FI60319B - Foerfarande foer paovisning eller bestaemning av antikroppar i kroppsvaetskor med hjaelp av kaenda antigener eller foer bestaemning av antigener med hjaelp av kaenda antikroppar fraon kroppsvaetskor samt medel foer utfoerande av foerfarandet - Google Patents

Description

Ε3^1 ΓΒΐ nu KUULUTUSJULKAISU z: Π Z Ί O

$ΒΓ<£ W (11>UTLÄeGNINGSSKIIIFT 6031 9 1¾¾¾ C <45> p?w;“-^JLa*U'7 10 13 1931 ^ (51) Kv.lk.3/lnt.a3 G 01 ^ 33/5^ SUOMI—FINLAND (21) P»tvnttlh»kumu»— ht«ntana6kitl»c 76l6l0 (22) Hakwntapttvt —AiKeknlngadag 09-06.76 (23) Alkupilvt—GUtlfh«ttdkg 09.06.?6 (41) Tullut luikituksi — BIMt offtntllg 11.12.76

Patentti- ja rukitterihallitu· .... ......... , . , . . . (44) Nlhrtvtkilpunon Ja kuuL|utkaliun pvm. — _ _o Al

Patent· och rugirterttyruluun ' ' AmMcm utlagd oeh utl^krifun publicurad 31.0ö. Ö1 (32)(33)(31) Pjrydutcy atuoikuus—Bugird prioritac 10.06.75

Tanska-Danmark(EK) 2598/75 (71)(72) Bent Weeke, Ttfll^sevej 20, DK-2700 Br^nshjSj , Tanska-Danmark(EK) (7^) Oy Kolater Ab (5*+) Menetelmä vasta-aineiden osoittamiseksi tai määrittämiseksi kehon nesteissä tunnettujen antigeenien avulla tai antigeenien määrittämiseksi tunnettujen vasta-aineiden avulla kehon nesteistä sekä väline menetelmän suorittamiseksi - Förfarande för pävisning eller bestämning av antikroppar i kroppsvätskor med hjälp av kända anti-gener eller för bestämning av antigener med hjälp av kända antikroppar fr&n kroppsvätskor samt medel för utförande av förfarandet

Keksinnön kohteena on menetelmä vasta-aineiden osoittamiseksi tai määrittämiseksi kehon nesteissä tunnettujen antigeenien avulla tai antigeenien määrittämiseksi tunnettujen vasta-aineiden avulla kehon nesteistä, jolloin kehon nestenäytettä sekoitetaan adsorptio-aineen kanssa, johon on adsorboitu antigeeniä, minkä jälkeen anti-geeneihin liittyneet vasta-aineet osoitetaan tai määritetään merkittyjen vasta-vasta-aineiden avulla.

Keksinnön kohteena on lisäksi menetelmän suorittamiseksi käytettävä väline.

On ennestään tunnettua osoittaa spesifisiä vasta-aineita kehon nesteissä edellä kuvatun kaltaisilla menetelmillä. Niinpä on tanskalaisessa patentissa n:o 120 109 ehdotettu-renetetaää veteen liukenevat- 2 6031 9 tornien, kemiallisesti tai biologisesti aktiivisten peptidi-johdannaisten valmistamiseksi, jotka kovalenttisten sidosten muodostamien siltojen avulla kytketään molekyyliketjuihin veteen liukenemattomissa polymeeriaineissa. Mainitusta patentista tunnetussa menetelmässä käytetään halogeenisyaania, esim. bromisyaania, siltojen muodostamiseksi. Polymorfista ainetta, kuten dekstraania, selluloosaa, esimerkiksi paperia tai agarosea, käsitellään halogeenisyaani-yhdisteellä sivuryhmien muodostamiseksi molekyyliketjuille , jotka sivuryhmät voivat reagoida peptideissä olevien aminoryhmien kanssa. Erilaisia valittuja antigeenejä voidaan kytkeä näihin sivuryhmiin, jolloin saadaan adsorptioaineita, jotka selektiivisesti voivat adsorboida spesifisiä vasta-aineita kehon nesteistä, nimittäin ko. antigeeniä vastaavia vasta-aineita.

Käytännössä voidaan polymeeriin kytkeä mielivaltaisia spesifisiä antigeenejä, siten, että voidaan saada adsorptioaineita, joilla on selektiivinen adsorptiokyky vastaavien vasta-aineiden suhteen.

Tätä menetelmää voidaan käyttää osoittamaan onko annetussa kehon nesteessä vasta-aineita, jotka reagoivat yhden tai useamman tietyn antigeenin suhteen. Adsorboituneiden vasta-aineiden osoittaminen voi tapahtua kytkemällä merkittyjä vasta-vasta-aineita, esim. radioaktiivisilla isotoopeilla merkittyjä vasta-vasta-aineita, jotka sen jälkeen määritetään isotooppilaskulaitteen avulla. Tällainen käytännössä kehitetty analyysimenetelmä tunnetaan nimellä RAST^P joka on lyhennys nimestä Radio-Allergo-Sorbent Test ja sitä käytetään allergisten reaktioiden diagnosoimiseksi määrittämällä yksinkertaisten allergeeni-spesifisten vasta-aineiden sisältö kehon nesteissä, edullisesti veriseerumissa. Nämä vasta-aineet, jotka ovat immuuniglobulii-neja, voivat olla tyyppiä IgE, IgG, IgA, IgM ja IgD.

Kuvatulla tunnetulla analyysi- tai diagnosoimismenetelmällä on erilaisia haittoja. Niinpä on adsorptioaineen valmistus ja esikäsittely hankala ja aikaavievä, samalla kun monimutkaisilla synteettisillä menetelmillä pitää kytkeä sivuketjuja molekyyliketjuihin polymeerissä. Halogeenisyaanin käyttö tätä tarkoitusta varten on epämiellyttävää ja vaarallista näiden reagenssien vähäisen pysyvyyden ja suuren myrkyllisyyden takia. Lisäksi on vaadittava allergeenimäärä s uuri.

Tämä keksintö pohjautuu havaintoon, että ei ole välttämätöntä kytkeä antigeenejä polymeeriketjuihin siltoja muodostavien sivuryh- 3 6031 9 mien kautta, vaan että sinänsä tunnetun adsorptioaineen, aluminiumhydroksidigee Iin , avulla voidaan saavuttaa niin tehokas sidos anti-geeneihin, että täten on mahdollista yksinkertaisella tavalla suorittaa kvantitatiivisia määrityksiä.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on siten tunnusomaista, että adsorptioaineena käytetään aluminihydroksidigee liä ja käytetään sellaista suhdetta kehon nesteen ja antigeeniä sisältävän aluminihydroksi-geelin määrien välillä, että komponentti, joka halutaan osoitta tai määrittää, kytkeytyy kvantitatiivisesti, jonka jälkeen aluminihydroksi— digeeli adsorboituneen antigeeni-vasta-ainekompleksin kanssa eristetään ja kytketään kvantitatiivisesti merkittyihin vasta-vasta-ainei-siin, jonka jälkeen antigeeni-vasta-ainekompleksiin kytketyt merkityt vasta-vasta-aineet rekisteröidään ja mitataan.

Aluminiumhydroksidigeeliä on halvalla saatavissa markkinoilla ja se on myrkytön ja vaaratonta käyttää. Antigeenien kytkeminen geeliin eli adsorptio on helppo suorittaa ja oleellisesti nopeampi kuin tunnetuilla adsorptioaineilla, jotka pohjautuvat paperiin tai Sephadex'iin. Menetelmä on myös osoittautunut allergeeneja säästäväksi, sikäli, että voidaan suorittaa 50-100 kertaa niin monta analyysiä painomäärää kohti allergeenia kuin tunnetulla RAST-menete 1-mällä. Keksinnön mukainen menetelmä on joustava, ja siinä käytetään samoja allergeeneja, joita toivotaan käytettävän diagnoosiin toisella tavalla, esim. annettuna ihoon ihokokeina tai tuotuna sairaaseen elimeen provokaatiokokeissa. Allergeeneihin kytkettyä aluminiumhyd’-roksidigeeliä voidaan jos halutaan, steriloinnin ja myrkyllisyys-opiliis ten tutkimusten jälkeen käyttää hyposensibilitaatiokäsitte-lyihin.

Tässä menetelmässä määritetään vasta-aineet edullisesti isotoopeilla merkittyjen vasta-vasta-aineiden avulla, samalla kuin tämä menetelmä on nopea ja mukava ja antaa hyvän tarkkuuden. Voidaan silti, jos niin halutaan, käyttää muita merkitsemismuotoja, kuten fluoroimismerkitsemistä tai entsyymin liittämistä.

Eräs aluminiumhydroksidigeeli, joka on osoittautunut hyvin sopivaksi ko. menetelmän toteuttamiseksi, on tavaramerkillä Alhydrogel (kuuluu firmalle Superfos AKI A/S) markkinoilla myytävä tuote.

On tosin tunnettua, että aluminiumhydroksidigeelit vaikuttavat voimakkaasti absorboivasti moniin orgaanisiin yhdisteisiin, kuten 4 6031 9 polypeptideihin, esim. myös allergeeneihin ja että geeli toimii apuaineena, vrt. tanskalainen patentti n:o 123 690. Aikaisemmin ei kuitenkaan ole ollut tunnettua, että tämänkaltaisilla geeleillä voidaan saavuttaa antigeenipitoisia adsorptioaineite, jotka sopivat kytkettäväksi spesifisten vasta-aineiden kanssa kehon nesteissä ja että tällöin voidaan saavuttaa varma analyysimenetelmä allergian diagnostisoimiseksi kehon nesteissä ja allergeeniuutteiden laadun tarkkailua varten. Tanskalaisesta kuulutusjulkaisusta DK 131 400, tunnetaan menetelmä määrättyjä allergeenejä vastaan kohdistuvien monnoglobuliinien (vasta-aineiden) osoittamiseksi tai määrittämiseksi in vitro. Tässä menetelmässä näytteet saatetaan kosketukseen veteen liukenemattoman polymeerin kanssa, johon on liitetty koe-allergeeni niin, että tämä reagoi vasta-aineen kanssa, jonka jälkeen antigeeniin liitetty vasta-aine osoitetaan tai määritetään merkittyjen vasta-vasta-aineiden avulla. Tämä menetelmä on sinänsä käyttökelpoinen ja antaa hyviä tuloksia, mutta se on varsin monimutkainen ja vaikea suorittaa, koska liittämiseen käytetty polymeerinen aine on varustettava reaktiivisilla ryhmillä, jotka voivat reagoida ko. koeallergeenin kanssa. Tämä tapahtuu aktivoimalla polymeeri bromi-syaanilla niin, että antigeenin kanssa muodostuu kovalenttisiä J sidoksia. Tämä rajoittaa oleellisesti menetelmän käyttökelpoisuutta käytännössä, ks. edellä kuvatut haitat käytettäessä bromisyaania.

US-patenttijulkaisusta 3 798 319 on tunnettua kiinnittää antigeenejä aluminihydroksidiin tarkoituksena valmistaa terapeuttisia valmisteita, joilla on heikentynyt vaikutus. Tällaisilla valmisteilla ei kuitenkaan ole tarkasti määriteltyä antigeenisisältöä eikä niitä sen johdosta voida käyttää diagnostisiin tarkoituksiin. Diagnosoimiseen ehdotetaan aluminihydroksidia sisältämättömiä vesi-uutteita, joilla ei ole keksinnön mukaiselle välineelle tunnusomaisia etuja.

Osoitettaessa vasta-aineita kehon nesteissä käytetään, kuten mainittiin, geelejä, joihin on adsorboitu spesifinen antigeeni tai spesifiset antigeenit, joiden suhteen potilaan allerginen reaktio halutaan osoittaa. Tällöin on mahdollista lyhyessä ajassa tutkia allergiset reaktiot suurelle määrälle erilaisia antigeenejä.

Keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi käytettävälle välineelle on tunnusomaista, että se koostuu aluminihydroksidigeelis-tä, jolle on adsorboitu määrätty tai määritettävä määrä antigeenejä.

5 6031 9 Tällainen aine on pysyvä pitkäaikaisessa säilytyksessä ja sitä voidaan yksinkertaisella tavalla käyttää veressä tai muissa kehon nesteissä olevien vasta-aineiden diagnosoimiseksi. Diagnoosia suorittavalla lääkärillä on näin ollen käytettävissä joukko valmisteita, jotka koostuvat aluminihydroksigeelistä, johon on liitetty allergeenejä tai muita erityyppisiä antigeenejä, jolloin lääkäri nopeasti voi todeta potilaan veriseerumin mahdollisen reaktion yhden tai usean käytettävissä olevan diagnostisen valmisteen kanssa.

Menetelmää voidaan käyttää myös antigeenien lajin tai määrän määrittämiseen nestenäytteiden avulla, jotka sisältävät tunnettuja vasta-aineita. Menetelmä mahdollistaa tällöin valmisteiden voimakkuuden ja laadun valinnan tai valvonnan, joita valmisteita tullaan käyttämään terapeuttisesti määrättyjä allergiamuotoja vastaan.

Keksinnön mukaista menetelmää valaistaan seuraavassa esimerkein .

Esimerkki 1 0,2 ml koirankarvoista saatua allergeeniuutetta, jonka väkevyys on 1:20 (valmistettu uuttamalla 1 osa koirankarvoja ja 20 osaa suolavettä, paino/tilav.) sekoitetaan 0,05 ml:n kanssa 2-%:sta aluminium-hydroksidigeeliä (AlhydrogeiS, Superfos A/S) ja 175 ml:n kanssa asetaatti-etikkahappopuskuria, pH = 7, 0,1 M/1 (lyhennetty seuraavassa A/E-puskuriksi). Seosta käännellään mekaanisesti verensekoittajassa n. 30 kertaa minuutissa yhteensä 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Senjälkeen seos lingotaan kierrosluvulla 3 000 r/min. (vastaa n.

2 000 g:tä) 2 minuutin ajan. Sakan päällä oleva neste imetään varovasti pois ja korvataan 2,5 ml :11a A/E-puskuria. Neste imetään pois uudelleen ja korvataan uudella 2,5 ml:n annoksella A/E-puskuria, ja tämä toimitus toistetaan yhteensä 4 kertaa. Viimeisen imemisen jälkeen liuotetaan pohjasakka uudelleen 2 ml:aan A/E-puskuria, johon on lisätty 0,3 % naudan seerumialbumiinia (Sigma) ja 1 % "tween 20:tä", joka on sorboitu aine, (lyhennetään seuraavassa A/E-puskuri + BSA + Tw). Tämä seos käytetään heti tai säilytetään 4°C:ssa myöhempää käyttöä varten. Käytettäessä otetaan 0,1 ml seosta, joka pannaan muoviputkeen ja lisätään 1 0,1 m potilaan seerumia. Seoksen annetaan seistä vähintäin 6 tuntia huoneen lämpötilassa, lingotaan senjälkeen 2 000 g:ssä 2 minuuttia, imetään sakan päällä oleva neste pois ja korvataan se 2,5 ml :11a A/E-puskuri + BSA + Tw. Sekoittamisen jälkeen suoritetaan linkoami-nen uudestaan, imetään sakan päällä oleva neste pois ja lisätään ^ ** ·* 6031 9 puskuria, tämä toimitus toistetaan yhteensä neljä kertaa. Viimeisen imemisen jälkeen lisätään 0,05 ml ^^1: llä merkittyä anti-IgE (mikä vastaa noin 5 nano Ci liuosta, jossa on 2,5 rnCi/mg anti-IgE). Seoksen annetaan seistä huoneen lämpötilassa vähintään 20 tuntia, minkä jälkeen sitoutumaton aktiviteetti poistetaan linkoamalla 2 000 g:ssä kaksi minuuttia, imetään sakan päällä oleva neste pois ja lisätään 2,5 ml A/E-puskuri + BSA + Tw, minkä jälkeen l.inkoaminen, imeminen ja lisääminen toistetaan yhteensä neljä kertaa. Viimeisen imemisen jälkeen lasketaan sidottu I-aktiivisuus ganunalaskimen avulla. Sopivan tarkkuuden saavuttamiseksi on tässä käytetty laskinta, joka on säädetty siten, että saadaan kokonaislaskentaluvuksi 50 000 käytetyllä määrällä merkittyä vasta-vasta-ainetta. Vasta-ainetta sisältämättömän sokean kokeen laskentaluku on tällöin noin 1 000, kun taas vasta-ainetta sisältävän positiivisen näytteen laskentaluku voi tyypillisesti olla 5 000-20 000, joka muodostaa analyysituloksen.

Potilasseerumisarjan tutkimukset erilaisten allergeeniuutteiden suhteen osoittivat yhtäpitävyyttä mainitun menetelmän tuloksien ja tunnetun RAST-mene te lmän välillä, jossa samat allergeenit on kytketty paperiarkkeihin.

Esimerkki 2

Heinäsii tepölyn , phleum pratense (engrotthale ) 2 allergeeniuu-*-tetta, joiden väkevyys oli 1:20 (siitepölyaineen paino : 0,9-%:sen suolaveden tilavuus) adsorboitiin aluminiumhydroksidigeeliin ja verrattiin seerumin avulla, joka oli saatu heinäsiitepölylie allergiselta potilaalta, jossa on tunnettu määrä vasta-ainetta heinäsiite-pölyn suhteen.

0,2 ml uutetta joko A:ta tai B:tä (lyhennys kahdelle heinä-siitepölyuutteelle) lisättiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla 0,05 ml:aan 2-%:sta Alhydrogel'iä ja 1,75 ml:aan A/E-puskuria. Seosta sekoitettiin 15 minuuttia verensekoittajassa, n. 30 kierrosta/min. huoneen lämpötilassa. Nopeudella 3 000 r/min. (n. 2 000 g) 2 minuutin ajan suoritetun linkoamisen jälkeen imetään sakan päällä oleva neste varovasti pois ja korvataan 2,5 ml: 11a A/E-puskuria, joka jälleen imetään pois jne. toistaen kaikkiaan neljä kertaa. Viimeisen imemisen jälkeen liuotetaan pohjasakka uudestaan 2 ml:aan A/E-puskuri + BSA + Tw. Näistä liuoksista valmistetaan laimennussarja, valmistamalla 1~> 10-, 100-, 1 000- ja 10 000-kertainen laimennus suoritettuna A/E-puskuri + BSA + Tw:lla. Laimentamattomasta liuoksesta ja 7 6031 9 laimennetuista liuoksista otetaan 0,1 ml:n näytteitä muovilasiin ja näihin sekoitetaan 0,1 ml seerumia, jonka vasta-aines.isältö phleum pratense'a vastaan on tunnettu. Kuten esimerkissä 1 reagoi seos vähintään 6 tunnin ajan huoneen lämpötilassa (18-24°C) se lingotaan jne.

kaikkiaan neljä kertaa. Viimeisen imemisen jälkeen lisätään 0,05 ml 12 5 I-anti-IgE (Phadebas RAST, Pharmacia, Uppsala tai vastaavaa radio-aktiivisesti merkittyä vasta-ainetta) ja annetaan seistä reaktiota varten vähintään 20 tuntia huoneen lämpötilassa. Senjälkeen seoksia lingotaan 2 000 g:ssa 2 minuutin ajan, sitoutumaton aktiviteetti poistetaan imemällä, huuhdellaan ja lingotaan kuten esimerkissä 1 selostettiin yhteensä neljä kertaa ja jäljelle jäänyt sidottu 125I-aktiviteetti lasketaan gammalaskimen avulla. Uutteiden A ja B eri laimennusten laskentalukujen perusteella voidaan suorittaa vertailu. Myös tässä otetaan analyysiin mukaan normaalin ihmisen seerumia, joka ei sisällä spesifistä vasta-ainetta phleum pratense'a vastaan (vertailuarvoksi).

Esimerkki 3

Hevoskarvojen ja-hilseen allergeeniuutteesta, jonka väkevyys on 1:10 (hevoskarvojen- hilseen paino : 0,9-%:sen suolaveden tilavuus), valmistetaan sarja laimennettuja liuoksia, jotka adsorboidaan alumi-niumhydroksidigeeliin, ja seerumin avulla, joka on saatu hevoskarvoilie allergiselta potilaalta, määritetään S-muotoinen ominaiskäyrä, josta on mahdollista arvioida sidotun allergeenin teho uutteesta.

Hevoskarva-hilse-uutteesta 1:10 tehdään 0,9-%:sella natrium-kloridilla sarja kymmen-kertaisia laimennuksia. 0,05 ml valmistetuista liuoksista sekoitetaan kukin 0,05 ml:n kanssa 2-%:sta Alhydroge1'ia ja 1,9 ml:n kanssa 0,9-%:sta nat ri umk lori di - li uos t a. Seoksia sekoitetaan 15 minuutin ajan verensekoittajass a nopeudella 30 r/min. huoneen lämpötilassa. Kierrosluvulla 3 000 r/min. (n. 2 000 g) 2 minuutin ajan suoritetaan linkoamisen jälkeen imetään sakkojen päällä olevat nesteet varovasti pois 3a korvataan 2,5 ml:11a 0,9-%:sta natriumklori -di-liuosta, joka jälleen imetään pois jne. toistaen yhteensä neljä kertaa. Viimeisen imemisen jälkeen liuotetaan pohjasakka uudelleen 5 ml:aan 0,9-%:sta natriumkloridi liuosta, 0,05 ml kutakin näistä liuoksista sekoitetaan 0,05 ml:n kanssa seerumia, joka on saatu hevos-karvoilie allergiselta potilaalta ja vertailua varten seerumin kanssa ei-allergiselta potilaalta(vertailu).

Seosten annetaan reagoida vähintäin 6 tuntia huoneen lämpötilassa (18-2ä°C) ne lingotaan jne. kaikkiaan neljä kertaa kuten esimerkis- 60319 • · 125

sä 1. Viimeisen imemisen jälkeen lisätään 0,05 ml I-anti-IgE

(Phadebas RAST, Pharmacia, Uppsala tai vastaavasti radioaktii vises ti merkittyä vasta-ainetta), ja annetaan seistä reagoimista varten vähintään 20 tuntia huoneen lämpötilassa.

Senjälkeen seoksia lingotaan 2 000 g:ssä 2 minuuttia, sitoutumaton radioaktiivisuus poistetaan imemällä, huuhdellaan ja lingotaan kuten esimerkissä 1 kuvattiin, yhteensä neljä kertaa ja jäljelle jäänyt I-aktiivisuus lasketaan gammalaskimen avulla.

Laskentalukujen pohjalta uutteiden eri laimennuksille ja uutteiden laimennukselle piirretään ominaiskäyrä hevoskarvojen ja hilseen uutteelle. Myös tässä otetaan analyysiin mukaan normaalin henkilön seerumi, joka ei sisällä spesifistä vasta-ainetta hevoskarva/hilsettä vastaan (vertailuarvoksi).

Tässä esimerkissä kuvattu analyysi on erittäin sopiva luonnehtimaan tiettyä uutetta ja tämän perusteella määrittämään kuinka paljon ailergeeniuutetta voidaan laimentaa ennen käyttöä ja antamaan maksimaalisen spesifisen vasta-aineen sitoutumisen, sekä siten laskenta-lukua. Analyysi sopii hyvin myös allergeeniuutteiden, jotka ovat samantyyppisiä mutta valmistettu eri tavalla, tehokkuuksien vertailuun .

Myös allegeeniuutteiden pysyvyys voidaan arvioida tällä mene-te lmällä.

Esimerkki *4

Vertailujärjestelmä, jossa on hevoskarvojen ja -hilseen uutetta sekä hevosen karvoille allergisen potilaan seerumin laimennuksia, kuvataan kaksinkertaisessa logaritmisessa koordinaattijärjestelmässä lineaarisena funktiona, joka sopii hyvin vertailukäyräksi menetelmää toteutettaessa.

0,05 ml hevoskarvan ja -hilseen uutetta pantiin muoviputkeen ja sekoitettiin 0,05 ml:n kanssa 2-%:sta aluminiumhydroksidia ja 2 ml:n kanssa TRIS 0,1 M, pH = 7,5, jossa oli 1 % Tween 20 (lyhennetään seuraavassa TRIS-T).

Sekoituksen jälkeen annetaan seistä huoneen lämpötilassa 15 minuuttia. Sitoutumattomat aineosat poistetaan senjälkeen linkoamalla 2 000 g:ssä 2 mimuutin ajan, jonka jälkeen suurin osa vapaasta sakan päällä olevasta nesteestä varovasti Poistetaan loppuosa poistetaan helpoimmin kääntämällä varovasti muoviputken pohja ylös ja kaatamalla vapaa neste. Tämä toimitus toistetaan kolme kertaa, samalla kun lisätään 2,5 ml TRIS-T ja lingotaan, imetään ja kaadetaan kuten kuvattiin.

6031 9 9

Viimeisen kaatamisen jälkeen "pesty" pohjasakka liuotetaan uudelleen 5 ml:aan TRIS-T, ja 0,05 ml jaetaan pienempiin muoviputkiin, minkä jälkeen 0,05 ml seerumilaimennuksia lisätään.

Seerumi laimennukset valmistetaan sekoittamalla positiivista seerumia, joka on saatu hevosen karvoille allergiselta potilaalta (merkitty 199 %:seksi vertailujärjestelmässä), normaalin seerumin kanssa, joka on saatu yhdeltä tai useammilta henkilöiltä, joilla ei ole allergiaa (merkitty 0 %:ksi vertailujärjestelmässä) suhteessa lav· /tilav.) : 1 + 0, 1 + 4, 1 + 24 ja 1 + 49 (vastaten spesifisen vasta-aineen väkevyyksiä: 100%, 20%, 4% ja 2%.

Seerumi reaktio saatetaan tapahtumaan kolmen tunnin aikana huoneen lämpötilassa (tai mielellään yli yön, ts. 18-22 tunnin aikana). Tämän jälkeen poistetaan sitoutumattomat seerumiaineosat lisäämällä 2,5 ml TRIS-T, linkoamalla 2 000 g:ssa 2 minuuttia ja imemällä varovasti sakan päällä oleva neste, jättäen kuitenkin jäljelle 0,2-0,3 ml vapaata sakan päällä olevaa nestettä, jotta pohjasakkaa ei leijutettaisi ylös imun aikana. Lisätään jälleen 2,5 ml TRIS-T, lingotaan ja imetään kaikkiaan kolme kertaa toistaen. Viimeisen varovaisen imemisen jälkeen kaadetaan loput vapaasta sakan päällä olevasta nesteestä poiskääntämällä varovasti kaikkien putkien pohjat ylös.

"Pestyyn" pohjasakkaan lisätään 0,05 ml 125I-anti-IgE (Pharmacia Phadebas RAST-isotooppiyksikköä tai vastaavaa merkittyä vasta-ainetta), ja seoksen annetaan seistä reaktiota varten vähintäin 20 tuntia huoneen lämpötilassa. Senjälkeen kun on lisätty 2,5 ml TRIS-T kaikkiin putkiin, lingotaan seoksia 2 000 g:ssä 2 minuuttia ja sitoutumaton aktiviteetti poistetaan imemällä, huuhtelemalla ja linkoamalla, kuten edellä on kuvattu. Tämä pesutoimitus toistetaan kaikkiaan neljä kertaa ja jäljelle näänyt sidottu 125I-aktiivisuus lasketaan gammalaskimen avulla.

Laskentalukujen (y-arvojen) ja seerumi laimennusten (x-arvojen) perusteella piirretään kaksinkertaiseen logaritmiseen koordinaat ti.-järjestelmään lineaarinen suhde pienimmän etäisyyden periaatteen mukaisesti. Tuntemattomat seerumit voidaan laskentaluvuista määrittää spesifisinä vasta-aineina ja muut allergeeni/seerumi-systeemit voidaan samoin ilmoittaa suhteessa tähän hevoskarva- ja hi lse/poti las-vertai lu-systeemiin.

A'

Claims (2)

10 6031 9

1. Menetelmä vasta-aineiden osoittamiseksi tai määrittämiseksi kehon nesteissä tunnettujen antigeenien avulla tai antigeenien määrittämiseksi tunnettujen vasta-aineiden avulla kehon nesteistä, jolloin kehon nestenäytettä sekoitetaan adsorptioaineen kanssa, johon on adsorboitu antigeeniä, jonka jälkeen antigeeneihin kytketyt vasta-aineet osoitetaan tai määritetään merkittyjen vasta-vasta-aineiden avulla, tunnettu siitä, että adsorptioaineena käytetään alumiini-hydroksidigeeliä ja käytetään sellaista suhdetta kehon nesteen ja antigeeniä sisältävän alumiinihydroksigeeIin määrien välillä, että komponentti, joka halutaan osoittaa tai määrittää, kytkeytyy kvantitatiivisesti, jonka jälkeen alumiinihydroksidigeeli adsorboituneen anti-geeni-vasta-ainekompleksin kanssa eristetään ja kytketään kvantitatiivisesti merkittyihin vasta-vasta-aineisiin, jonka jälkeen antigeeni- vasta-ainekompleksiin kytketyt merkityt vasta-vasta-aineet rekisteröidään ja mitataan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän suorittamiseksi käytettävä väline, tunnettu siitä, että se koostuu alumiinihydroksi gee listä, jolle on adsorboitu määrätty tai määritettävä määrä antigeenejä.