CN112924680A - 一种布鲁氏菌抗体快速定量检测卡及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种布鲁氏菌抗体快速定量检测卡及检测方法，包括安装在外壳内的PVC底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、标记物垫、样品垫和稀释垫，所述硝酸纤维素膜固定在PVC底板上，在硝酸纤维素膜左端搭接吸水垫，右端搭接稀释垫，在硝酸纤维素膜中部靠右的位置设置标记物垫，标记物垫上设置样品垫，在硝酸纤维素膜上吸水垫与标记物垫之间设置质控线和检测线；上外壳对应检测线和质控线开设视窗孔，视窗孔一侧设置定量标识线，对应样品垫开设加样孔，对应稀释垫开设清洗孔。本发明通过加样孔加样本，清洗孔加稀释液的方式以及设置定量标识线精确控制免疫结合液，不但能提高检测灵敏性、精密性，而且还保留检测方法的快速和简便特性。

Description

一种布鲁氏菌抗体快速定量检测卡及检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测卡，特别是涉及一种布鲁氏菌抗体快速定量检测卡及检测方法。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌所引起的一种高传染性的人畜共患病。通过直接接触、消化道、呼吸道等途径传染该病。布病可严重危害人类健康，并阻碍畜牧业发展，影响全球经济贸易。我国传染病防治法法定布鲁氏菌病属于乙类传染病，列为职业病；我国动物防疫法法定布鲁氏菌病为动物二类疫病管理传染病，羊是人兽之间布鲁氏菌病的主要传染源。在羊布病疫区，人群感染率可高达42％，患病率高达7％。近些年，该病的疫情出现明显回升，在世界范围内呈现“再燃”流行。布鲁氏菌病广泛流行于世界许多国家，高发地区为地中海地区，亚洲，中南美洲等。全世界每年新发病例约50万。新中国成立前本病流行严重，新中国成立后成立了专门防治机构，发病率已明显减少，但自1994年以来，很多已经基本控制的地区又有新的人畜布鲁氏菌病流行，如山东省滨州地区，河北省磁县以及山西省，辽宁省等。产生疫情回升的主要原因是“不经检疫家畜的自由贸易，交换和流动”。此外，放松对乳及肉等畜产品的监督、管理、消毒，家畜不能及时、广泛免疫，以及对布鲁氏菌病防治松懈麻痹等都是重要原因。因此，我们必须加强对布鲁氏菌病的防治，以期达到在全国范围内长期基本控制的目标。由于布氏菌给畜牧业发展造成严重破环并威胁到人类的健康，再加上布氏菌属于胞内寄生菌，抗生素治疗并不能达到较理想效果，使用疫苗是控制布氏菌病的最有效方法，检测疫苗产生抗体是监查疫苗免疫效果和防止感染的有效途径。

目前市场上大量使用检测布鲁氏菌抗体酶标试剂盒。酶标试剂盒需要酶标仪、温育反应条件、多次洗板等，检测线性范围窄、对操作工作环境和专业技术人员要求较高，另外检测样本还需要复杂的前处理，如采集血液，分离血清等；而快速胶体金虽然检测方便，不需专业技术人员和现场检测，但其检测的灵敏度低，且只能定性，检测线性范围窄。因此，研制快速、便捷、可在现场和野外进行精确检测布病抗体的定量检测技术显得尤为重要。。

发明内容

本发明的目的就是提供一种布鲁氏菌抗体快速定量检测卡及检测方法，能完全解决上述现有技术的不足之处。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

一种布鲁氏菌抗体快速定量检测卡，包括安装在外壳内的布鲁氏菌抗体检测条，该布鲁氏菌抗体检测条包括PVC底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、标记物垫、样品垫和稀释垫，所述硝酸纤维素膜固定在PVC底板上，在硝酸纤维素膜左端搭接吸水垫，右端搭接稀释垫，在硝酸纤维素膜中部靠右的位置设置标记物垫，标记物垫上设置样品垫，在硝酸纤维素膜上吸水垫与标记物垫之间包被检测线和质控线；

标记物垫上浸染标记布鲁氏杆菌脂多糖LPS的镧系荧光微球和标记鸡IgY抗体的镧系荧光微球；在检测线上包被布鲁氏杆菌脂多糖LPS单抗，质控线上包被羊抗鸡IgY抗体的IgG。

作为优选，所述样品垫上可设有滤物垫(如测全血，滤物垫为滤血垫)。

作为优选，所述外壳包括上盖和下盖，上盖与下盖扣合，在上盖上对应检测线和质控线开设视窗孔，对应样品垫开设加样孔，对应稀释垫开设清洗孔。

作为优选，所述视窗孔一侧设置定量标识线(M)。

作为优选，所述定量标识线(M)为一根细实线。

作为优选，所述标记物垫中加有色素物质。这种设计使样本与抗原抗复合液侧流过程的液迹更明显。通过“液迹”控制复合物的液量、加稀释液时间和控制检测时间，提高试剂检测的敏感性和精密性，实现精准检测。具体操作：通过在视窗孔看到或自动检测仪器监测到含有色素的结合液迹到达定量标识线(M)时，提示加稀释液(或清洗液)；当视窗孔再次看到色素时，应停止对检测结果判读。

一种布鲁氏菌抗体快速定量检测方法，包括上述的快速检测卡，从加样孔加入样品液，当液迹到达定量标识线时，向清洗孔中加入稀释液，等待检测线和质控线免疫反应层析，最后通过视窗孔观测或通过仪器进行检测、判读结果

现有层析技术采用的方式是硝酸纤维素膜一端设置吸水垫，另一端设置标记物垫，在标记物垫上由下至上依次设置样品垫和加样孔。无论是样本还是样本稀释液在加入加样孔后，样本、标记物和稀释液在吸水垫的引力作用下，迅速向吸水垫方向侧流，由于样本基质之间的差异很大，因此样本垫中后侧的部分标记抗原(或抗体)不能完全地与加入的样本液进行充分免疫反应，往往留有没有反应的“死角”，导致在渗透释放到检测线(T线)的样本总量产生偏差，从而直接影响检测结果的精密性和稳定性。

与现有技术不同，本发明提供了一种布鲁氏菌抗体快速定量检测卡，在硝酸纤维素膜一端设置吸水垫，另一端设置稀释垫，标记物垫设置在稀释垫前方(吸水垫方向为前方)，并在标记物垫和稀释垫之间保留了5～10mm硝酸纤维素膜裸露空间。标记物垫上依次设置样品垫、滤物垫、加样孔，稀释垫上方设置清洗孔。当样本加入加样孔后，样本经过滤物垫、样本垫和标记物垫后，样本与标记的抗原或抗体免疫反应复合液，在吸水垫和稀释液垫作用下，沿着硝酸纤维素膜向吸水垫和稀释垫两个方向侧流层析。

采用两个方向扩散层析复合液的特征与现有技术具有本质差异，加入样本的量较少(一般为5-50uL)，渗透入硝酸纤维素膜的样本的免疫复合液的流速会减慢直至停滞，这个停滞过程相比现有技术而言，就增加了样本和标记抗原或抗体物免疫复合反应时间，可达到提高灵敏度的作用。

另一方面，与现有技术中免疫反应复合液快速释放到硝酸纤维素膜(T)线上不同，本发明在加入样本后，免疫反应复合液流入硝酸纤维素膜之后，此时，标记物垫处于半干半湿状态，标记物垫、样品垫和滤物垫的吸水性远远低于硝酸纤维素膜，因此，当稀释垫中加入稀释液后，在吸水垫的作用下，稀释液带着复合液顺着硝酸纤维素膜向前侧流，来不及流入样品垫和标记物垫，稀释液只能将仅存于硝酸纤维素膜上的那部分样本和复合物稀释侧流至吸水垫，而未进入硝酸纤维素膜的剩余复合物和样本液只有极少量向硝酸纤维素膜中渗透，不会对检测结果造成影响，从而保证了检测的稳定性，提高检测的精密性。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

一方面，采用中间的加样孔中加待测样品，清洗孔加稀释液的方式，不但可提高被检测物的灵敏性、精密性，而且还保留了快诊检测方法的快速和方便特性。另一方面，通过设置定量标识线(M)精确控制样本量。

附图说明

图1是本发明的结构示意图；

图2是外壳的俯视图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的说明。

如图1和图2所示，一种布鲁氏菌抗体快速定量检测卡，包括安装在外壳9内的布鲁氏菌抗体检测条。所述的布鲁氏菌抗体检测条包括：PVC底板1、吸水垫2、硝酸纤维素膜3、稀释垫4、标记物垫5、质控线6、检测线7和样品垫8。

所述硝酸纤维素膜3，固定在PVC底板1上，在硝酸纤维素膜3左端搭接吸水垫2，右端搭接稀释垫4，在硝酸纤维素膜3中部靠右的位置设置标记物垫5，标记物垫5上设置样品垫8和滤物垫14，在硝酸纤维素膜3上吸水垫2与标记物垫5之间设置质控线6和检测线7。外壳9上对应检测线7和质控线6开设视窗孔10，并在视窗孔10右侧设有定量标识线(M)13为一根细实线，对应样品垫8开设加样孔11，对应稀释垫4开设清洗孔12。

所述吸水垫2与硝酸纤维素膜3的搭接宽度为1～2mm，稀释垫4与硝酸纤维素膜3的搭接宽度为1～2mm，标记物垫5与稀释垫4之间有5～10mm的间距。

所述标记物垫5上喷置标记镧系荧光纳米微球的布鲁氏杆菌脂多糖LPS和鸡IgY抗体；在检测线7上包被布鲁氏杆菌脂多糖LPS单抗，质控线6上包被羊抗鸡IgY抗体的IgG。

作为一种优选的方案，所述标记物垫5为加有色素的标记物垫。所述外壳9包括上盖和下盖，上盖与下盖扣合，且视窗孔10、加样孔11和清洗孔12以及定量标识线(M)13位于上盖上。

根据检测样本需要，在所述样品垫8上方，可设有滤物垫14。

在检测时，从加样孔11加入样品液，一般加样液量设计为5～60μL，具体要求：大于样品垫8和标记物垫5的液体承载量之和、远小于加样量两侧的吸水垫2和稀释垫4之和。具体加样量设计要求：加入样品液后，经过样品垫8和标记物垫5后进入硝酸纤维素膜3，由于此时稀释垫4和吸水垫2均处于干燥状态，加样液会带着样本中布鲁氏杆菌抗体组分与标记荧光微球的布鲁氏杆菌脂多糖LPS免疫反应的复合物和鸡IgY抗体物垫里的向硝酸纤维素膜3两侧渗透，停留在硝酸纤维素膜3的定量标识线(M)13附近，且不会到达检测线7。这样可使检测样品中的组分和标记物耦联的布鲁氏菌脂多糖LPS抗原在硝酸纤维素膜3上获得更多的反应(一般控制在0.5～5分钟)。当样本流动的液迹出现在定量标识线(M)13后，再将稀释液(稀释液可以是纯净水，也可以是PBS缓冲液)加入清洗孔12，稀释液先经过稀释垫4，稀释垫4中可包含用于消除非特异性反应的试剂组份(如阻断剂)，稀释液与其混合后，进入硝酸纤维素膜3，与已经释放到硝酸纤维素膜3内的样本与抗原或抗体标记物免疫反应复合物作用，消除一些非特异的物质的影响，并在吸水垫2的作用下，随着稀释液向吸水垫2方向流动，与检测线7和质控线6上包被的抗原(或抗体)进行免疫结合，并被捕获停留在检测线7和质控线6上。完成免疫反应后，通过荧光免疫分析仪进行荧光强度测定，即可获得被测样本中布鲁氏菌抗体的含量。

免疫反应原理表明：初始状态的免疫反应受样品基质差异的影响比较少，即当硝酸纤维素膜3为干燥状态是，样品液和标记物会快速释放到硝酸纤维素膜3上，受样本的基质影响少，残留在标记物垫5中的标记物和样品液仍有缓慢进入到硝酸纤维素膜3，此时的释放过程的受样品基质差异影响就较大，直接影响免疫层析的稳定性。基于此，本发明将加样孔11设置在硝酸纤维素膜3中间偏清洗孔12的位置，样品液和标记物渗透到硝酸纤维素膜3上后会向两测层析，甚至样本耗尽并停留在硝酸纤维素膜3上，并通过延迟或满足预设条件后加入稀释液的方式，增加免疫反应时间(即样本与标记物之间的反应时间)，从而提高了检测灵敏度和精密度。

本发明通过稀释液注入后终止标记物继续释放的双孔结构设计，以及增加控制结合液量的定量标识线(M),控制进入硝酸纤维素膜3的样品与标记物免疫反应的复合液的量，可以提高布鲁氏菌抗体检测的敏感性和精密性。本发明通过样品液和稀释液分开加样的清洗方式，可改善依靠样品液自清洗的清洗效率，减少硝酸纤维素膜3的背景洁净度，提高检测试剂的敏感性。

实施例：布鲁氏杆菌抗体镧系荧光检测卡

(一)检测原理

布鲁氏杆菌抗体检测卡采用竟争免疫法的原理。检测卡如图1、2所示，NC膜6、7分别包被羊抗鸡IgY的IgG、布鲁氏杆菌脂多糖LPS单抗；当加样孔11加入样本时，样本液流经标记物垫5布鲁氏杆菌抗体与标记有布鲁氏杆菌脂多糖LPS的镧系荧光微球结合形成复合物，侧流至13(M)处，再加稀释液。含有布鲁氏杆菌抗体的让NC膜上的复合物流动到C、T线，标记镧系荧光微球的布鲁氏杆菌脂多糖LPS就不能被T线包被的布鲁氏杆菌脂多糖LPS的单抗捕获，T线不显荧光；当样本中不含有布鲁氏杆菌抗体时，T线上的布鲁氏杆菌脂多糖LPS单抗就能捕获标记有布鲁氏杆菌脂多糖LPS的镧系荧光微球，从而使T线留有镧系荧光微球，T线的荧光微球的量与样本中含有布鲁氏杆菌抗体的量成反比；标记有鸡IgY的镧系荧光微球被C线上的羊抗鸡IgY的IgG捕获，而使C线留有镧系荧光微球，C线的荧光微球的量与样本中布鲁氏杆菌抗体的量无关，用于参比内标。经荧光仪检测T、C线的荧光信号，即可获地得检测样本中布鲁氏杆菌抗体的含量。

(二)布鲁氏杆菌抗体镧系荧光检测卡制备

步骤1把NC膜(Sartorius CN140)粘贴在PVC底板上，采用点膜喷金专用机器在NC膜上喷涂已稀释至0.3mg/ml的羊抗鸡IgY的IgG形成质控线(C线)和已稀释至0.5mg/ml的布鲁氏杆菌脂多糖LPS单抗形成检测线(T线)，喷量为1μl/cm，然后在37℃的温度下烘制16小时；

步骤2制备标记有鸡IgY的镧系荧光微球和标记有布鲁氏杆菌脂多糖LPS的镧系荧光微球。将1mL的镧系荧光微球加入到5mL的MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液(0.05M，pH7.2)中，再加入10mg碳二亚胺(EDC)和10mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温反应30分钟后进行离心操作，将离心沉淀物用50mM硼酸缓冲液(pH8.2)复溶，加入2mg透析过的鸡IgY，在室温条件下搅拌反应24小时，然后离心、封闭后，再在稀释液中保存(保存环境温度为2～8℃)，即得标记有鸡IgY的镧系荧光微球；采用上述同样的方法标记布鲁氏杆菌脂多糖LPS的镧系荧光微球；

步骤3把标记有鸡IgY和标记有布鲁氏杆菌脂多糖LPS的镧系荧光微球分别稀释至浓度0.1μg/ml和3μg/ml混在一起，采用点膜喷金机器将其喷涂在聚酯膜上构成标记物垫，喷量为2.5μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；

步骤4把标记物垫切成8mm长，样品垫也切成8mm长，然后通过双面胶叠加粘在一起，然后用连续切割机切成5mm宽的加样条，并把它们组装在检测卡外壳上盖的加样孔下面；

步骤5把305mm长、12mm宽的稀释垫和305mm长、17mm宽的吸水垫对应粘在PVC底板上的NC膜两端(叠加的宽度均为1-2mm)，组装成大卡，再用连续切割机切成4-5mm宽的试纸条，装配在检测卡外壳下盖内，把图示1、2的检测卡的上、下盖扣合在一起，即得到本布鲁氏杆菌抗体荧光检测卡。

(三)检测

取新鲜待检样品(以某一阳性血清为例)，按(二)加样方式加入50uL样品和80uL稀释液，免疫层析15min。采用成都微瑞生物科技有限公司生产的WR-1608S型高敏荧光分析仪对检测卡进行检测。手机客户端软件操控荧光分析仪检测，获得检测线和质控线的荧光信号传到云平台，依据预置的从云平台布鲁氏杆菌抗体“标准曲线”，大数据换算即时报告样本中布鲁氏杆菌抗体的含量。

上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种布鲁氏菌抗体快速定量检测卡，包括安装在外壳内的布鲁氏菌抗体检测条，其特征在于：该布鲁氏菌抗体检测条包括PVC底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、标记物垫、样品垫和稀释垫，所述硝酸纤维素膜固定在PVC底板上，在硝酸纤维素膜左端搭接吸水垫，右端搭接稀释垫，在硝酸纤维素膜中部靠右的位置设置标记物垫，标记物垫上设置样品垫，在硝酸纤维素膜上吸水垫与标记物垫之间包被检测线和质控线；

标记物垫上浸染标记布鲁氏菌脂多糖LPS的镧系荧光微球和标记鸡IgY抗体的镧系荧光微球；在检测线上包被布鲁氏菌脂多糖LPS单抗，质控线上包被羊抗鸡IgY抗体的IgG。

2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌抗体快速定量检测卡，其特征在于：所述外壳包括上盖和下盖，上盖与下盖扣合，在上盖上对应检测线和质控线开设视窗孔，对应样品垫开设加样孔，对应稀释垫开设清洗孔。

3.根据权利要求2所述的布鲁氏菌抗体快速定量检测卡，其特征在于：所述视窗孔一侧设置定量标识线(M)。

4.根据权利要求3所述的布鲁氏菌抗体快速定量检测卡，其特征在于：所述定量标识线(M)为一根细实线。

5.根据权利要求1所述的布鲁氏菌抗体快速定量检测卡，其特征在于：所述吸水垫与硝酸纤维素膜的搭接宽度为1-2mm，稀释垫与硝酸纤维素膜的搭接宽度为1-2mm，标记物垫与稀释垫之间有5-10mm的间距。

6.根据权利要求1所述的布鲁氏菌抗体快速定量检测卡，其特征在于：所述标记物垫中加入有色素物质。

7.一种布鲁氏菌抗体快速定量检测方法，包括权利要求1-6任一项所述的快速检测卡，其特征在于：从加样孔加入样品液，当液迹到达定量标识线时，向清洗孔中加入稀释液，等待检测线和质控线免疫反应层析，最后通过视窗孔观测或通过仪器进行检测、判读结果。

Images