CN104714015A - 心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域，具体地说是一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及检测方法，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡设有由下自上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为50-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的心型脂肪酸结合蛋白抗原表位的单克隆抗体细胞株，具有操作简便、反应快速、灵敏℃高、特异性强等优点。

Description

心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域，具体地说是一种能够快速准确的对心型脂肪酸结合蛋白进行定量分析的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及检测方法。 

背景技术

人心型脂肪酸结合蛋白(HFABP)是心脏中富含的一种新型小胞质蛋白，它具有高度心脏特异性，主要分布于心肌组织中，约占心肌细胞可溶性蛋白的4%-8%，在骨骼肌、肾小管、脑组织、乳腺、胎盘组织中也有少量分布。它由132 个氨基酸组成，分子量为15KDa，其基因定位于1号染色体。生理条件下，血液中不含HFABP或者含量非常低，性别、年龄和昼夜节律都可以引起HFABP含量的变化，比如男性肌肉比例高于女性，因此男性血液中HFABP浓度高于女性，但总体来说，在正常情况下，HFABP在血液中的表达量极低。在心肌缺血损伤出现后，hFABP 在血液中的含量会迅速升高，在胸痛发作后1-3 小时就出现于血液中，6-8 小时达到峰值，而且血浆水平在24-30小时内恢复正常。 

近年来，对于心肌损伤的生物标志物的研究取得很大进展，包括肌红蛋白（MYO）、心肌肌钙蛋白T、心肌肌钙蛋白I和肌酸激酶同功酶（CKMB）等心肌标志物在临床工作中应用也十分广泛。与这些常用心脏标志物于心肌损伤后出现在血液中的时间和浓度变化对比发现，在心肌损伤早期(6小时内)，较其它心脏标志物而言，HFABP 和MYO 在诊断评估方面具有明显的时间优势。但是，因在炎症、局部缺血、SLE、休克及皮肌炎等情况下亦会引起MYO 的血液浓度升高，因此MYO作为心肌细胞损伤的诊断指标具有特异性较低的特点。而HFABP 相对于MYO 具有着高℃的心肌特异性，所以作为心肌损伤的早期标志物而言，选择HFABP 更为理想。因此HFABP可以作为一种对心肌损伤的早期诊断非常有用的生物标志物。 

目前，针对心型脂肪酸结合蛋白检测方法主要有定量方法和定性检测方法，定量检测方法有双抗夹心法(ELISA)、免疫发光法、高效液相色谱分析、放射免疫分析法，胶乳颗粒增强免疫比浊法等。定性方法主要有免疫层析法。其中，高效液相色谱分析费时且不易自动化；ELISA法定量准确性差、操作时间长、自动化程℃低，多用于定性检测；放射免疫分析法灵敏℃可达到4pg/ml，能检测正常人血清心型脂肪酸结合蛋白，比双抗夹心法灵敏，缺点是所需时间较长，检测结果不稳定，重复性比ELISA差，且存在放射性污染危险；胶乳颗粒增强免疫比浊法(PETIA)可以很方便的应用与全自动生化仪，但是耗时较长，对于急诊科和基层医院，无法满足快速检测的目的；金标方法灵敏℃较低，一般只能定性，不能定量，特别是重复性差这一缺点限制了其在临床上的应用，尤其不适用于需通过准确定量来帮助对疾病进行诊断的体液标志蛋白的定量检测；免疫发光法方法特异性强，敏感性高，但需要昂贵的仪器设备和经验丰富的操作人员，一般多在特定医疗机构使用。因此开发灵敏度更高、快捷方便的心型脂肪酸结合蛋白产品，仍是临床诊断产品研究领域亟需解决的重要问题。 

发明内容

本发明针对现有技术中存在的缺点和不足，提出了一种利用荧光免疫层析的灵敏性，结合荧光免疫层析分析仪实现的灵敏度高、快捷简便，可以准确定量的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及检测方法。 

本发明可以通过以下措施达到： 

一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡设有由下自上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为50-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的心型脂肪酸结合蛋白抗原表位的单克隆抗体细胞株。

本发明所述结合垫的稀土荧光微球的直径优选是60-90nm；所述稀土荧光微球优选掺杂有稀土镧系元素，为铕(Eu) 、钐( Sm) 、铒(Er) 、钕(Nd)等镧系元素的任意一种或几种的混合物；所述稀土荧光微球优选掺杂稀土络合物；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体优选来源于针对3个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。 

本发明所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于200mM Tris-HCL处理液中（含1.2% Triton X-100，2.0%BSA，pH7.5），4℃浸泡4小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体喷到玻璃纤维膜，37℃烘干2小时后制得。 

本发明中结合垫上的所述稀土荧光微球标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体采用如下步骤制得： 

步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：参照心型脂肪酸结合蛋白氨基酸序列，选择抗原性强的位点人工合成20个氨基酸左右的多肽序列，交联到KLH上，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株；

步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；

步骤3：稀土荧光微球的醛基化：取2mg稀土荧光微球，用25mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为5分钟，最后重悬于100μl的上述碳酸盐缓冲液中，加入200μl醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100μl的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用；

步骤4：稀土荧光微球标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备：将1mg心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4℃反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度5mM，4℃反应4小时；再加入等体积的封闭液（50mM Tris-HCL，pH7.5，含2%BSA，5%蔗糖），4℃封闭过夜；然后用50mM Tris-HCL，pH7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100μl的50mM Tris-HCL缓冲液中（含1.2%NaCL，0.2%BSA，0.1%Tween 20），4℃避光保存备用。

本发明所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜通过以下步骤制得： 

步骤1：采用与获得结合垫上心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体不同的序列位点，合成多肽序列，参照上述单克隆抗体制备流程获得心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，保存于-20℃备用；

步骤2：分别用包被稀释液将心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到1-5mg/ml，膜液量为1-2μl/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

本发明所述样品垫通过以下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于0.2M Tris缓冲液（pH7.5），1.0%Triton X-100，2% BSA的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。 

 本发明还提供了一种如上所述试剂盒实现的心型脂肪酸结合蛋白检测方法，其特征在于包括以下步骤： 

步骤1：将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；

步骤2： 精确吸取25μl 血清样本，样本为全血时吸取50μl 样本，加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL 样本稀释液，样本稀释液采用 生理盐水或PBS，15-30 分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果；

步骤3：设置好荧光免疫层析分析仪的相关参数后，将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果，所述荧光免疫层析分析仪是一种光学检测系统，对心型脂肪酸结合蛋白的检测范围为0-160ng/mL。

本发明提供一种利用稀土荧光免疫层析技术制备的心型脂肪酸结合蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒，同时适合血清和全血样本，并适合临床上单人份检测，相对于心型脂肪酸结合蛋白定性胶体金试剂，能定量检测样本中的心型脂肪酸结合蛋白含量，具有更明确的临床指导意义，具有操作简便、反应快速、灵敏℃高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。 

附图说明：

  附图1是本发明中实施例2的准确度分析结果示意图。

附图标记：PVC板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫5。 

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明：

本发明首先提出了一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，盒内设有试纸卡，所述试纸卡设有由下自上依次设有：PVC板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，其中结合垫3上吸附有稀土荧光微球标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为50-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的心型脂肪酸结合蛋白抗原表位的单克隆抗体细胞株；

所述结合垫3的稀土荧光微球的直径优选是60-90nm；所述稀土荧光微球优选掺杂有稀土镧系元素，为铕(Eu) 、钐( Sm) 、铒(Er) 、钕(Nd)等镧系元素的任意一种或几种的混合物；所述稀土荧光微球优选掺杂稀土络合物；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体优选来源于针对3个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。

实施例1：

心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒中试纸卡的各组成部分可以通过以下措施制得：

1、样品垫2的制备：

将玻璃纤维膜浸泡于0.2M Tris缓冲液（pH7.5），1.0%Triton X-100，2% BSA的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

2、吸附荧光微球标记抗体的结合垫3的制备： 

将玻璃纤维膜浸泡于200mM Tris-HCL处理液中（含1.2% Triton X-100，2.0%BSA，pH7.5），4℃浸泡4小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用。将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体喷到玻璃纤维膜，37℃烘干2小时，备用；

稀土荧光纳米微球的醛基化：取2mg稀土荧光纳米微球，用25mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为5分钟，最后重悬于100μl的上述碳酸盐缓冲液中，加入200μl醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100μl的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用；

稀土荧光纳米微球标记心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备：将1mg心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光纳米微球混合，4℃反应过夜。然后，加入硼氢化钠至终浓度5mM，4℃反应4小时；再加入等体积的封闭液（50mM Tris-HCL，pH7.5，含2%BSA，5%蔗糖），4℃封闭过夜；然后用50mM Tris-HCL，pH7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100μl的50mM Tris-HCL缓冲液中（含1.2%NaCL，0.2%BSA，0.1%Tween 20），4℃避光保存备用；

3、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜4的制备：

采用与获得结合垫上心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体不同的序列位点，合成多肽序列，参照上述单克隆抗体制备流程获得心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，保存于-20℃备用；

分别用包被稀释液将心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到1-5mg/ml，膜液量为1-2μl/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时；

试纸卡的组装：在PVC板1上依次粘贴经过处理的样品垫2、吸附有稀土荧光标记的抗体的结合垫3、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜4和吸水垫5，组装后得到试纸大板，按照要求切割成4mm宽，将试纸装入塑料卡内形成试纸卡。

上述各步骤中选用的设备及原料优选以下原料： 

心型脂肪酸结合蛋白特异性配对抗体：心型脂肪酸结合蛋白质控品：芬兰HYTEST有限公司产品；稀土荧光微球：上海甄准生物科技有限公司；硝酸纤维素(NC) 膜：Millipore 公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白：Sigma 产品，其它常用试剂均为分析纯试剂。

实施例2：准确度试验 

    选用上述试纸卡以及荧光免疫层析分析仪（型号：NEO-007），

荧光免疫分析仪参数的设定：在荧光免疫分析仪上设定好试纸卡工艺参数后，取上述组装好的试纸卡，分别用5、10、20、40、80、160ng/mL 的心型脂肪酸结合蛋白标准品，用试纸卡进行测定，得到各标准品的荧光强度值，将结果输入到分析仪的参数中，完成分析仪的参数的设定。

主要检测材料：临床样本由相关医院获得，共200 份胶乳增强免疫比浊法定值样本，其中血清样本100 份，全血样本100 份，心型脂肪酸结合蛋白含量分布区间为0-160ng/mL 之间。 

检测方法： 

步骤1：将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；

步骤2：精确吸取25μl 血清样本，样本为全血时吸取50μl 样本，加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL 样本稀释液( 生理盐水或PBS)，15-30 分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果；

步骤3：设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果。

试验结果分析： 

临床样本检测试剂制备完成后，按检测方法对所有临床样本进行检测，并分析检测结果。

试验结果： 

如附图1所示，以实验系统的检测值为Y轴，以对照系统的测验值为X轴，绘制散点图，并进行相关性分析。临床样本检测对200 份临床定值样本检测，样本平均偏差值均小于10％，最大偏差小于15％，R2>0.98，一致性系数>0.95。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好，适合用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需要。

本发明提供一种利用稀土荧光免疫层析技术制备的心型脂肪酸结合蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒，同时适合血清和全血样本，并适合临床上单人份检测，相对于心型脂肪酸结合蛋白定性胶体金试剂，能定量检测样本中的心型脂肪酸结合蛋白含量，具有更明确的临床指导意义，具有操作简便、反应快速、灵敏℃高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。 

Claims (8)

1.一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡设有由下自上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为50-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的心型脂肪酸结合蛋白抗原表位的单克隆抗体细胞株。

2.根据权利要求1所述的一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，其特征在于所述结合垫的稀土荧光微球的直径优选是60-90nm；所述稀土荧光微球掺杂有稀土镧系元素。

3.根据权利要求2所述的一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，其特征在于所述稀土荧光微球掺杂稀土络合物；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体来源于针对3个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。

4.根据权利要求1所述的一种心型脂肪酸结合蛋白质检测试剂盒，其特征在于所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于200mM Tris-HCL处理液中，4℃浸泡4小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体喷到玻璃纤维膜，37℃烘干2小时后制得。

5.根据权利要求4所述的一种心型脂肪酸结合蛋白质检测试剂盒，其特征在于结合垫上的所述稀土荧光微球标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体采用如下步骤制得：

步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：参照心型脂肪酸结合蛋白氨基酸序列，选择抗原性强的位点人工合成20个氨基酸左右的多肽序列，交联到KLH上，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株；

步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；

步骤3：稀土荧光微球的醛基化：取2mg稀土荧光微球，用25mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为5分钟，最后重悬于100μl的上述碳酸盐缓冲液中，加入200μl醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100μl的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用；

步骤4：稀土荧光微球标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备：将1mg心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4℃反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度5mM，4℃反应4小时；再加入等体积的封闭液，4℃封闭过夜；然后用50mM Tris-HCL，pH7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100μl的50mM Tris-HCL缓冲液中，4℃避光保存备用。

6.根据权利要求1所述的一种心型脂肪酸结合蛋白质检测试剂盒，其特征在于所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜通过以下步骤制得：

步骤1：采用与获得结合垫上心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体不同的序列位点，合成多肽序列，参照上述单克隆抗体制备流程获得心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，保存于-20℃备用；

步骤2：分别用包被稀释液将心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到1-5mg/ml，膜液量为1-2μl/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

7.根据权利要求1所述的一种心型脂肪酸结合蛋白质检测试剂盒，其特征在于所述样品垫通过以下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于0.2M Tris缓冲液， pH为7.5，1.0%Triton X-100，2% BSA的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

8.一种利用如权利要求1-7中任意一项所述试剂盒实现的心型脂肪酸结合蛋白检测方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1：将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；

步骤2： 精确吸取25μl 血清样本，样本为全血时吸取50μl 样本，加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL 样本稀释液，样本稀释液采用 生理盐水或PBS，15-30 分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果；

步骤3：设置好荧光免疫层析分析仪的相关参数后，将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果，所述荧光免疫层析分析仪是一种光学检测系统，对心型脂肪酸结合蛋白的检测范围为0-160ng/mL。