CN112903989A - 一种心型脂肪酸结合蛋白快速检测卡 - Google Patents

Abstract

本发明公开了心型脂肪酸结合蛋白快速定量试纸条。该试纸条包括PVC底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、标记物垫、样品垫和稀释液垫；纤维素膜固定在底板上，在硝酸纤维素膜一端放置吸水垫，另一端放置稀释液垫；标记物垫放置在纤维素膜上且位于稀释液垫前方，并在标记物垫和稀释液垫之间保留纤维素膜的裸露空间；在标记物垫上设置样品垫；在纤维素膜上吸水垫与标记物垫之间的区间沿着从标记物垫到吸水垫方向依次设置检测线和质控线；在检测窗检测线和标记物垫之间设置定量标识线。本发明通过控制样品液和标记物反应的复合物双向侧流至到定量标识线，实施精确控制免疫反应量；并该延迟加入稀释液的设计，大大增加免疫反应时间，提高了检测灵敏度和精密度。

Description

一种心型脂肪酸结合蛋白快速检测卡

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种免疫层析双孔加样心型脂肪酸结合蛋白快速定量检测卡。

背景技术

胶体金免疫层析技术(GICA)是70年代发展起来的一项快速免疫检测方法，它以硝酸纤维素膜为载体，利用硝酸纤维素膜对蛋白吸附和毛细管吸虹特性，不但把免疫反应的蛋白牢固地固定在硝酸纤维素膜上；又能使滴加的液体样本在吸水垫的作用下，从膜的一侧慢慢向另一侧流动。当被测液体样本中含有特异抗体或抗原，它们可以和标记胶体金的抗体(或抗原)发生免疫反应形成复合物，再与固定在硝酸纤维素膜上对应抗原(或抗体)结合，形成显示胶体金颜色的免疫结合物。该技术简单、快速、不需要任何仪器设备，5-20分钟内就能显示检测结果。现已广泛应用于免疫学检测各个方面。

针对胶体金免疫层析技术，存在灵敏度低，检测线性范围窄，重金属污染，检测结果主观性等较多情况，科研工作者又开发出了带颜色的乳胶、荧光微球、磁微球、荧光色素等示踪标记物，提高检测的灵敏性和检测线性范围，又减少重金属污染。同时科研工作者还开发了相应仪器检测快诊试纸条的方法，从而使层析免疫检测结果显示更客观，使层析免疫技术推广到更大的应用空间。

现有技术的检测卡，其采用的设计方式是在硝酸纤维素膜一端放置吸水垫，另一端放置标记物垫，在标记物垫上依次放置滤物垫(如滤血垫)、样品垫和加样孔。硝酸纤维素膜与吸水垫搭接的重叠宽度为1-2mm，与标记物垫搭接的重叠宽度为1-2mm。当样本液、样本稀释液加入加样孔后，样本、标记物和稀释液均仅向吸水垫方向侧流层析。通过加样量和免疫反应时间两维控制的方式，确保检测结果的准确性和精密性。在应用过程中和大量试验，发现一个问题，由于被测样本与标记垫中的标记物反应时间短，样本液与标记垫中的标记的抗原或抗体反应在吸水垫的引力作用下，免疫反应形成梯度分布，并存在一个“未能反应的死角”，尤其当样本基质之间的粘稠差异较大时，使标记垫中的标记物由于参加免疫反应的液量不一致，“死角”问题更突显，导致渗透释放到硝酸纤维素膜的被测的样本和标记的抗原或抗体的总量产生偏差，直接影响检测结果的准确性和稳定性。因此，如何解决上述问题成为本领域人员研究的重点。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种心型脂肪酸结合蛋白快速检测试纸条。

本发明所提供的心型脂肪酸结合蛋白快速检测试纸条，包括PVC底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、标记物垫、样品垫和稀释液垫；所述硝酸纤维素膜固定在PVC底板上，所述硝酸纤维素膜一端搭接吸水垫，另一端搭接稀释液垫；所述标记物垫放置在所述硝酸纤维素膜上且位于所述稀释液垫前方，所述吸水垫的方向定义为前方；所述标记物垫上设置所述样品垫；在所述硝酸纤维素膜上从标记物垫到吸水垫依次设置检测线(T线)和质控线(C线)；在所述标记物垫和检测线(T线)之间设置定量标识线(M线)；所述标记物垫上包被有标记物标记的鸡IgY、标记物标记的心型脂肪酸结合蛋白抗体；所述质控线处包被羊抗鸡IgY的IgG，所述检测线处包被心型脂肪酸结合蛋白抗体。

作为优选，所述样品垫上面可设置相应的滤物垫，如滤血垫等。

作为优选，所述标记物垫上的标记物为胶体金、荧光素、镧系荧光、彩色乳胶、量子点、上转换荧光物质、磁荧光微球、以及酶标记、化学发光等示踪物质，也包括无需标记示踪物的试纸侧流反应体系。

作为优选，所述标记物垫上还加入色素，以显示待测样本液侧流过程，便于肉眼观察或仪器自动监测控制。

作为优选，当色素被稀释液冲洗干净后，在稀释液耗尽后，色素再次流入检测窗口时，应停止结果判读。

作为优选，所述硝酸纤维素膜与所述吸水垫搭接的重叠宽度为1-2mm；所述硝酸纤维素膜与所述稀释液垫搭接的重叠宽度为1-2mm。标记物垫放置在稀释液垫前方，并在标记物垫和稀释液垫之间保留1-10mm硝酸纤维素膜裸露空隙。

作为优选，所述定量标识线(M线)置于T线和标记物垫之间可视窗上，便于目测和自动检测仪器识别，以控制提示稀释液的加入时间。

所述定量标识线(M线)设定涵盖：满足设定的加样量、满足设定的加样后第一次免疫反应延时时间、样本液迹移动到壳体上指定的定量标识线(M)位置，或者样本液迹出现在检测窗口。

根据本发明的一个实施例，所述快速检测试纸条为心型脂肪酸结合蛋白检测试纸条；所述标记物垫上包被有标记物标记的鸡IgY、标记物标记的心型脂肪酸结合蛋白抗体，所述标记物具体可为镧系荧光微球；所述质控线处包被羊抗鸡IgY的IgG，所述检测线处包被心型脂肪酸结合蛋白抗体。

本发明还提供一种心型脂肪酸结合蛋白快速检测卡。

所述快速检测卡：包括外壳和设置在所述外壳内的本发明的快速检测试纸条；所述外壳包括上壳盖和下壳盖，上壳盖与下壳盖扣合；且在上壳盖对应所述试纸条中的检测线“T”和质控线“C”的区间设置检测窗，对应所述样品垫处设置加样孔，对应所述稀释液垫处设置清洗孔；在靠近加样孔侧的所述检测窗边沿和“T”线之间设置“定量标识线”，并在对应的壳体上设置标记。

作为优选，加入样本液后，液迹在达到定量标识线(M线)后，再在清洗孔加入稀释液。所述定量标识线(M线)设定涵盖：满足设定的加样量、满足设定的加样后第一次免疫反应延时时间、样本液迹移动到壳体上指定的定量标识线(M)位置，或者样本液迹出现在检测窗口。

作为优选，加入样本液后，在设定时间内液迹仍不能达到定量标识线的可再补加一些样本，使其液迹能到达定量标识线。确保参加免疫反应的样本液一致。这项优选尤其对基质粘稠样本很重要。

作为优选，当样本液加入后，样本液经过滤物垫、样本垫和标记物垫后，样本液会沿着硝酸纤维素膜向吸水垫和稀释液垫两个方向侧流层析。这种两个侧流层析方向的特征与现有技术具有本质差异：

(1)所述要求，由于增加向“稀释液垫””方向流动，样本与标记垫反应后的液迹不会很快到达T线。随着样本液的耗尽，渗透入硝酸纤维素膜的样本液和标记物将渐渐减慢直至停滞，这个停滞缓冲过程，相比现有技术，增加了样本液和标记物偶联的抗原(或抗体)结合反应时间，达到提高灵敏度的作用

(2)由于双侧流，被测样本与标记的抗原(或抗体)以标记垫的中心对称分布均匀展开，可改善单侧流形成“反应死角”的现象；

(3)在控制加样量、加稀释液量以及控制免疫反应时间的基础上，增加通过“定量标识线(M)”对第一次的免疫复合物的液量可实施准确的定量控制。

与现有技术中样本液和标记物都是趋于全部释放到硝酸纤维素膜上不同，本发明是在加入样本液后，标记物随样本液流入硝酸硝酸纤维素膜之后，在液迹侧流到定量标识线(M)时，“定量”的样本液和标记物渗透到硝酸纤维素膜，此时标记物垫处于半干半湿状态，标记物垫、样品垫和滤物垫的吸水性远远低于硝酸纤维素膜。因此，当稀释液垫在加入稀释液后，硝酸纤维素膜的湿度将大于样品垫和标记物垫，未进入硝酸纤维素膜的剩余标记物和样本液只能有极少量向层析膜中渗透。稀释液只能将仅存于硝酸纤维素膜上的那部分样本液和标记物层析至吸水垫，故本发明快速检测卡可精确控制进入硝酸纤维素膜的样本液量。现有技术，虽然定量加样，但由于样本之间基质差异，导致进入硝酸纤维素膜的样本总量存有差异，直接影响检测结果的准确性和稳定性。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明提供的试纸条及检测卡结构简单，设计合理，通过加样孔加样品、清洗孔加稀释液，由于稀释液不经过样品垫、滤物垫和标记物垫，可减少标记物与样本溶液结合液从标记物垫中二次释放。并且要求在加入样本液后的液迹到达定量标识线(M)后，再从清洗孔加稀释液的方式，可以很精确的控制样本与标记物垫免疫结合反应的液量，不但提高被检测物的灵敏性、精密性，而且还保留了快诊检测方法的快速和方便特性。

作为优选，在标记物垫上加入色素，用于示踪标记物释放过程。当样本与标记物结合溶液的带有颜色的液迹，侧流到定量标记线(M)时，提示加稀释液；当稀释液层析完后，随着硝酸纤维素膜湿度减少，残留在标记物垫上的标记物和样本结合液可能又开始向膜上渗透，当再次看到有色的液迹开始出现时，应停止对结果判读。

附图说明

图1是本发明提供的快速定量试纸条的结构示意图；

图2是本发明检测卡外壳的俯视图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。

如图1所示，一种快速检测试纸条，包括PVC底板1、吸水垫2、硝酸纤维素膜3、标记物垫5、样品垫8、滤物垫9和稀释液垫4；所述硝酸纤维素膜3固定在PVC底板1上，所述硝酸纤维素膜3左端搭接所述吸水垫2，右端搭接所述稀释液垫4；所述标记物垫5放置在所述硝酸纤维素膜3上且位于所述稀释液垫4前方，所述吸水垫2的方向定义为前方；并在所述标记物垫5和稀释液垫4之间保留了1-10mm硝酸纤维素膜裸露空间；在所述标记物垫5上设置所述样品垫8；在所述硝酸纤维素膜3上所述吸水垫2与标记物垫5之间的区间的沿着从标记物垫5到吸水垫2方向依次设置检测线(T线)7和质控线(C线)6，在所述标记物垫5和检测线(T线)7之间设置定量标识线(M线)13。

如图2所示，一种双孔快速定量检测卡，包括外壳14和设置在所述外壳14内的上述双孔快速定量试纸条；在外壳的上壳上对应检测线7和质控线6的区间设置检测窗口10；在检测窗口边沿设置定量标识线(M线)13(也可用检测窗边沿做定量标识线)；对应样品垫处设置加样孔11，对应稀释液垫4处设置清洗孔12。

所述标记物垫5上的标记物为胶体金、荧光素、镧系荧光、彩色乳胶、量子点、上转换荧光物质、磁荧光微球、以及酶标记、化学发光等示踪物质，也包括无需标记示踪物的侧流反应体系。

本检测卡适用面很广，如人类健康、动物疾病、植物疾病、食品安全、环境安全、毒品检测等领域。

本发明还提供了上述快速检测卡检测样本的方法。

本发明所提供的检测样本的方法，包括下述步骤：从所述快速检测卡的加样孔加入样本液，然后待样本液水印移动到所述检测卡试纸条中的定量标识线，再从清洗孔加入稀释液，最后通过检测窗口观测或通过相应仪器进行判读结果。

所述仪器如金标读数仪、荧光分析仪、上转换分析仪等。

具体使用时，从加样孔11加入样品液(一般样品液加入量为5-50μL)，样品液经过滤物垫9、样品垫8和标记物垫5后进入硝酸纤维素膜3，由于稀释液垫4和吸水垫2均为干燥状态，并且样品垫8和标记物垫5的液体承载量之和远小于两侧的吸水垫2和稀释液垫4，因此样品液会带着标记物向层析膜两侧双向渗透，直至耗尽，使包含免疫反应复合物标记物的样品液将停留在硝酸纤维素膜3上的定量标识线附近。相比现有技术，本发明使样本液与标记物垫中偶联的生物原料获得更多的反应时间，且不会到达检测线7。当样品液与标记物经过一定反应时间后(一般为0.5-5分钟)样本液流动的液迹出现在检测窗口的定量标识线(M)时，将稀释液(稀释液可以是纯净水，也可以是PBS缓冲液)加入清洗孔12，稀释液首先经过稀释液垫4，稀释液垫4中可包含用于消除非特异性反应的试剂组份(如阻断剂)，稀释液与其混合后进入硝酸纤维素膜3，将已经释放的带有标记所示踪物的样本免疫复合液进行稀释，在吸水垫2作用下，随着稀释液向吸水垫2方向流动，与T、C线上包被的抗原(或抗体)进行免疫结合，并被捕获停留在T、C线上，剩余物质通过侧向层析继续在硝酸纤维素膜上流动被吸水垫吸收，直至完成免疫层析。通过检测窗10观测或通过仪器检测、判读。

在初始状态硝酸纤维素膜3是处于干燥状态，样品液和标记物会快速释放到硝酸纤维素膜3上，基本不受样品差异影响，之后残留在标记物垫5中的标记物和样品液会缓慢进入到硝酸纤维素膜3，此时的释放过程的快慢受样品差异影响较大，会影响免疫层析的稳定性。基于此，本发明将加样孔设置在硝酸纤维素膜中间偏稀释孔位置，样品液和标记物渗透到层析膜上后会向两侧层析，直至样本液耗尽并停留在层析膜定量标识线附近，此时，加入稀释液，由于硝酸纤维素膜3的湿度大于标记物垫5，标记物垫5中残留的标记物向硝酸纤维素膜3中继续释放，其量与开始两侧分流停在硝酸纤维素膜3的量是极少的。

本发明通过稀释液注入后终止标记物继续释放的双孔结构设计，可根据要求阻止样品液和标记物释放到硝酸纤维素膜3中，确保进入硝酸纤维素膜3的样品液和标记物的数量稳定，提高免疫层析法的稳定性和精密度。本发明通过样品液和稀释液分开加样的方式，可改善依靠样品液自清洗的清洗效率，最大限度地保证检测窗口10中硝酸纤维素膜3的背景洁净度。

本发明实现除控制第一次样本加样量、免疫反应时间定量外，再加一种对被测样本与标记物质反应量的控制，从而提高了侧流层析检测方法的灵敏度和精密度。

下面对本检测卡的制作过程进行具体说明，以下实施例均以检测心型脂肪酸结合蛋白为例，采用镧系荧光微球做为标记物。

下述实施例中：

鸡IgY购自杭州启泰生物科技有限公司；

羊抗鸡IgY的IgG购自杭州启泰生物科技有限公司；

心型脂肪酸结合蛋白抗体购自Hytest公司；

镧系荧光微球购自成都微瑞生物科技有限公司。

实施例1、制备心型脂肪酸结合蛋白检测卡

检测原理：

如图1所示的检测卡，在硝酸纤维素膜的质控线6处包被羊抗鸡IgY的IgG，检测线7处包被心型脂肪酸结合蛋白单抗。当含有心型脂肪酸结合蛋白样本加入时，经过标记物垫时，心型脂肪酸结合蛋白与标记有心型脂肪酸结合蛋白抗体的镧系荧光微球结合形成复合物，当流至定量标识线(M)，加稀释液让复合物在硝酸纤维素膜上流动，被T线上的心型脂肪酸结合蛋白抗体捕获，形成双抗体夹心复合物固定在T线上；当样本中不含有心型脂肪酸结合蛋白时，T线上的心型脂肪酸结合蛋白抗体不能与标记有心型脂肪酸结合蛋白抗体的镧系荧光微球形成夹心，T线就没有镧系荧光微球；标记有鸡IgY的镧系荧光微球被C线上的羊抗鸡IgY的IgG捕获，而使C线存有镧系荧光微球。经镧系荧光免疫分析仪检测，C线荧光值作为检测T线的参考值，其荧光强度基本为定值；T线的荧光值与被测样本中含有心型脂肪酸结合蛋白成正比。

制备心型脂肪酸结合蛋白检测卡：

步骤一，把硝酸纤维素膜(Sartorius CN140)粘贴在PVC底板上，采用点膜喷金专用机器在硝酸纤维素膜上喷涂已稀释至0.5mg/ml的羊抗鸡IgY的IgG形成质控线(C线)和已稀释至0.9mg/ml的心型脂肪酸结合蛋白抗体形成检测线(T线)，喷量为1μl/cm，然后在37℃的温度下烘制16小时；

步骤二，制备标记有鸡IgY的镧系荧光微球和标记有心型脂肪酸结合蛋白抗体的镧系荧光微球。将1mL的镧系荧光微球加入到5mL的MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液(0.05M，pH7.2)中，再加入10mg碳二亚胺(EDC)和10mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温反应30分钟后进行离心操作，将离心沉淀物用50mM硼酸缓冲液(pH8.2)复溶，加入2mg透析过的鸡IgY，在室温条件下搅拌反应24小时，然后离心、封闭后，再在稀释液中保存(保存环境温度为2～8℃)，即得标记有鸡IgY的镧系荧光微球；采用上述同样的方法标记心型脂肪酸结合蛋白抗体(Hytest公司)的镧系荧光微球；

步骤三，把标记有鸡IgY的镧系荧光微球和标记有心型脂肪酸结合蛋白抗体的镧系荧光微球分别稀释至浓度0.1μg/ml和3μg/ml混在一起，采用点膜喷金机器将其喷涂在聚酯膜上构成标记物垫，喷量为2.5μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；

步骤四，把标记物垫切成8mm长，样品垫也切成8mm长，然后通过双面胶叠加粘在一起，然后用连续切割机切成5mm宽的加样条，并把它们组装在检测卡外壳上盖的加样孔下面；

步骤五，把305mm长、12mm宽的稀释液垫和305mm长、17mm宽的吸水垫对应粘在PVC底板上的硝酸纤维膜两端(叠加的宽度均为1-2mm)，组装成大卡，再用连续切割机切成5mm宽的试纸条，装配在检测卡外壳下盖内，把检测卡的上、下盖扣合在一起即得到本心型脂肪酸结合蛋白检测卡。

进行检测时，在加样孔中加入40μL血清或血浆样本，3分种后样本液迹移至检测窗口的定量标识线(M线)，再在清洗孔中加入80μL稀释液层析11分钟，通过镧系荧光免疫分析仪即可获得检测结果。

制备心型脂肪酸结合蛋白检测标准曲线：

配置含有心型脂肪酸结合蛋白的校准液(Hytest公司)6份，浓度分别为0、1ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、100ng/ml、500ng/ml。将上述不同浓度的校准液40μL分别加入装配好的双孔检测卡的中间加样孔内，然后在后边加样孔中加入80μL稀释液，总层析免疫反应时间为15分钟，通过镧系荧光免疫分析仪进行检测，将6次得到的检测数据进行线性回归，制出心型脂肪酸结合蛋白的标准曲线。

该检测卡的使用：取新鲜待检样品(以某一阳性血清为例)，按实施例加样方式加入40μL样品，当液迹流到定量标识线，加80μL稀释液(PBS)免疫层析15min，然后用成都微瑞生物科技有限公司生产的WR-1608型荧光免疫分析仪对检测卡进行检测，获取检测线和质控线的荧光信号，荧光分析仪通过蓝牙把检测数据传到客户端，客户端根据检测数据计算出检测线的荧光信号强度值和质控线的荧光信号强度值，客户端通过扫描此批检测卡的条形码从云平台获得被检测心型脂肪酸结合蛋白标准曲线，再根据标准曲线与质控线和检测线的荧光信号强度值的对照关系计算得出待测样本中心型脂肪酸结合蛋白的含量。

检测结果为13.2ng/mL。按上述方法操作，当加入30μL样本和80uL稀释液时，稀释液为PBS，检测结果为12.9ng/mL。结果显示样本加入量偏差，对结果影响不大。

重复性实验数据：将上述样本按40μL加入样本，然后加入80μL稀释液，重复10次结果分别为：13.2ng/mL、13.0ng/mL、13.6ng/mL、13.5ng/mL、12.6ng/mL、13.2ng/mL、13.3ng/mL、13.0ng/mL、12.8ng/mL、12.7ng/mL，偏差小于4％。

灵敏度实验：将心型脂肪酸结合蛋白的校准液(Hytest公司)浓度分别为5ng/ml的标准样本稀释10倍、20倍、40倍、80倍和160倍，包括原液，分别加样和检测，结果如下：5.39ng/mL、0.61ng/mL、0.27ng/mL、0.12ng/mL、0.03ng/mL。结果证明灵敏度能够到达0.03ng/mL。

上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不限以限制于本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种心型脂肪酸结合蛋白快速检测试纸条，包括PVC底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、标记物垫、样品垫和稀释液垫；所述硝酸纤维素膜固定在PVC底板上，所述硝酸纤维素膜一端搭接吸水垫，另一端搭接稀释液垫；所述标记物垫放置在所述硝酸纤维素膜上且位于所述稀释液垫前方，所述吸水垫的方向定义为前方；所述标记物垫上设置所述样品垫；在所述硝酸纤维素膜上从所述标记物垫到所述吸水垫依次设置检测线和质控线；在所述标记物垫和检测线之间设置定量标识线；所述标记物垫上包被有标记物标记的鸡IgY、标记物标记的心型脂肪酸结合蛋白抗体，所述质控线处包被羊抗鸡IgY的IgG，所述检测线处包被心型脂肪酸结合蛋白抗体。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述样品垫上设置滤物垫。

3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于：所述标记物垫上的标记物为示踪物质或无需标记示踪物的侧流反应体系；

所述示踪物质选自下述至少一种：胶体金、荧光素、镧系荧光、彩色乳胶、量子点、上转换荧光物质、磁荧光微球、酶标记物、化学发光物质。

4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于：所述标记物垫上加入色素。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的试纸条，其特征在于：所述硝酸纤维素膜与所述吸水垫搭接的重叠宽度为1-2mm；所述硝酸纤维素膜与所述稀释液垫搭接的重叠宽度为1-2mm；在标记物垫和稀释液垫之间保留了1-10mm硝酸纤维素膜裸露空间。

6.一种心型脂肪酸结合蛋白快速检测卡，包括外壳和设置在所述外壳内的权利要求1-5中任一项所述的试纸条；在所述外壳上对应所述试纸条中检测线和质控线的区间设置检测窗；对应样品垫处设置加样孔，对应稀释液垫处设置清洗孔；在靠近加样孔侧的所述检测窗边沿和检测线之间设置定量标识线，并在对应的壳体上设置标记。

7.根据权利要求6所述的快速检测卡，其特征在于：所述外壳包括上壳盖和下壳盖，上壳盖与下壳盖扣合，检测窗、加样孔和清洗孔以及定量标识线设于上壳盖上。

8.利用权利要求6或7所述的快速检测卡检测样本的方法，包括下述步骤：从所述快速检测卡的加样孔加入样本液，然后待样本液迹移动到所述检测卡试纸条中的定量标识线，再从清洗孔加入稀释液，最后通过检测窗口观测或通过仪器进行判读结果。

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