CN113588756A - 一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法及应用 - Google Patents

一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113588756A
CN113588756A CN202110599048.9A CN202110599048A CN113588756A CN 113588756 A CN113588756 A CN 113588756A CN 202110599048 A CN202110599048 A CN 202110599048A CN 113588756 A CN113588756 A CN 113588756A
Authority
CN
China
Prior art keywords
membrane
construction site
drinking water
washing
electrochemical biosensor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110599048.9A
Other languages
English (en)
Inventor
虞文明
王稷
汪亚伟
倪铭列
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China MCC17 Group Co Ltd
Original Assignee
China MCC17 Group Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China MCC17 Group Co Ltd filed Critical China MCC17 Group Co Ltd
Priority to CN202110599048.9A priority Critical patent/CN113588756A/zh
Publication of CN113588756A publication Critical patent/CN113588756A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/4166—Systems measuring a particular property of an electrolyte

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法及应用，属水环境检测领域。本发明包括以下步骤：S1.电极制备：黄金圆盘电极表面消除氧化金或残渣碎片；S2.电解液中制造厚膜：S1中所得电极在电解液中施加恒电位模式产生最均匀的厚膜；S3.厚膜冲洗激活羧基：对膜冲洗并对聚合物进行功能化，并将其置于EDC和NHS的新鲜溶液中10分钟，以激活薄膜上的羧基，使其与此发明选择的凝集素发生反应；S4.EDC/NHS孵育：用10mM、pH为7.46的PB缓冲液冲洗膜，置于1mg/mL凝集素溶液中，室温下孵育2小时，然后用PB冲洗胶片；S5.测定细菌浓度：用分光光度计定的近似培养基细菌浓度并用PB缓冲液进行稀释，用高压PB进行细胞清洗，用去离子水制备LB肉汤和PB溶液。

Description

一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法及应用
技术领域
本发明涉及水环境检测的技术领域，尤其涉及一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法及应用。
背景技术
水环境中细菌检测对人类的安全与健康具有重要意义。由于细菌感染引起的疾病爆发和细菌耐药性的出现，对传感器的要求越来越高。使人们对开发更快速、更准确的检测一次性细菌的方法越来越重视。正在开发的细菌检测方法跨越不同领域，从基于DNA的分析到表面/亲和作用。目前的酶联免疫吸附法(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)等平台有其优点、优势和特异性应用，在应对菌株鉴定和高选择性、高灵敏度等挑战方面表现突出。虽然它们继续得到改进，但由于它们固有的多步骤特性，还是囿于成本和时间限制。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中不足，故此提出一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法及应用，通过使用特定的凝集素可以选择性地检测病原体。所得到的特征图谱可用于更清楚地鉴定病原体，并指导对任何特定病例筛选抗生素的选择报道的生物传感器有潜力协助诊断感染类型，并在细菌感染的情况下确定最有效的抗生素。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法，包括以下步骤：
S1.电极制备：黄金圆盘电极表面消除氧化金或残渣碎片；
S2.电解液中制造厚膜：S1中所得电极在电解液中施加恒电位模式产生最均匀的厚膜；
S3.厚膜冲洗激活羧基：对膜冲洗并对聚合物进行功能化，并将其置于EDC和NHS的新鲜溶液中10分钟，以激活薄膜上的羧基，使其与此发明选择的凝集素发生反应；
S4.EDC/NHS孵育：用10mM、pH为7.46的PB缓冲液冲洗膜，置于1mg/mL凝集素溶液中，室温下孵育2小时，然后用PB冲洗胶片；
S5.测定细菌浓度：用分光光度计定的近似培养基细菌浓度并用PB缓冲液进行稀释，用高压PB进行细胞清洗，用去离子水制备LB肉汤和PB溶液。
S2包括以下步骤：
S201.电解液中含有13mM的4-(3-吡咯基)丁酸，含150mM氯化亚硝酸乙腈，施加1V的恒定电位以达到50mC/cm2的控制电荷。
S3包括以下步骤：
S301.膜先用ACN冲洗，然后用PB缓冲液冲洗；EDC在0.1M、pH为4.5的2-乙磺酸缓冲液中制备，NHS在二甲亚砜中制备，将薄膜置于50mm EDC和200mm NHS的新鲜溶液中10分钟，以激活薄膜上的羧基。
S4包括以下步骤：
S401.EDC和NHS，-20℃保存，用PB缓冲液稀释，EDC/NHS孵育后，用10mM、pH为7.46的PB缓冲液冲洗膜，置于1mg/mL凝集素溶液中，室温下孵育2小时，然后用PB缓冲液冲洗胶片。
S5包括以下步骤：
S501.用Beckman Coulter DU800分光光度计测量OD600测定的近似培养基细菌浓度为2x1010cfu/mL，用含有1mm CaCl2和MnCl2富集的PB缓冲液进行稀释，用去离子水制备LB肉汤和PB溶液。
一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法的应用，用于鉴定病原体，并指导对任何特定病例筛选抗生素的选择报道的生物传感器有潜力协助诊断感染类型，在细菌感染的情况下确定最有效的抗生素。
与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
本发明制造这些装置的材料和工艺成本低且简单。能够根据图谱确定细菌种属。
附图说明
图1是大肠杆菌细胞从Ca2+和Mg2+溶液的形态。
图2是在10mM PB中增加1mM HCl的薄膜响应,分别为聚合物薄膜和锥形功能化胶片，灵敏度：29.6和19.6mV/pH。
图3是分别为聚合物薄膜和捕获到ConA上的细菌的HYROX图像功能化聚合物薄膜，刻度栏为2μm。
图4是在10mM PB缓冲液中得到的Nyquist图。
图5是ConA功能化葡萄糖添加的计量测量金盘电极上的Ppy-COOH薄膜电压随时间的变化过程，对大肠杆菌细胞进行抗生素处理之前(9.2x107)cfu/mL)、30分钟后与红霉素(4mg/mL)反应、孵育后额外的30分钟。
图6是作为大肠杆菌细胞增殖函数，连续50mM葡萄糖添加后设备响应浓度为9.2x101，6.0x103，6.4x106，6.5x107和9.2x107cfu/mL。插入显示9.2x107
cfu/mL.灵敏度：0.211mV，R2值为0.993。数据点是来自3个独立生物传感器的平均测量值和误差条标准偏差。
图7是从右起，对ConA添加50mM葡萄糖进行电位测量金盘电极上的功能化Ppy-COOH薄膜的电位变化。数据点是3个独立生物传感器的平均测量值，误差条表示标准偏差。
图8是大肠杆菌在添加50mM葡萄糖反应(9.2x107)cfu/mL)后的电位变化，数据点是平均值来自3个独立的生物传感器的测量值，误差条表示标准偏差。
图9是捕获大肠杆菌和杆菌细胞的卵磷脂效率比较。数据点是来自3个独立生物传感器和误差条的平均测量值表示标准差。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
实施例1
如图1至图9所示，一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法，包括以下步骤：
S1.电极制备：黄金圆盘电极表面消除氧化金或残渣碎片；
S2.电解液中制造厚膜：S1中所得电极在电解液中施加恒电位模式产生最均匀的厚膜；
S3.厚膜冲洗激活羧基：对膜冲洗并对聚合物进行功能化，并将其置于EDC和NHS的新鲜溶液中10分钟，以激活薄膜上的羧基，使其与此发明选择的凝集素发生反应；
S4.EDC/NHS孵育：用10mM、pH为7.46的PB缓冲液冲洗膜，置于1mg/mL凝集素溶液中，室温下孵育2小时，然后用PB冲洗胶片；
S5.测定细菌浓度：用分光光度计定的近似培养基细菌浓度并用PB缓冲液进行稀释，用高压PB进行细胞清洗，用去离子水制备LB肉汤和PB溶液。
S2包括以下步骤：
S201.电解液中含有13mM的4-(3-吡咯基)丁酸，含150mM氯化亚硝酸乙腈，施加1V的恒定电位以达到50mC/cm2的控制电荷。
S3包括以下步骤：
S301.膜先用ACN冲洗，然后用PB缓冲液冲洗；EDC在0.1M、pH为4.5的2-乙磺酸缓冲液中制备，NHS在二甲亚砜中制备，将薄膜置于50mm EDC和200mm NHS的新鲜溶液中10分钟，以激活薄膜上的羧基。
S4包括以下步骤：
S401.EDC和NHS，-20℃保存，用PB缓冲液稀释，EDC/NHS孵育后，用10mM、pH为7.46的PB缓冲液冲洗膜，置于1mg/mL凝集素溶液中，室温下孵育2小时，然后用PB缓冲液冲洗胶片。
S5包括以下步骤：
S501.用Beckman Coulter DU800分光光度计测量OD600测定的近似培养基细菌浓度为2x1010cfu/mL，用含有1mm CaCl2和MnCl2富集的PB缓冲液进行稀释，用去离子水制备LB肉汤和PB溶液。
利用聚合物膜的羧基对凝集素进行共价功能化，可以降低膜的pH敏感性。对所制备的膜进行pH敏感性研究，添加1mM的HCl，以确定膜在ConA凝集素功能化前后的pH敏感性。采用电化学阻抗谱(EIS)监测和确认每个加工步骤的完成情况。每一步完成后，用PB冲洗薄膜，放入标准的3电极电化学电池中，以Ag/AgCl电极为参比，铂网为辅助电极。细胞含有10mL，5mm的铁/亚铁氰化物缓冲液。EIS测量直到细胞稳定，通常需要重复15次。只有当活细胞被固定在电极表面时，电位才会出现净增加，这是由于聚合物膜的电导率增加，这是由细胞分泌的酸性代谢物使其羧基质子化而引起的。在对照试验中，工作电极仅在ConA或死细胞中发挥功能，添加葡萄糖后电位下降；因此，验证信号在活细胞的情况下不是由于添加葡萄糖；因为这种添加对细胞电位的影响是相反的。这种电位的降低可能与ConA与葡萄糖的相互作用有关。注意到当没有细胞和使用高压灭菌的细胞时，葡萄糖的加入导致类似的信号，这可能是细菌在高压灭菌处理期间受到了损害，尽管损害通过显微镜检查不明显。这种损伤可能抑制了细胞与凝集素的结合，从而导致类似于阴性对照试验的反应。需要进一步的调查来证实这是事实。
通过MS2噬菌体的实验证明了传感器的选择性。噬菌体MS2被用来证明设备区分病毒和细菌感染的能力。虽然设备可以检测到低于107cfu/mL的细胞浓度，但在抗生素筛选中使用高浓度的细菌，因为低浓度可能无法明确抗生素的排序。抗生素的选择是基于它们杀死大肠杆菌细胞的有效性。据报道，四环素和红霉素对大肠杆菌有效，而卡那霉素的效果要差得多。测试装置功能与活大肠杆菌细胞首先用葡萄糖测试，以确保细胞是良好的健康，然后在浓度为4mg/mL的抗生素孵育30分钟。当使用无效抗生素时，抗生素处理过的细胞对葡萄糖的反应仍然很高。使用更有效的抗生素，在添加葡萄糖时产生更小的信号时表明细胞已被抗生素治疗杀死。在测试所述的发明中使用的相同抗生素的存在下培养大肠杆菌细胞，根据信号抑制幅度的抗生素效果排名与文献报道的排名相匹配。
当病人出现感染症状时，及时诊断和确定适当的治疗方法对病人的健康至关重要。因此确定引起疾病的细菌种属对于诊断及治疗至关重要。本发明研制过程中比较了大肠杆菌和枯草芽孢杆菌对ConA和花生凝集素的反应。文献报道了细菌通过不同凝集素的选择性结合。cona42和大肠杆菌之间有很强的相互作用，这在文献中是一致的。ConA对大肠杆菌脂多糖链上高浓度的葡萄糖和甘露糖片段有很高的亲和力。也有报道称ConA能凝集枯草芽孢杆菌细胞。花生由于其与目标糖半乳糖的结合亲和力较低，因此有望与大肠杆菌的结合更少，从而导致信号较低。枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阴性菌，其最外层是肽聚糖，由于肽聚糖是由n-乙酰氨基葡萄糖和n-乙酰壁的胞壁酸组成，因此与ConA和花生凝集素的结合量比大肠杆菌小。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此。所述替代可以是部分结构、器件、方法步骤的替代，也可以是完整的技术方案。根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.电极制备：黄金圆盘电极表面消除氧化金或残渣碎片；
S2.电解液中制造厚膜：S1中所得电极在电解液中施加恒电位模式产生最均匀的厚膜；
S3.厚膜冲洗激活羧基：对膜冲洗并对聚合物进行功能化，并将其置于EDC和NHS的新鲜溶液中10分钟，以激活薄膜上的羧基，使其与此发明选择的凝集素发生反应；
S4.EDC/NHS孵育：用10mM、pH为7.46的PB缓冲液冲洗膜，置于1mg/mL凝集素溶液中，室温下孵育2小时，然后用PB冲洗胶片；
S5.测定细菌浓度：用分光光度计定的近似培养基细菌浓度并用PB缓冲液进行稀释，用高压PB进行细胞清洗，用去离子水制备LB肉汤和PB溶液。
2.根据权利要求1所述的一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法，其特征在于：S2包括以下步骤：
S201.电解液中含有13mM的4-(3-吡咯基)丁酸，含150mM氯化亚硝酸乙腈，施加1V的恒定电位以达到50mC/cm2的控制电荷。
3.根据权利要求1所述的一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法，其特征在于：S3包括以下步骤：
S301.膜先用ACN冲洗，然后用PB缓冲液冲洗；EDC在0.1M、pH为4.5的2-乙磺酸缓冲液中制备，NHS在二甲亚砜中制备，将薄膜置于50mmEDC和200mmNHS的新鲜溶液中10分钟，以激活薄膜上的羧基。
4.根据权利要求1所述的一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法，其特征在于：S4包括以下步骤：
S401.EDC和NHS，-20℃保存，用PB缓冲液稀释，EDC/NHS孵育后，用10mM、pH为7.46的PB缓冲液冲洗膜，置于1mg/mL凝集素溶液中，室温下孵育2小时，然后用PB缓冲液冲洗胶片。
5.根据权利要求1所述的一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法，其特征在于：S5包括以下步骤：
S501.用BeckmanCoulterDU800分光光度计测量OD600测定的近似培养基细菌浓度为2x1010cfu/mL，用含有1mmCaCl2和MnCl2富集的PB缓冲液进行稀释，用去离子水制备LB肉汤和PB溶液。
6.工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法的应用，其特征在于：用于鉴定病原体，并指导对任何特定病例筛选抗生素的选择报道的生物传感器有潜力协助诊断感染类型，在细菌感染的情况下确定最有效的抗生素。
CN202110599048.9A 2021-05-31 2021-05-31 一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法及应用 Pending CN113588756A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110599048.9A CN113588756A (zh) 2021-05-31 2021-05-31 一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110599048.9A CN113588756A (zh) 2021-05-31 2021-05-31 一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113588756A true CN113588756A (zh) 2021-11-02

Family

ID=78243247

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110599048.9A Pending CN113588756A (zh) 2021-05-31 2021-05-31 一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113588756A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5766934A (en) * 1989-03-13 1998-06-16 Guiseppi-Elie; Anthony Chemical and biological sensors having electroactive polymer thin films attached to microfabricated devices and possessing immobilized indicator moieties
WO2003081244A2 (en) * 2002-03-26 2003-10-02 Sensor-Tech Limited Method of electrochemical cell analysis
CN101057143A (zh) * 2004-11-11 2007-10-17 森思泰克有限公司 分析物的电化学分析改进方法
US20100197524A1 (en) * 2007-07-31 2010-08-05 Georgia Tech Research Corporation Electrochemical biosensor arrays and instruments and methods of making and using same
US20140303012A1 (en) * 2011-08-30 2014-10-09 The Board Of Trustees Of Michigan State University Extraction and detection of pathogens using carbohydrate-functionalized biosensors
CN108333354A (zh) * 2018-01-12 2018-07-27 安徽医科大学 一种用于人类血清十种糖链联合检测的凝集素芯片及其制备和使用方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5766934A (en) * 1989-03-13 1998-06-16 Guiseppi-Elie; Anthony Chemical and biological sensors having electroactive polymer thin films attached to microfabricated devices and possessing immobilized indicator moieties
WO2003081244A2 (en) * 2002-03-26 2003-10-02 Sensor-Tech Limited Method of electrochemical cell analysis
CN101057143A (zh) * 2004-11-11 2007-10-17 森思泰克有限公司 分析物的电化学分析改进方法
US20100197524A1 (en) * 2007-07-31 2010-08-05 Georgia Tech Research Corporation Electrochemical biosensor arrays and instruments and methods of making and using same
US20140303012A1 (en) * 2011-08-30 2014-10-09 The Board Of Trustees Of Michigan State University Extraction and detection of pathogens using carbohydrate-functionalized biosensors
CN108333354A (zh) * 2018-01-12 2018-07-27 安徽医科大学 一种用于人类血清十种糖链联合检测的凝集素芯片及其制备和使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUI PENG ET AL.: ""Label-free electrochemical DNA sensor based on functionalised conducting copolymer"", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》, vol. 20, no. 9, pages 1821 - 1828 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Brosel-Oliu et al. Novel impedimetric aptasensor for label-free detection of Escherichia coli O157: H7
Pérez et al. Immunomagnetic separation with mediated flow injection analysis amperometric detection of viable Escherichia coli O157
Shabani et al. Bacteriophage-modified microarrays for the direct impedimetric detection of bacteria
Joung et al. A nanoporous membrane-based impedimetric immunosensor for label-free detection of pathogenic bacteria in whole milk
Ahmed et al. Novel impedimetric immunosensor for detection of pathogenic bacteria Streptococcus pyogenes in human saliva
US11686729B2 (en) Bacteriophage-based electrochemical bacterial sensors, systems, and methods
US8679806B2 (en) Methods for detecting and/or quantifying a concentration of specific bacterial molecules using bacterial biosensors
Hannah et al. Rapid antibiotic susceptibility testing using low-cost, commercially available screen-printed electrodes
Cheng et al. Membrane-based electrochemical nanobiosensor for Escherichia coli detection and analysis of cells viability
CA2859914A1 (en) Methods and apparatus for rapid detection of infectious microorganisms
CN109060917B (zh) 一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器及其制备方法和应用
Ren et al. Rapid detection of antibiotic resistance in Salmonella with screen printed carbon electrodes
Sun et al. Electrogenerated chemiluminescence biosensor based on functionalized two-dimensional metal–organic frameworks for bacterial detection and antimicrobial susceptibility assays
Saucedo et al. Electrochemical biosensor for rapid detection of viable bacteria and antibiotic screening
Soni et al. Label-free impedimetric detection of Listeria monocytogenes based on poly-5-carboxy indole modified ssDNA probe
McLeod et al. Developing a toll-like receptor biosensor for Gram-positive bacterial detection and its storage strategies
Ozoemena et al. Electrospun carbon nanofibers as an electrochemical immunosensing platform for vibrio cholerae toxin: Aging effect of the redox probe
TWI407099B (zh) 電壓式生物感測器及其製作方法
Sismaet et al. Electrochemical probes of microbial community behavior
US20090068638A1 (en) Phage-based method for the detection of bacteria
Verma et al. Coupling electrochemical response of a DNA biosensor with PCR for Neisseria gonorrhoeae detection
CN113588756A (zh) 一种工地饮用水电化学生物传感器检测活菌的方法及应用
EP3781701B1 (en) Detection of bacteria
CN113588742A (zh) 建筑工地用基于化学电阻的生物传感器的制备方法及应用
JP2005304376A (ja) 生体検出方法および生体検出装置

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination