CN103674918A

CN103674918A - 一种基于凝集素液相悬浮芯片检测糖蛋白糖链结构的方法

Info

Publication number: CN103674918A
Application number: CN201310680331.XA
Authority: CN
Inventors: 李宏; 汪泓; 余红秀; 杨芃原
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2013-12-12
Filing date: 2013-12-12
Publication date: 2014-03-26

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种基于凝集素液相悬浮芯片检测糖蛋白糖链结构的方法。本发明中，糖链和凝集素在三维环境中的反应，提高了凝集素芯片技术的灵敏度，克服了凝集素芯片技术中凝集素与糖蛋白在二维环境中反应时亲和力弱而难以高效检测糖基化蛋白的弊端。本发明所述方法可快速、简便、特异、高通量地检测蛋白质糖基化特征，使用的样品量较少，有利于不同样品之间的糖基化差异比较，为建立高通量蛋白质糖基化修饰差异谱分析提供技术平台，有利于探讨疾病分子标志物的不同糖基化状态对疾病的预测价值。

Description

一种基于凝集素液相悬浮芯片检测糖蛋白糖链结构的方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种基于凝集素液相悬浮芯片技术检测糖蛋白糖链结构的新方法；具体涉及凝集素液相悬浮芯片的制备、凝集素偶联量优化，并应用于标准样品和实际样品的糖基化检测。

背景技术

目前已知，蛋白质糖基化是最常见的翻译后修饰之一，细胞内约有50%以上的蛋白质可被糖基化修饰；所述糖蛋白则在分化、发育、肿瘤发生与转移、精卵识别、免疫、传染及再生中发挥重要的作用。有研究显示，若干重要的糖蛋白的糖基化变化为肿瘤的早期诊断、进程监测、预后评估提供了重要的信息；因此，研究糖蛋白并揭示其糖基化特征非常重要。

然而，许多具有重要生理、病理意义的糖蛋白在细胞中的表达量较低，阻碍了糖基化的研究。为了研究糖基化的重要生物分子标志物在生理或疾病状态下的糖基化变化，有关研究发展了一系列芯片技术，如抗体芯片、凝集素芯片以及糖芯片等。上述高通量、高灵敏地检测糖基化的方法为进一步的辅助疾病的诊断提供了有效的手段。然而，以凝集素芯片为例，由于糖链与凝集素亲和力较低，其检测灵敏度和通量有限；因此，当前亟需发展一种高灵敏度、高特异、高通量的检测蛋白质糖链结构和糖基化水平的实用方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于凝集素液相悬浮芯片检测糖蛋白糖链结构的方法，提高凝集素芯片技术的灵敏度；具体涉及将传统的凝集素芯片技术和Bioplex液相悬浮芯片系统相结合制备凝集素液相悬浮芯片、凝集素偶联量优化，并应用于标准样品和实际样品的糖基化检测。本发明所述的芯片系统能够快速地、高灵敏度地、高通量地检测分子标志物的糖基化，是分析糖基化差异的有力手段，具有很好的临床应用前景。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

（1）凝集素与磁珠的共价偶联，制备凝集素液相悬浮芯片

采用清洗缓冲液（偶联试剂盒自带）清洗磁珠后，加入活化缓冲液（偶联试剂盒自带）重悬磁珠；向磁珠内加入50μg/μL EDC和50μg/μL sulfo-NHS振荡条件下避光室温反应20分钟；用PBS清洗过量的EDC和sulfo-NHS，并重复清洗过程一次；最后，用PBS重悬活化的磁珠；用PBS配置一系列的凝集素与活化后的磁珠4℃过夜反应；离心去上清后，加入“Stabil Guard Choice”无蛋白封闭溶液重悬，室温孵育30分钟；离心后，用贮存缓冲液（偶联试剂盒自带）重悬磁珠；

（2）用氨基反应生物素标记试剂盒标记糖蛋白

将标准蛋白溶于H₂O，使蛋白终浓度为10μg/μL；将10μL DMSO加入到氨基-反应生物素中（标记试剂盒自带），吹打使其溶解；向蛋白溶液中加入反应缓冲液（标记试剂盒自带）和氨基-反应生物素溶液，于37℃反应10分钟；利用10kDa MWCO离心超滤管超滤除去反应液，收集生物素标记的糖蛋白；

（3）将生物素标记的糖蛋白与偶联凝集素的磁珠反应

向孵育缓冲液(0.5%Tween-20PBS)中加入生物素化的糖蛋白和磁珠，4℃下反应过夜。反应结束后，加入100μL清洗缓冲液(0.1%Tween-20PBS)清洗磁珠；再加入50μL孵育缓冲液稀释的1μg/mL链霉素-藻红蛋白室温下振荡反应40分钟；反应结束后，重复清洗步骤；最后，用清洗缓冲液重悬磁珠；

（4）利用Bio-Plex液相悬浮芯片检测系统对信号进行采集，每个孔检测75个磁珠，并且记录荧光信号中位值(MFI)。

本发明所述方法中，主要是将凝集素共价偶联在磁珠上，在液体环境下与生物素标记的糖蛋白进行反应，由于所述糖蛋白与凝集素在三维空间内反应，使得糖链与凝集素的亲和力大大增加，进而有效提高了凝集素芯片技术的灵敏度。本发明的方法可快速、简便、特异、高通量地检测蛋白质糖基化特征，使用的样品量较少，有利于不同样品之间的差异比较，研究糖基化差异谱图，为建立高通量蛋白质糖基化修饰差异谱分析提供技术平台，有利于探讨疾病分子标志物的不同糖基化状态对疾病的预测价值。

附图说明

图1为本发明所述方法的实验流程。

图2为对于15μL磁珠，五种凝集素的偶联质量优化曲线，其中，

A：WGA；

B：AAL；

C：Con A；

D：PNA；

E：RCA 120。

图3为五种凝集素的最低检测限，其中，

A：RCA120；

B：Con A；

C：AAL；

D：PNA；

E：WGA。

图4为五种凝集素的线性范围，其中，

A：RCA 120；

B：Con A；

C：AAL；

D：PNA；

E：WGA。

图5凝集素液相悬浮液相芯片应用于检测标准糖蛋白的糖链结构。

图6凝集素液相悬浮液相芯片应用于检测临床肝癌病人血清IgG的糖链结构和糖基化水平；其中，

A：正常人和患肝癌人血清Ig G的糖基化结构特点；

B：两种样品所产生的荧光信号相对定量；

C：PSA和SNA的凝集素印迹以验证Ig G中的糖基化变化。

具体实施方式

下面的实例是对本发明提出的基于凝集素液相悬浮芯片检测糖蛋白糖链结构的新方法的进一步说明。

实施例1凝集素偶联量对凝集素芯片信号的影响实验

在偶联反应中，用PBS配置一系列浓度的凝集素溶液，与15μL磁珠进行偶联；取出1.5μL磁珠与过量的生物素化的糖蛋白（约5μg/mL）4℃过夜孵育，清洗后与二抗反应，之后用Bioplex悬浮芯片检测系统对信号进行采集，结果如图2所示，WGA的最佳偶联量为21μg\15μL磁珠；AAL的最佳偶联量为20μg\15μL磁珠；Con A的最佳偶联量为2μg\15μL磁珠；PNA最佳偶联量为5μg\15μL磁珠；RCA120的最佳偶联量为10μg\15μL磁珠。

实施例2凝集素液相悬浮芯片的最低检测限实验

采用上述实施例1制得的凝集素最佳偶联量进行偶联；用反应缓冲液配置一系列浓度的标准糖蛋白溶液，与1.5μL磁珠4℃过夜孵育，清洗后与二抗反应，之后用Bioplex悬浮芯片检测系统对信号进行采集；本发明中特别设计了两种不同的阴性对照：一种是BSA非糖蛋白阴性对照，另一种是糖蛋白阴性对照；净信号为凝集素特异性识别的糖蛋白产生的信号减去阴性对照信号的平均值；当净信号大于标准偏差的3倍，并且信号与噪音的比值大于1.5倍时的最小糖蛋白浓度为检测限；结果如图3所示，RCA 120对牛去唾液酸胎球蛋白ASF的检测限为50pg/mL，Con A对牛胰腺核糖核酸酶B RNase B的检测限为100pg/mL，AAL对辣根过氧化物酶HRP的检测限为500pg/mL，PNA对牛去唾液酸胎球蛋白ASF的检测限为2,000pg/mL，WGA对牛胎球蛋白FET的检测限为3,333pg/mL；RCA120对牛去唾液酸胎球蛋白ASF的检测限为目前报道的凝集素芯片技术的最低检测限。

实施例3凝集素液相悬浮芯片的线性范围的实验

采用上述实施例1制得的凝集素最佳偶联量进行偶联；用反应缓冲液配置一系列浓度的标准糖蛋白溶液，与1.5μL磁珠4℃过夜孵育，清洗后与二抗反应，之后用Bioplex悬浮芯片检测系统对信号进行采集；结果如图4所示，RCA 120对牛去唾液酸胎球蛋白ASF的线性范围为50～3,333pg/mL，Con A对牛胰腺核糖核酸酶B RNase B的线性范围为100～10,000pg/mL，AAL对辣根过氧化物酶HRP的线性范围为0.5～500ng/mL，PNA对牛去唾液酸胎球蛋白ASF的2～1,000ng/mL，WGA对牛胎球蛋白FET的线性范围为3.3～2,000ng/mL。

实施例4凝集素液相悬浮芯片用于检测标准糖蛋白样品的糖链结构

采用上述实施例1制得的凝集素最佳偶联量进行偶联；取100μg标准糖蛋白进行生物素化标记；用偶联有17种不同凝集素的芯片分别与生物素化的标准糖蛋白辣根过氧化物酶HRP(50ng/mL)、小鼠层粘连蛋白mLam(33ng/mL)和牛去唾液酸胎球蛋白ASF(50ng/mL)4℃过夜孵育，清洗后与二抗反应，之后用Bioplex悬浮芯片检测系统对信号进行采集；在减去牛血清白蛋白BSA阴性对照的背景信号后，计算其信号的相对强度，结果如图5所示，凝集素液相悬浮芯片方法检测到糖链结构与现有文献报道相一致。

实施例5凝集素液相悬浮芯片用于检测实际样品中糖蛋白的糖链结构和糖基化水平

为了证明凝集素液相芯片在实际样品糖基化检测和相对定量的有效性，本发明中选择了血清中富集的Ig G作为一个实际应用的例子；分别从3个健康人及3个患肝癌人混合血清中富集获得的Ig G以16.67ng/mL的浓度稀释于孵育反应液中，再与凝集素液相芯片4℃过夜孵育清洗后与二抗反应，之后用Bioplex悬浮芯片检测系统对信号进行采集；采用牛血清白蛋白BSA作为阴性对照，在减去背景信号后，记录凝集素的检测信号；结果如图6所示，凝集素的检测信号显示Ig G的糖基化特征与之前的报道一致；与健康人血清相比，肝癌人血清中Ig G上被SNA-I所识别的(α-2,6)唾液酸，以及被PSA所识别的(α-1,6)核心岩藻糖显著增加。

Claims

1.一种基于凝集素液相悬浮芯片检测糖蛋白糖链结构的方法，其特征是，步骤如下：

（1）凝集素与磁珠的共价偶联，制备凝集素液相悬浮芯片

清洗缓冲液清洗磁珠后，加入活化缓冲液重悬磁珠；向磁珠内加入50μg/μLEDC和50μg/μL sulfo-NHS，振荡条件下避光室温反应20分钟；用PBS清洗过量的EDC和sulfo-NHS，并重复清洗过程一次；最后，用PBS重悬活化的磁珠；用PBS配置一系列的凝集素与活化后的磁珠4℃过夜反应；离心去上清后，加入“Stabil Guard Choice”无蛋白封闭溶液重悬，室温孵育30分钟；离心后，用贮存缓冲液重悬磁珠；

（2）用氨基反应生物素标记试剂盒标记糖蛋白

将标准蛋白溶于H₂O，使蛋白终浓度为10μg/μL将10μL DMSO加入到氨基反应生物素，吹打使其溶解；向蛋白溶液中加入反应缓冲液和氨基反应生物素溶液，于37℃反应10分钟；利用10kDa MWCO离心超滤管超滤除去反应液，收集生物素标记的糖蛋白；

（3）生物素标记的糖蛋白与偶联凝集素的磁珠反应

向孵育缓冲液中加入生物素化的糖蛋白和磁珠，4℃下反应过夜；反应结束后，加入100μL清洗缓冲液清洗磁珠；再加入50μL孵育缓冲液稀释的1μg/mL链霉素-藻红蛋白室温下振荡反应40分钟；反应结束后，重复清洗步骤；最后，用清洗缓冲液重悬磁珠；

（4）利用Bio-Plex液相悬浮芯片检测系统对信号进行采集；每个孔检测75个磁珠，并且记录荧光中位值MFI。

2.根据权利要求1所述的基于凝集素液相悬浮芯片检测糖蛋白糖链结构的方法，其特征是，所述步骤（1）中，采用250μg/μL EDC和50μg/μL sulfo-NHS活化磁珠，避光室温反应20分钟。

3.根据权利要求1所述的基于凝集素液相悬浮芯片检测糖蛋白糖链结构的方法，其特征是，所述步骤（1）中，采用“Stabil Guard Choice”无蛋白封闭溶液封闭磁珠，室温孵育30分钟。

4.根据权利要求1所述的基基于凝集素液相悬浮芯片检测糖蛋白糖链结构的方法，其特征是，所述步骤（2）中，采用NH₂-reaction biotin标记糖蛋白，于37℃反应10分钟。

5.根据权利要求1所述的基于凝集素液相悬浮芯片检测糖蛋白糖链结构的方法，其特征是，所述步骤（3）中，凝集素液相悬浮芯片与糖蛋白孵育反应的缓冲液为0.5%Tween-20PBS。

6.根据权利要求1所述的基于凝集素液相悬浮芯片检测糖蛋白糖链结构的方法，其特征是，所述步骤（3）中，清洗缓冲液为0.1%Tween-20PBS。

7.根据权利要求1所述的基于凝集素液相悬浮芯片检测糖蛋白糖链结构的方法，其特征是，所述步骤（4）中，采用Bio-Plex液相悬浮芯片检测系统对凝集素芯片信号进行采集。