设定空白对照、同型对照。按照侧向散射光-前向散射光(SSC-FS)联合设门，统计2000个淋巴细胞，分析CD3+PD-1的细胞表达。比较不同方法下CD3+PD-1表达水平的差异，看哪个方法最接近新鲜血样的检测结果。采用阳性率(%)进行表示，结果如表8所示。
表8：冻干保护液与质控品稳定性
根据上述试验，本发明得到了最佳的冻干保护液，包括超纯水、10%水溶性淀粉、1%海藻糖、2%菊粉、5%山梨醇、2%聚谷氨酸、1%甘油、2%维生素C；在这一冻干保护液的作用之下，冻干后的细胞死亡率降低，细胞数量维持稳定，且在37℃下储存均能保持稳定，因此质控品的CD3+PD-1阳性率保持稳定；而在其他冻干保护液下冻干，细胞容易死亡且细胞数量明显减少，在37℃下随着储存时间增加质控品的CD3+PD-1阳性率降低，会严重影响质控效果。
在研究过程中，首先采用超纯水、1%甘油、2%维生素C、2%聚谷氨酸、5%山梨醇、1%海藻糖作为初步的冻干保护液，对比其他成分的冻干保护液，只有这一种成分的冻干保护液能够保证冻干前后质控品的CD3+PD-1阳性率不变，只有冻干前后质控品的CD3+PD-1阳性率不变才能保证冻干状态的质控品能够起到有效的质控效果。
上述初步的冻干保护液维持冻干前后质控品的CD3+PD-1阳性率不变，可能的原理在于：甘油具有防冻剂的作用，可以减少一些活物质的细胞在冻结、升华或贮存中会因细胞膜破裂、细胞脱水、细胞质浓缩等物理化学原因的死亡；维生素C作为抗氧化剂，一定程度上增加了冻干过程中质控品的稳定性；在冻干过程中可能会发生美拉德反应，即氨基化合物（蛋白质、多肽、氨基酸等）和羰基化合物（还原糖、不饱和脂肪酸、醛、酮等）之间经缩合、聚合生成类黑精等褐色物质的反应，这样会影响冻干品的质量，于是本发明加入了聚谷氨酸以减少美拉德反应对冻干的影响；山梨醇对细胞的稳定起到了作用，使得冻干过程中细胞的稳定性提高；加入了海藻糖，海藻糖的存在使得冻干过程对血液中的白细胞损伤较小。
但是在上述初步冻干保护液的作用下冻干，质控品在37℃下储存进行加速试验，随着时间增加质控品的CD3+PD-1阳性率明显发生下降，这表示冻干的质控品发生了一定程度的变质，质控品已不具备质控功能；因此，需要进一步试验以找到能够维持冻干质控品长期储存稳定的一种冻干保护液。
根据上述剩余试验结果，本发明选择了在初步冻干保护液中增加水溶性淀粉和菊粉，得到了最终的冻干保护液：超纯水、1%甘油、2%维生素C、2%聚谷氨酸、5%山梨醇、1%海藻糖、10%水溶性淀粉、2%菊粉。上述冻干保护液的保护下进行冻干能够最大限度保证质控品的长期储存稳定，在37℃下储存30天质控品的CD3+PD-1阳性率没有发生明显降低，在实际使用中可以在4℃下储存一年。
在冻干保护液中分别加入水溶性淀粉、菊粉、葡聚糖、低聚果糖（均购买自阿拉丁），上述糖类物质均能够起到一定的提高质控品稳定性效果，四种糖类物质的效果相似，但是本发明发现，同时使用水溶性淀粉和菊粉时，能够协同发挥效果，显著提高质控品储存的稳定性，使得在37℃下储存30天质控品的CD3+PD-1阳性率保持稳定；而水溶性淀粉与低聚果糖、葡聚糖和菊粉以及本发明额外试验的更多组合均被证明无法协同发挥效果，其保持质控品储存稳定性的效果与加入单一糖类物质相似，无法保证质控品的长期储存稳定。
上述水溶性淀粉和菊粉协同发挥效果的原因可能在于：菊粉和水溶性淀粉的化学性质导致的，菊粉分子约由31个β-D-呋喃果糖和1~2个吡喃菊糖残基聚合而成，果糖残基之间能通过β-2,1-键连接，在水中有较好的溶解性，这使它能与水性系统相结合，当与水完全混合后会形成一种奶油状结构，水溶性淀粉溶于水中会形成体型网络的空间结构，在微观层面上，菊粉分子能够在体系中充分分散，并通过氢键、静电等作用附着于水溶性淀粉上，从而充分包裹白细胞，为白细胞提供支撑力，在冻干完成后，白细胞几乎没有受到冻干过程中的伤害，因此能够保持长期稳定。
对比含有和不含有水溶性淀粉、菊粉的冻干保护液，含有水溶性淀粉、菊粉的冻干保护液保护下冻干得到的质控品的稳定性高，在37℃下储存30天内 CD3+PD-1阳性率和用于制备质控品的新鲜血液没有显著差别，含有菊粉的冻干保护液保护下冻干的质控品在实际使用中可以在4℃下储存一年不发生变质。
此外再取同一血样，分别按照实施例1的方法制备质控品，区别在于分别在含有和不含有水溶性淀粉、菊粉的冻干保护液保护下冻干，复溶后流式细胞仪测定结果分别如图2、图3所示，添加水溶性淀粉、菊粉后细胞分群效果好，在冻干过程中水溶性淀粉、菊粉起到保护白细胞的效果，白细胞完整且数量较多。
流式检测白细胞图应该是经典的三分群图（中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞），而PD-1质控品的关键是要能够圈出淋巴细胞（图2、图3中右下那团），不用考虑中性粒细胞、单核细胞。
含有水溶性淀粉、菊粉的冻干保护液保护下冻干的质控品的流式细胞结果图中，细胞分群较好，能清晰圈出白细胞中的淋巴细胞。数值上，不含有水溶性淀粉、菊粉的冻干保护液进行冻干，圈出的淋巴细胞的占比仅为0.33%，而含有水溶性淀粉、菊粉的冻干保护液进行冻干，圈出的淋巴细胞的占比达6.62%。
接下来，按照实施例1的方法，区别在于采用不同的冻干保护液制备质控品，每一组分别不储存直接进行测试、37℃储存1天或7天进行测试，按照实施例1的方法进行质控，测定不同机型之间的CD3+PD-1绝对偏差，结果如表9所示。
表9：不同冻干保护液制备质控品的CD3+PD-1绝对偏差
根据上述试验结果，在含有和不含有水溶性淀粉、菊粉的冻干保护液保护下制备的质控品，制备完成后直接进行质控，质控效果相似，机型间的CD3+PD-1绝对偏差不大于3%；但是随着在37℃下储存时间的增加，含有水溶性淀粉、菊粉的冻干保护液制备得到的质控品的质控效果没有明显变化，不含有水溶性淀粉、菊粉的冻干保护液制备得到的质控品的质控效果显著下降，机型间绝对偏差增大，质控品已变质而不具有质控功能。
对比含有水溶性淀粉与低聚果糖、葡聚糖和菊粉的冻干保护液与本发明优选的含有水溶性淀粉和菊粉的冻干保护液，在制备完成后直接进行质控，质控品的质控效果相似，均符合要求，但是随着储存时间的增加，含有水溶性淀粉与低聚果糖、葡聚糖和菊粉的冻干保护液保护下制备的质控品质控效果显著下降，机型间的绝对偏差严重增加，说明对应质控品的稳定性差，不利于质控品的产品化和应用；而本发明的含有水溶性淀粉和菊粉的冻干保护液，在37℃下储存30天内随时取出用于质控，均能使得机型间CD3+PD-1绝对偏差小于3%，那么在常规的4℃下能够稳定储存一年，质控品的稳定性高，质控效果好，因此优选含有水溶性淀粉和菊粉的冻干保护液。
实施例5：复溶液的试验
在本发明血样PD-1质控品的质控方法中，首先需要对质控品进行复溶，在复溶过程中复溶液起到关键作用，影响复溶得到的溶液的细胞分群效果和稳定性，本实施例对复溶液的种类进行试验，取按照实施例1的方法同一批制备的质控品，同时在不同的复溶液中复溶，流式细胞仪检测这些复溶溶液，质控品复溶液分别选用超纯水、PBS、在PBS为基液配制10%聚乙二醇、在PBS为基液配制10%聚乙烯吡咯烷酮K40、在PBS为基液配制5%聚乙烯吡咯烷酮K40、在PBS为基液配制15%聚乙烯吡咯烷酮K40。
按照实施例1的方法，区别在于调整复溶液的成分，得到三种机型之间的CD3+PD-1绝对偏差，结果如表10所示
表10：不同机型间的CD3+PD-1绝对偏差
根据试验结果，使用超纯水、PBS复溶的绝对偏差大于PBS，10%聚乙烯吡咯烷酮K40的复溶剂，与细胞分群结果相同；将聚乙烯吡咯烷酮K40更换为聚乙二醇，则绝对偏差明显增加，不利于血样PD-1检测的质控；对比不同浓度的聚乙烯吡咯烷酮K40，最佳浓度为10%，此时绝对偏差最低，均控制在3%以内，质控效果最高。
此外再取同一血样，分别按照实施例1的方法制备质控品，区别在于在不同的复溶液中复溶，超纯水复溶的流式细胞术结果如图4所示，PBS复溶的流式细胞术结果如图5所示，在PBS为基液配制10%聚乙二醇复溶的流式细胞术结果如图6所示，在PBS为基液配制10%聚乙烯吡咯烷酮K40复溶的流式细胞术结果如图7所示，在PBS为基液配制5%聚乙烯吡咯烷酮K40复溶的流式细胞术结果如图8所示，在PBS为基液配制15%聚乙烯吡咯烷酮K40复溶的流式细胞术结果如图9所示。
流式检测白细胞图应该是经典的三分群图（中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞），PD-1质控品的关键是要能够圈出淋巴细胞（图4、图5、图6、图7、图8、图9中右下那团），不用考虑中性粒细胞、单核细胞。
图4、图5、图6（对应超纯水、PBS及聚乙二醇PBS）细胞分群效果差，均不能清晰圈出淋巴细胞，图7、图8、图9（对应不同浓度的聚乙烯吡咯烷酮K40、PBS）的细胞分群效果好，图7（对应聚乙烯吡咯烷酮K40浓度10%）的细胞分群效果较图8（对应聚乙烯吡咯烷酮K40浓度5%）、图9（对应聚乙烯吡咯烷酮K40浓度15%）更好。
如图可见，在PBS为基液配制聚乙烯吡咯烷酮K40效果好于超纯水和PBS，细胞的分群效果及稳定性较好，聚乙烯吡咯烷酮K40的浓度应优选10%。从原理上看，聚乙烯吡咯烷酮K40是一种合成水溶性高分子化合物，具有胶体保护作用，既能对细胞膜提供一定的保护作用, 也能降低冻干-再水化过程对细胞的损伤，因此能够提高冻干质控品淋巴细胞的分群效果。
实施例6：调PD-1的阴性位置
理论上同个样本在不同流式细胞仪上的CD3+PD-1、CD4+PD-1、CD8+PD-1阳性表达水平检测结果应具有一致性，但目前实际检测出的同个样本在不同流式细胞仪上的CD3+PD-1、CD4+PD-1、CD8+PD-1阳性表达水平检测结果差异较大，导致数据的不可信且检测PD-1项目能应用流式细胞仪的机型减少，然而通过质控方法使在不同机型的流式细胞仪上检测相同血液样本的CD3+PD-1、CD4+PD-1、CD8+PD-1阳性表达水平检测结果达到相对一致，缩小了不同机型上的检测结果差异，使得数据更可信且能更广泛应用不同机型的流式细胞仪在检测PD-1项目上。
质控品调PD-1阴性位置的方法如下：
1、取高值、低值质控品各1瓶，分别用100μL的复溶液在室温下进行复溶，混匀5秒后室温下静置15分钟；
2、待完全溶解后吸取50μL的PD-1质控样品，加入稀释后的PD-1流式检测试剂盒抗体各20μL，室温避光孵育15分钟；
3、加入1mLPBS混匀，400g离心5分钟，弃上清；
4、加入300uLPBS重悬上机检测；
5、采用CD45荧光和SSC设门方式，圈出淋巴细胞，分别记录高值、低值质控品CD3+PD-1的阳性表达率；
6、据高值、低值质控品CD3+PD-1的阳性表达率，调节其在其它不同机型流式细胞仪上检测的CD3+PD-1的阳性表达率，调节时需保证绝对偏差≤2%，以此确定在其它不同机型流式细胞仪上CD3+PD-1的阴性位置；同时调节CD4+PD-1、CD8+PD-1的阴性位置与CD3+PD-1的阴性位置达到一致，
7、待不同机型的PD-1阴性位置调好之后，通过PD-1流式检测试剂盒说明方法检测不同的血样的CD3+PD-1、CD4+PD-1、CD8+PD-1的阳性值，一根血样重复制作3次分别在三台机型上检测，并记录下同一根血样在不同机型上检测的CD3+PD-1、CD4+PD-1、CD8+PD-1的阳性值，共对98根血样进行测试。
8、结果分析：分别计算每两台机型之间的绝对偏差和95%置信区间。
表11：质控品绝对偏差
表12：质控品置信区间
阴性对照调PD-1阴性位置的方法如下：
1、随机挑选一根新鲜血样；
2、吸取50μL的新鲜血样，加入稀释后的PD-1流式检测试剂盒抗体（PD-1抗体用PBS代替）各20μL，室温避光孵育15分钟；
3、加入1mL溶血素混匀，室温避光溶血15分钟，400g离心5分钟，弃上清；
4、加入1mLPBS重悬清洗，400g离心5分钟，弃上清；
5、加入500uLPBS重悬上机检测；
6、采用CD45荧光和SSC设门方式，圈出淋巴细胞，并将CD3+PD-1、CD4+PD-1、CD8+PD-1的阳性表达率调到0%，即可确定阴性位置，按其操作方法，在不同的机型上调好CD3+PD-1、CD4+PD-1、CD8+PD-1的阴性位置；
7、待不同机型的PD-1阴性位置调好之后，通过PD-1流式检测试剂盒说明方法检测不同的血样的CD3+PD-1、CD4+PD-1、CD8+PD-1的阳性值，一根血样重复制作3次分别在三台机型上检测，并记录下同一根血样在不同机型上检测的CD3+PD-1、CD4+PD-1、CD8+PD-1的阳性值，共对60根血液进行测试。
8、分别计算每两台机型之间的绝对偏差和95%置信区间。
表13：阴性对照绝对偏差
表14：阴性对照置信区间
比较质控品和阴性对照检测相同样本在不同机型上的CD3+PD-1、CD4+PD-1、CD8+PD-1的稳定性，结果显示在绝对偏差＜3%、＜4%和＜5%时，质控品调PD-1阴性位置的占比率都高于用阴性对照调PD-1阴性位置，所以通过质控品调PD-1的阴性位置更有效的使相同样品在不同机型上达到稳定。
无任何疾病症状且血常规正常为标准的新鲜血液样本作为低值PD-1质控品，患有类风湿性关节炎、肿瘤疾病、CD3+T淋巴细胞减少等患者的新鲜血液样本作为高值PD-1质控品，相比较于随机的血液不能得到两种差异水平的PD-1质控品，在该血液标准下筛选出的血液进行冻干能有两种水平的PD-1质控品。
用高低两种水平且水平间差异在10%~20%之间的质控品来调节不同机型的PD-1阴性门，选用具备此间差异水平的质控品来调节，可最大化的缩小不同机型间检测相同样本PD-1表达水平的差异，CD3+PD-1绝对偏差小于5%的样本占比可达95%以上。
本发明作了详尽的描述，但上述实施例是示例性的，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合和组合，在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改、改进、替换或变型，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种用于血样PD-1检测的质控品的制备方法，其特征在于，包括步骤：
S1：混合血液样本；
S2：溶血，离心得白细胞；
S3：冻干；
所述溶血为在血液样本中添加用于溶解红细胞的溶血素；所述溶血素为葡萄球菌溶血素；所述冻干为加入冻干保护液进行冻干，所述冻干保护液包括超纯水、10%水溶性淀粉、1%海藻糖、2%菊粉、5%山梨醇、2%聚谷氨酸、1%甘油、2%维生素C。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤S2中的溶血素与血液样本体积比为20:1。
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤S3中的冻干保护液和白细胞的体积比为10:1。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤S1中根据血液样本的PD-1含量将血液样本分为低值、高值两组，两组血液样本分开混合；低值血液样本包括无任何疾病症状且血常规正常的新鲜血液样本，高值血液样本包括患有类风湿性关节炎或肿瘤疾病或CD3+T淋巴细胞减少的患者的新鲜血液样本。
5.如权利要求1-4任一项所述方法制备而来的用于血样PD-1检测的质控品。
6.一种利用权利要求5所述质控品的质控方法，其特征在于，包括步骤：
S1：质控品添加复溶液复溶；
S2：质控样品、检测抗体混合孵育；
S3：根据质控品CD3+PD-1的阳性表达率确定流式细胞仪上CD3+PD-1的阴性位置，并手动调节CD4+PD-1和CD8+PD-1的阴性位置与CD3+PD-1的阴性位置达到一致；
所述质控品包括PD-1含量低值、高值两组血液样本制备的质控品。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述复溶液包括PBS、聚乙烯吡咯烷酮K40。
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